Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập từ cây gạo (bombax malabaricum DC )

XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT s ố
HỢP CHÁT PHÂN LẬP TỪ CÂY GẠO (Bombax Malabaricum DC.)
Phạm Lê Minh*
HDKH: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu^ PGS.TS Nguyễn Thái An^
' bộ môn Hoá Phân tích Độc chất;
^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia;
^Phòng Quản lý Sinh viên - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từkhoả: Bombax malabarỉcum, cây Gạo, HPLC.
Tóm tắt
Từ mẫu vỏ thân cây Gạo dùng nghiên cứu chúng tôi xác định được hàm
lượng của 6 chất nghiên cứu cỏ trong 100 g dược liệu như sau: epỉcatechin là
12,3 mg; catechỉn là 6,7 mg; daucosteroỉ là 1,8 mg; lupeol là 9,4 mg;
stigmasteroỉ là 1,9 mg và friedelin là 7,6 mg. Từ mẫu lá cây Gạo dùng nghiên
cứu chủng tôi xác định được hàm lượng của 7 chất nghiên cứu có trong 100 g lá
Gạo khô như sau mangiferin là 8,1 mg, daucosterol là 1,1 mg, 7ahydroxysitosterol là 0,9 mg, lupeol là 5,7 mg, taraxeryl acetat là 4,1 mg,
stigmasteroỉ là 0,9 mg và taraxerol là 5,1 mg.
Đặt vấn đề
Cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) là cây gỗ cao đến 15 m, có hoa màu
đỏ tươi, được biết đến như là một cây thuốc dân gian tại các nước Pakistan, Ắn
Độ, Trung Quốc, Việt Nam và Châu Phi.
Nghiên cứu với vỏ thân cây Gạo thu hái tại Hà Nội, các tác giả đã phân
lập được một số thành phần như epicatechin [1], catechin, momor-cerebroside I
[2], lupeol, stigmasterol [3], friedelin và daucosterol. Với lá cây Gạo thu hái tại
Hà Nội, chúng tôi đã phân lập được một số thành phần như: mangiferin, lupeol,
taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7a-hydroxysitosterol và daucosterol [4],
Trong khuôn khổ bài báo cáo này, chúng tôi tiếp tục mô tả quá trình nghiên cứu
phương pháp xác định hàm lượng các họp chất đã phân lập được ở trên trong lá
và vỏ thân cây Gạo.
Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu
Hóa chất và thiết bị
- Máy sắc kí lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector

SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700 nm) của Trung
tâm Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội.
- Cột sắc kí Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 ^m) kết hợp bảo vệ cột
Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15 X 30 mm ID).
- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01 mg.


- Hóa chất tinh khiết phân tích; acid formic.
- Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril.
- Các họp chất đã phân lập được từ lá cây Gạo là mangiferin, lupeol, taraxerol,
taraxeryl acetat, stigmasterol, 7a-hydroxysitosterol và daucosterol đã được nhận
dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR.
- Các hợp chất đã phân lập được từ vỏ thân cây Gạo là epicatechin, catechin,
lupeol, stigmasterol, friedelin và daucosterol đã được nhận dạng cấu trúc bằng
các phương pháp phổ MS và NMR.
Mấu nghiên cứu
Mau nghiên cứu là lá và vỏ thân cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái
tại Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS. Trần Huy Thái (Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC.,
họ Gạo (Bombacaceae).
Phương pháp nghiên cứu
- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng
phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất
trong hỗn họp các hợp chất nghiên cứu với nhau và với các họp chất khác trong
cao lỏng vỏ thân và lá cây Gạo.
- Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết
nối.
- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là
các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng

phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng hợp chất trên có trong mẫu vỏ thân và lá
cây Gạo đã thu hái được.
Kết quả và bàn luận
Chuẩn bị mẫu thử
Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn
phương pháp xử lý mẫu tương đối phù họp như sau; cân khoảng 500 g dược liệu
vỏ thân hoặc lá cây Gạo (đã xác định độ ẩm trước) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3
lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, thu dịch chiết, lọc, cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm. Cân cắn toàn phần thu được và bảo quản cắn ở 4°c.
Hiệu suất chiết lá là 4,28% và vỏ thân là 5,4%. Lấy khoảng 0,5000 g cắn, pha
vào bình định mức 25 mL, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45 ịim
trước khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.
Chọn điều kiện sắc kỷ


Cột sắc kí sử dụng là cột Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 ịxm) kết hợp
cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15 X 30 mm ID) ở nhiệt
độ 25°c.
Điều kiện sắc ký với dịch chiết vỏ thân cây Gạo: Sử dụng chế độ gradient
dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid
formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi
tuyến tính đạt đến A-B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A-B
(50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A-B (40:60) ở phút thứ 27 và
cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A-B (30:70) ban đầu ở
phút thứ 30. Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu là 10 fú. Bước sóng
phát hiện là 280 nm (detector SPD-20A).

ị!h

„_IuL a„ì ,

a) ^
^
b)
Hình 1. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất nghiên cứu (a)
và mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo (b)

■ ìi ].•

—r -ĩ,—'i—

b)

ị
lỊ

cj

d)


^

e) ^

Hình 2. Sắc ký đồ của các chất nghiên cứu epicatechin (a), catechin (b),
daucosterol (c), lupeol (d), stigmasterol (e) và friedelin (í)
Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu
được cho các pic tách rõ ràng. Nhiễu nền thấp thể hiện qua sẳc ký đồ của mẫu

thử chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo (hình Ib) và hỗn họp các chất nghiên cứu (hình
la). Trên sắc ký đồ, mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic
epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin lần lượt là
4,370; 5,401; 7,890; 11,380; 17,910 va 21,350 phút (hình 2)
Điều kiện sắc ký với dịch chiết lá cây Gạo: Sử dụng chế độ gradient dung
môi vói kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic
0,1% trong methanol. Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt
đến A-B (35:65) ở phút thứ 10, rồi thay đổi tuyển tính đạt tới A-B (40:60) ở phút
thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính tới A-B (45:55) ở phút thứ 25. Thay đổi
tuyến tính ừở về pha động A-B (40:60) ở phút thứ 27 và thay đổi tuyến tính về
lại tỷ lệ A-B (30:70) ban đầu ở phút tìiứ 30. Tốc độ dòng là 1,0 mL/phút. Thể tích
tiêm mẫu là 10 /xL. Bước sóng phát hiện là 280 nm (detector SPD-20A).

.
....... i i

_,ỉ i l j l
M

a)

ỊỊ

..
,

M

•

b!>

.

^

Jl. -_A
.. u ..ủ-

,

Hình 3. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất nghiên cứu (a)
và mẫu thử chuẩn bị từ lá cây Gạo (b)
Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu
được cho các pic tách rõ ràng. Nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu
thử chuẩn bị từ lá cây Gạo (hình 3b) và hỗn hợp các chất nghiên cứu (hình 3a).
Trên sắc ký đồ, mẫu thử chuẩn bị từ lá Gạo có các pic có thời gian lưu ừìing với
các pic mangiferin, daucosterol, 7a-hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat,
stigmasterol và taraxerol lần lượt là 4,420; 7,124; 9,501; 12,110; 15,190; 18,001
và 25,091 phút (hình 4).


a)

b)

c)

d)

______ _

s--■
e)

Í)

Hình 4. Sắc ký đồ của các chất nghiên cứu mangiferin (a), daucosterol (b),
7a-hydroxysitosterol (c), lupeol (d), taraxeryl acetat (e), stigmasterol (f) và
taraxerol (g)
Xác định độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu
Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch
trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Hàm lượng các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong
chúng sau khi được phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các
họp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích với cột Zorbax
C18 (250 mm; 4,6 mm, 5fim). Pha động sử dụng chế độ gradient như đã xác định
được ở trên. Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 /xL.
Nhận dạng các pic bằng phổ khối lượng. Chế độ đo: ESI+ với tốc độ khí
phun là 3 L/phút, tốc độ khí làm khô là 15 L/phút, nhiệt độ mao quản là 250°c, nhiệt
độ của heat block là 400°c, vùng quét m/z là 100-1000. Thế phá mảnh +4,5 kV.


Các sắc ký đồ ở hình 2 và hình 4 cho thấy các họp chất đều không xuất
hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp
chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lượng các họp
chất phân lập được còn ít và thời gian chưa cho phép, do vậy chúng tôi tạm dùng
chúng như chất đối chiếu để khảo sát phưong pháp định lượng chúng trong lá và
vỏ thân cây Gạo.
Thẩm định phương pháp định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo

Định tính bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời gian lưu của
mẫu thử và hỗn họp chất đối chiếu. Kết quả hoàn toàn phù hợp.
Kiểm tra tỉnh thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được đánh giá qua kết quả tiêm 6 lần
mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn. Kết quả
thu được như ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả khảo sát tính thích hợp
Sô đĩa lý

Hệ sô

thuyết
trung

bất đối

tích pic (%)

bình

trung
bình

0,11

0,12

22320

1,11

Catechin

0,13

0,14

23230

1,05

D aucosterol

0,12

0,15

24550

1,10

Lupeol

0,14

0,21

34660

1,07

Stigm asterol

0,16

0,20

35140

1,04

Friedelin

0,15

0,14

32340

1,12

RSD của thòi

RSD của diện

gian lưu (%)

Epicatechin

Hoạt chất

Các điêu kiện săc ký đã lựa chọn và hệ thông HPLC sử dụng phù hợp và
đảm bảo ổn định của phép phân tích định lượng các hợp chất trên.
Khảo sát khoảng nồng độ tuyển tính
Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của các họp chất như ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
H ọp chất

Nồng độ C

Phưong trình hồi quy

(HgỉmL)

(Diện tích pic S: mAU.s)

Hệ sô
tưong
q uan r

Epicatechin

4,6-45,9

s = 1603,26.C + 0,57

1,0000

Catechin

3,8-38,0

s = 4226,32.C+280.58

0,9999 •

Lupeol

4,5-44,8

s =

2126,83.c + 27,08

1,0000

Friedelin

5,3-42,7

s = 1375,7 5 .C -281,07

0,9999

Stigmasterol

2,4-24,0

s = 1456,32.C -3,05

1,0000

Daucosterol

1,7-34,0

s = 2 1 0 3 ,7 3 .c - 231,97

0,9999


Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các hợp chất xác định được
là epicatechin (0,50 và 1,25 /xg/mL), catechin (0,50 và 1,25 /ig/mL), lupeol (0,61
và 1,43 /ig/mL), friedelin (0,80 và 1,60 /xg/mL), stigmasterol (0,32 và 0,91
/xg/mL) và daucosterol (0,34 và 0,80 ịig/mL).
Khảo sát độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được kiểm tra bằng phương pháp thêm chuẩn
của từng họp chất nghiên cứu vào mẫu thử. Tiến hành với 6 mẫu lấy giá trị trung
bình. Kết quả thu được như ở bảng 3.
Bảng 3. Kết quả kiểm tra độ đúng
Họp chất

Tỷ lệ thu hôi (%)

Nồng độ
thêm vào
mẫu

min-max

Trung bình

(/íg/mL)
Epicatechin

7,34

99,20

9 7,44- 99,84

Catechin

3,04

99,21

96,58 - 101,26

Lupeol

7,17

100,88

99,82 - 101,74

Friedelin

4,27

99,77

95,33 - 102,68

Stigmasterol

1,92

100,61

99,07 - 102,43

Daucosterol

1,36

101,42

9 9,97- 102,19

Các kết quả trên cho phép có thế tiến hành định tính, định lượng 6 hợp
chất này trong vỏ thân cây Gạo bằng HPLC.
Thẩm định phương pháp định lượng các chất trong lá cây Gạo
Định tính bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời gian lưu của
mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu. Kết quả hoàn toàn phù hợp.
Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống
Tính thích họp của hệ thống sắc ký được đánh giá qua kết quả tiêm 6 lần
mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn. Ket quả

thu được như ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả khảo sát tính thích họp
Họp chất

RSD của Ír(%)

RSD của diện
tích pic (%)

Sô đĩa lý
thuyết

Hệ sô
bất đối

Mangiferin

0,15

0,14

32340

1,12

Daucosterol

0,12

0,16

24550

1,10

7 a-hydroxysitosterol

0,14

0,11

43260

1,07

Lupeol

0,14

0,21

34660

1,07

Taraxeryl acetat

0,13

0,14

23230

1,05

Stigmasterol

0,16

0,21

35140

1,04

Taraxerol

0,11

0,12

22320

1,11


Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thổng HPLC sử dụng phù họp và
đảm bảo ổn định của phép phân tích định lượng các họp chất trên.
Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tỉnh
Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của các họp chất như ở bảng 5.

Bảng 5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Họp chất

Nông độ C

PhưoTig trình hồi quy
(Diện tích pic S: mAU.s)

(/íg/mL)

Hệ số tưoTig
quan r

Mangiferin

4,0-48,2

s=4347,28.c-1456,28

0,9997

Daucosterol

1,7-34,0

S=2093,72.C-232,08

0,9999

1,7-34,4

s = 836,28.C-25,24

1,0000

Lupeol

4,5-44,8

s = 2129,05.C-31,34

1,0000

Taraxeryl acetat

6,4-50,9

S=1286,10.C+853,84

0,9995

Stigmasterol

3,6-36,4

s = 959,80.c+17,58

Taraxerol

5,5-55,2

S = 1602,88.C-27,29

1,0000
1,0000

7a-hydroxy
sitosterol

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các họp chất xác định được
là mangiferin (1,67 và 3,35 ịigỉmL), daucosterol (0,34 và 0,80 j^tg/mL), 7ahydroxysitosterol (0,33 và 0,96 ịiglmL), lupeol (0,61 và 1,43 /íg/mL), taraxeryl
acetat (1,80 và 4,07 ỊXglmL), stigmasterol (0,32 và 0,91 Mg/mL) và taraxerol (0,83
và 2,94 ixg/mL).
Khảo sát độ đủng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được kiểm tra bằng phưong pháp thêm chuẩn
của từng hợp chất nghiên cứu vào mẫu thử. Tiến hành với 6 mẫu lấy giá trị trung
bình. Kết quả thu được như ở bảng 6.
Bảng 6. Kết quả kiểm tra độ đúng
Nông độ thêm vào
Họp chất

mâu
(/ig/mL)

Tỷ lệ thu hôi (%)
Trung bình

(min-max)

Marigiferin

6,43

100,69

98,34-102,04

Daucosterol

2,72

101,42

100,58-102,19

7a-

2,75

100,75

100,02-101,76

Lupeol

7,17

100,22

99,54-101,48

Taraxeryl acetat

5,09

100,25

98,85-102,61

Stigmasterol

1,92

101,22

100,28-102,27

Taraxerol

4,42

hydroxysitosterol

100,10
X .-í

chất này trong lá cây Gạo bằng HPLC.

,

99,00-101,84
.


Kết quả xác định hàm lượng một sơ hợp chất trong mẫu lá và vỏ thân cây Gạo
Từ mẫu vỏ thân cây Gạo dùng nghiên cứu chúng tôi xác định được hàm
lượng của 6 chất nghiên cứu có trong 100 g dược liệu như sau: epicatechin là
12,3 mg; catechin là 6,7 mg; daucosterol là 1,8 mg; lupeol là 9,4 mg; stigmasterol
là 1,9 mg và friedelin là 7,6 mg.
Từ mẫu lá cây Gạo dùng nghiên cứu chúng tôi xác định được hàm lượng
của 7 chất nghiên cứu có trong 100 g lá Gạo khô như sau mangiferin là 8,1 mg,
daucosterol là 1,1 mg, 7a-hydroxysitosterol là 0,9 mg, lupeol là 5,7 mg, taraxeryl
acetat là 4,1 mg, stigmasterol là 0,9 mg và taraxerol là 5,1 mg.
Cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về
hàm lượng các chất trên có trong lá và vỏ thân cây Gạo.
Tài liệu tham khảo
1. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An, Phan Văn
Kiệm (2011), Phân lập và nhận dạng epicatechin từ vỏ thân cây Gạo Bombax
malabaricum DC., họ Gạo Bombacaceae, Tạp chí Dược học, 6 (422), tr. 19-20,
44,57.
2. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), Phân
lập catechin và momor-cerebrosid I từ vỏ thân cây gạo (Bombax malabaricum
DC), Tạp chí Dược học, 12 (440), tr. 49-52.
3. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), Phân
lập lupeol và stigmasterol từ vỏ thân cây gạo {Bombax malabarỉcum DC.), Tạp
chí Dược học, 3(443), tr.14-18.
4. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), Kết
quả phân lập và nhận dạng taraxeryl acetat, taraxerol và 7a-hydroxysitosterol từ
lá cây Gạo {Bombax malabaricum DC.), Tạp chỉ Dược học, 4 (444), tr. 28-33.