ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG
PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES
Nguyễn Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh
Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà nội
1, Đại Cồ Việt, Hai Bà trưng Hà nội. Fax: 4 868 2452,
I. MỞ ĐẦU
L. monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với những hậu quả trầm trọng như
sảy thai, thai chết lưu và đẻ non đối với phụ nữ mang thai, gây nhiễm trùng máu và
viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Liều gây nhiễm
của chúng rất thấp chỉ khoảng 102 CFU/g đối với người trưởng thành và 10 CFU/g đối
với trẻ em và phụ nữ mang thai [7, 8, 11, 13, 14, 16 và 17]. Ở các nước phát triển, L.
monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát nghiêm ngặt trong quản lý chất lượng
thực phẩm. Tuy nhiên tại Việt nam, chưa có tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm nào
kiểm soát tác nhân gây bệnh này và vì thế chưa có số liệu nào đề cập tình trạng nhiễm
L. monocytogenes ngay cả đối với các thực phẩm không qua xử lý nhiệt và bảo quản
lạnh dài ngày [1]
Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm
các bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hoá sinh để
khẳng định sự hiện diện của một loài gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày
đến vài tuần [3, 6, 8]. Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên
biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc
sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã
được thiết lập. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến
khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện
nhanh và đặc hiệu mầm bệnh. Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào
khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh
thực phẩm [4, 8 và 11]. Với mục tiêu góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm, trong bài
viết này, chúng tôi trình bày các khảo nghiệm xây dựng quy trình phát hiện nhanh L.
monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F LM-R như một công cụ kiểm
soát loài vi khuẩn nguy hiểm này.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các chủng vi sinh vật
Quy trình phát hiện được xây dựng trên chủng L. monocytogenes 0704 do phòng thí
nghiệm vi sinh vật ENSAT, Trường Đại học Bách khoa Toulouse, Pháp cung cấp. Các
chủng thử nghiệm khác được dẫn ra trong bảng 1.
Hoá chất
Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di trên gel agarose,
thang DNA chuẩn 100 bp và 1000bp do Sigma cung cấp. Các hoá chất sử dụng cho
phản ứng PCR do Amersham Phamacia Biotech cung cấp. Các hoá chất sử dụng cho
phân tích trình tự gen (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, bộ kit tách dòng Topo TA Cloning
Kit, bộ kit tách và tinh sạch plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit) do Invitrogen

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


cung cấp, kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1 do Applied Biosystem cung cấp.
Các hoá chất khác ở độ tinh khiết phân tích.
Mồi cho phản ứng PCR
Dựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên
ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản
phẩm PCR 468 bp [2].
Xác định tính đặc hiệu của mồi
Khả năng bắt cặp chính xác của mồi được khẳng định bằng cách phân tích trình tự sản
phẩm PCR theo phương pháp của Sanger và cộng sự [15] và so sánh với trình tự các
gen đích hlyA của các L. monocytogenes theo phần mềm BLAST. Tính đặc hiệu của
mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn
DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và không phải L. monocytogenes trong phản ứng
PCR.
Phản ứng PCR
DNA khuôn từ L. monocytogenes 0704 được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách
tách và làm sạch DNA với chloroform [4] hoặc xử lý nhiệt tế bào ở 1000C trong 10

phút. Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5
pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 µM/mỗi loại). Phản ứng PCR được thực hiện
với thể tích hỗn hợp 25 µl với chu trình nhiệt gồm 940C - 3 phút, (940C 1 phút, 600C 1
phút, 720C 1 phút) x 30 chu trình, 720C - 5 phút và 40C - 5 phút. Đánh giá kết quả phản
ứng PCR dựa trên phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với 3 µl sản phẩm.
Xác định độ nhạy của phương pháp
Canh trường nuôi qua đêm của L. monocytogenes trên môi trường LEB được định
lượng, pha loãng tới các mật độ thích hợp. Ly tâm thu sinh khối của 1 ml canh trường
hòa tan trong 100 µl TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR. 3 µl dịch tế bào đã
qua xử lý nhiệt được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Đánh giá kết quả phản ứng
PCR nhờ phân tích sản phẩm bằng điện di trên agarose 1%.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tách DNA bộ gen
DNA bộ gen từ L. monocytogenes 0704
được tách và làm sạch dùng làm khuôn
cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn
gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LMFLMR,
Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA
tinh sạch được thể hiện trong hình 1giếng 2 cho thấy một băng DNA có kích
thước nằm trong khoảng kích thước sản
phẩm PCR thiết kế.
Với mục đích thu nhận DNA bản mẫu
cho phản ứng PCR một cách đơn giản
hơn, huyền phù L. monocytogenes được

500bp4
400bp4

Hình 1: Sản phẩm khuyếch đại với
cặp mồi LM-F, LM-R từ khuôn DNA

của L. monocytogenes
Giếng 1: marker DNA 100bp;
Giếng 2: PCR với DNA tinh sạch
Giếng 3: PCR với DNA sau xử lý
nhiệt.
2

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


xử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000
vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR.
Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tách bằng xử lý nhiệt như trên được thể hiện ở
hình 1, giếng 3.
Bảng 1. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm
STT

Tên chủng

Xuất xứ

1.

Listeria monocytogenes 0704

2.
3.
4.
5.

Listeria spp.
Bacillus cereus BC1
Bacillus cereus BC2
Bacillus subtilis FS-2

6.
7.
8.
9.
10.

Salmonella spp.
Salmonella typhi
Staphylococcus aureus
Vibrio cholerae serovar inaba
Vibrio
cholerae
serovar
ogawa
E. coli

Phòng thí nghiệm vi sinh vật, ENSAT, Đại học Bách khoa
Toulouse, Pháp
Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM
Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM
Bảo tàng giống VSV, Viện công nghiệp thực phẩm, Hà nội
Viện công nghệ sinh học - công nghệ thực phẩm, Đại học
Bách khoa, Hà nội
Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội
Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội

Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội
Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội
Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội

11.

Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội

Kết quả trên hình 1 cho thấy, trong cả hai trường hợp sử dụng DNA tinh sạch (giếng 2)
và DNA xử lý nhiệt (giếng 3) đều thu nhận được tín hiệu đoạn khuyếch đại có kích
thước nằm trong khoảng 400-500 bp. Việc tách chiết DNA bộ gen của L.
monocytogenes bằng chloroform phải trải qua nhiều công đoạn, mất thời gian và hoá
chất, trong khi đó, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly DNA làm khuôn cho phản ứng
PCR đơn giản, tốn ít thời gian và rẻ tiền, cho kết quả tương đương. Do vậy, để tiến đến
khả năng áp dụng cho các phân tích thông dụng, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly
khuôn DNA được chọn để thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR.
Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F, LM-R.
Để khẳng định khả năng bắt cặp chính xác
của cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA
của L. monocytogenes, trình tự sản phẩm
PCR của cặp mồi này được xác định và so
sánh với trình tự gen đích hlyA của các L.
monocytogenes.
Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại
bằng cặp mồi LM-F,LM-R được gắn trực
tiếp vào vectơ pCR4 - TOPO. DNA
plasmid chứa sản phẩm PCR được tách
dòng trong E.coli DH5α. Tiến hành tách
chiết và tinh sạch plasmit tái tổ hợp (sử
dụng bộ kit QIA prep Spin Miniprep

Test Kit), kiểm tra sản phẩm trên agarose
1%. Kết quả điện di cho thấy các plasmit
của khuẩn lạc trắng có kích thước lớn hơn
so với đối chứng (không trình bày hình

500 bp „
400 bp „

Hình 2: Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp
bằng Eco RI
1: marker DNA 100 bp
2: sản phẩm PCR
3-6: các plasmid tái tổ hợp cắt với Eco RI

3

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


ảnh điện di). Sản phẩm PCR gắn trong plasmid được kiểm tra bằng cách cắt với EcoRI.
Kết quả xử lý plasmid tái tổ hợp với EcoRI được trình bầy trong hình 2 cho thấy đoạn
DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR. Chúng
tôi tiến hành xác định trình tự sản phẩm này.
Trình tự sản phẩm PCR được xác định bằng thiết bị xác định trình tự tự động ABI 3100
Avant, kết quả trình bày tại bảng 2. Trình tự này được so sánh với trình tự hlyA của các
L. monocytogenes đã được công bố. Kết quả so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch
đại bằng cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 %
với trình tự hlyA của 53 chủng L. Monocytogenes công bố (không trình bày kết quả).
Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R đã thiết kế cho phép nhân chính xác đoạn gen hlyA của
L. monocytogenes.

Bảng 2. Trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi LM-F, LM-R
SEQUENCE

468BP

186A

81C

94G

107T

AAAAGAGAGG

GGTGGCAAAC

GGTATTTGGC

ATTATTAGGT

TAAAAAATGT

AGAAGGAGAG

TGAAACCCAT

GAAAAAAATA

ATGCTAGTTT

TTATTACACT

TATACCAGTT

AGTCTACCAA

TTGCGCAACA

AACTGAAGCA

AAGGATGCAT

CTGCATTCAA

TAAAGAAAAT

TCAATTTCAT

CCATGGCACC

ACCAGCATCT

CCGCCTGCAA

GTCCTAAGAC

GCCAATCGAA

AAGAAACACG

CGATGAAAT

CGATAAGTAT

ATACAAGGAT

TGGATTACAA

TAAAAACAAT

GTATTAGTAT

ACCACGGAGA

TGCAGTGACA

AATGTGCCGC

CAAGAAAAGG

TTACAAAGAT

GGAAATGAAT

ATATTGTTGT

GGAGAAAAAG

AAGAAATCCA

TCAATCAAAA

TAATGCAGAC

ATTCAAGTTG

TGAATGCAAT

TTCGAGCCTA

ACCTATCCAG

GTGCTCTCGT

AAAAGCGA

Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F và LM-R trong việc phát hiện L.
monocytogenes, phản ứng PCR được thực hiện trên các khuôn DNA của các vi khuẩn
khác nhau. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR (hình 3) cho thấy chỉ có giếng 2 có
tín hiệu của băng 468 bp, các giếng còn lại đều thể hiện kết quả PCR âm tính. Như vậy,
cặp mồi LM-F, LM-R có khả năng phát hiện đặc hiệu L. monocytogenes.

468bp„
Hình 3. Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F và LM-R
1. marker DNA 100bp
2. L. monocytogenes 0704
3. Salmonella typhy
4. Salmonella spp.
5. Bacillus cereus BC1

6. Bacillus cereus BC2

7. Bacillus subtilis FS-2
8. Listeria spp.
9. Staphylococus aureus
10. Vibrio cholerae serovar inaba
11. Vibrio cholerae serovar ogawa
12. E. coli
4

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


Xác định điều kiện tối ưu cho PCR.
Nồng độ Mg2+
Phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ cuối cùng của Mg2+ từ 1,5 mM đến 4,0
mM. Kết quả thể hiện trong hình 4 cho thấy phản ứng PCR với nồng độ Mg2+ từ 1,5
mM đã cho kết quả dương tính.
Nồng độ dNTPs
Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ
dNTPs từ 100 µM đến 250 µM. Kết quả được
thể hiện trong hình 5 cho thấy ở nồng độ
dNTPs 100, 150, 200, 250 µM, PCR đều cho
tín hiệu khuyếch đại (giếng 2, 3, 4, 5). Như
vậy, dNTP 100 µM được chọn để thực hiện
phản ứng PCR.
Nồng độ mồi
PCR được thực hiện tại các nồng độ mồi khác
nhau từ 0,1 đến 0,5 pmol. Kết quả được thể
hiện ở hình 6. Chỉ có giếng 5, 6 (hình 7) cho

tín hiệu của vạch 468 bp, tương ứng với PCR
ở nồng độ mồi 0,4 pmol, 0,5 pmol. Vậy nồng
độ 0,4 pmol /mồi có thể chọn cho phản ứng
PCR dương tính.
Như vậy, điều kiện phù hợp cho phản ứng
PCR với quy trình đã chọn để phát hiện L.
monocytogenes với cặp mồi LM-F, LM-R là:
0,4 pmol /mồi; 100 µM dNTPs, Mg2+ 1,5 mM.
Độ nhậy của phương pháp PCR phát hiện
L. Monocytogenes

468bp4

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+
lên phản ứng PCR
1: marker DNA 100 bp;
2: 1,5 mM
5: 3,0 mM
3: 2,0 mM
6: 3,5 mM
4: 2,5 mM
7: 4,0 mM

3468bp

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng
độ dNTPs lên phản ứng PCR
Giếng 1: marker DNA 100 bp;
Giếng 2: 100µM
Giếng 4: 200µM

Giếng 3: 150µM
Giếng 5: 250µM

3468bp

Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ mồi
lên phản ứng PCR
Giếng 1: marker DNA100 bp, Giếng 4: 0,3 pmol;
Giếng 2: 0,1 pmol
Giếng 5: 0,4 pmol;
Giếng 3: 0,2 pmol
Giếng 6: 0,5 pmol.
5

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


Dịch tế bào được xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Pha loãng dịch vi
khuẩn tới các nồng độ khác nhau (bảng 3), xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn. 3
µl dịch sinh khối vi khuẩn sau khi xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết
quả được thể hiện ở hình 7 cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với các mẫu
có mật độ tế bào ≥ 6x102 /phản ứng (giếng 5, 6, 7, 8) tương ứng với mật độ tế bào từ
2.104 CFU/ml.
Bảng 3: Mật độ tế bào của các mẫu kiểm tra độ nhạy phản ứng PCR
Mẫu

1

2

3

4

5

6

7

Mật độ tế bào
(CFU/phản ứng)

6x105

6x104

6x103

6x102

6x 10

6

6.10-1

2x107

2x106

2x105

2x104

2x103

2x102

2x10

+

+

+

+

-

-

Mật độ tế bào
(CFU/ml)
Kết quả PCR

-

Như vậy, phương pháp PCR phát hiện L.

monocytogenes của chúng tôi có độ nhạy
tương đương với kít thương mại BAXTM
của Qualicon. Inc., (104 CFU/ ml) nhưng
nhỏ hơn của Listeria monocytogenes
LightCycler của Roche (103 CFU/ ml). Các
nghiên cứu đang được tiếp tục tiến hành để
nâng cao độ nhạy của phương pháp. Các
khảo nghiệm phân tích vi khuẩn này ở mật
468bp„
độ nhiễm thấp hơn cũng đang được kiểm tra
trên mẫu thực phẩm gây nhiễm nhân tạo.
IV.KẾT LUẬN

Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với
L. monocytogenes, cho phép phát hiện vi
khuẩn gây bệnh L. monocytogenes ở mật độ
6.102 CFU/phản ứng (2. 104CFU/ml). Các
điều kiện PCR được tối ưu hoá nhằm giảm
tối đa chi phí cho phân tích. Đây là nghiên
cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phân tích
L. monocytogenes đầu tiên tại Việt nam.

Hình 7. Sản phẩm PCR theo mật độ tế
bào
Giếng 1: marker DNA100 bp,
Giếng 2: mẫu 7
Giếng 5: mẫu 4
Giếng 3: mẫu 6
Giếng 6: mẫu 3
Giếng 4: mẫu 5 Giếng 7: mẫu 2

Nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài trợ của dự án hợp tác nghiên cứu Vlir HUT AP05\Prj3\Nr01 và một phần bởi đề tài KC 04-30. Các tác giả cám ơn TS.
Piveteau, ENSBANA, Cộng hòa Pháp về việc cung cấp chủng L. monocytogenes và
các cơ quan khác đã cung cấp các chủng VSV thử nghiệm.
SUMMARY
PCR applied in detection of pathogens is one of approaches to overcome the difficulty
of the conventional labor- and time-consuming analysis method used in actual food
borne pathogen analysis. To reach the goal, the study of detection L. monocytogenes by
6

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


PCR using newly desinged primers LM-F, LM-R for the amplicon of 468 bp was
carried out.
The nucleotide sequence of the amplicon was determined and achieved the homogeneity
of more than 98% with hlyA sequence of 53 L. monocytogenes strains published in
Gene bank showing the stringent annealing of the primers with target DNA of L.
monocytogenes. LM-F, LM-R primers were found to be specific for L. monocytogenes
in giving positive result uniquely with DNA from L. monocytogenes but not with any
non-L. monocytogenes. The PCR procedure consisted of 25 µl reaction mixture run with
thermal cycles for the LM-F, LM-R of 940C for 3 min. then 30 cycles of (940C for 1
min., 600C for 1 min., and 720C 1 min.) following by 720C for 5 min. and finally 40 C
for 5 min. PCR was optimized with concentrations of primers of 0,4 pmol /each, of
dNTPs of 100 µM/each and of Mg2+ of 1,5 mM using DNA template released from
heat treated cells of L. monocytogenes in order to lower the cost. The detection limit of
the developed PCR was determined as 6.102 CFU/reaction (equivalent to 2.104/ml). It
was the first study for L. monocytogenes detection by PCR in Vietnam and open
possibility to control and warning the deadly bacterium infection from food and
environment.

The authors express many thanks for the kind gift of L. monocytogenes from Dr.
Lebrihi, ENSAT, France and other species by various institutions. This research was
done under the support of project KC-30 and a grant from the VLIR-HUT cooperative
research program AP05\Prj3\Nr01.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bộ Y tế, Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm năm 1999, 2000, 2001, 2002, 2003.
Nguyễn Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích Listeria
monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn cao học, Đại học Bách khoa Hà nội,
11, 2004.
3. Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục.
4. Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. R., Moore D. D., Seigman J. G., Smith J. A.,
Struhl K. (1995) Short protocols in Molecular biology, 3rd ed.
5. Border, P.M., Howard, J.J., Plastow, G.S. and Siggens, K.W. (1990), “Detection
Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction ”,
Lett. Appl. Microbiol. 11, 158 - 162.
6. FAO (1992), “Chapter 11. Listeria”, in Microbiologycal analysis, 119 - 130.
7. Fsihi, H., Steffen, P. and Cossart, P. (2001), “Listeria monocytogenes”, Principles
of Bacterial Pathogenesis, ed. E.A. Groisman, Academic Press, San Diego, 751 803.
8. Harrigan, Wilkie F. (1998), Laboratory methods in Food microbiology, Academic
Press, 198 - 200.
9. Holko, I., Urbanovas, J., Kantíková, M., Pástorová, K., Kmet, V. (2002), “PCR
detection of Listeria monocytogenes in milk and milk products and differentiation
of suspect isolates ”, Acta Vet. Brno 71, 125 - 131.
10. Johnson, E. A. (2003), “Chapter 2. Bacterial Pathogens and Toxins in Foodborne
Disease”, in Food Safety: Contaminants and Toxins, ed. J. P. F. D’Mello, CAB
International, 25 - 45.
1.
2.

7

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com


11. Lou, Y. and Yousef, A.E. (1999), “Characteristics of Listeria monocytogenes
important to food processors”, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed. E.T.
Ryserand E.H. Marth, Marcel Dekker, Inc., New York, 131 - 224.
12. Olsen J.E., Aabo S., Hill W., Noterman S., Wernars K., Granum P. E., Pôpvic T.,
Rasmussen H. N., Olsvik F. (1995), Probe and polymerase chain reaction for
detection of food-borne bacterial pathogens, Inter. J. Food Microbiol. 28, 1-78.
13. Rocourt, J. and Cossart, P. (1997), “Listeria monocytogene ”, in Food
Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, D.C, 337 352.
14. Ryser, E.T. and Marth, E.H. (1991), Listeria, Listeriosis and Food Safety, Marcel
Dekker, Inc., New York.
15. Sanger et al (1977), “DNA sequencing with Chan termination Inhibitors”,

Academic, Science, USA, Vol. 74, pp.54-62.
16. Slutsker, L. and Schuchat. A. (1999), “Listeriosis in humans”, Listeria, Listeriosis
and Food Safety, ed. E.T. Ryserand E.H. Marth, Marcel Dekker, Inc., New York,
75 - 95.
17. Swaminathan, B. (2001), “Chapter 18. Listeria monocytogenes”, in Food
Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ed. M. P. Doyle, L. R. Beuchat, T. J.
Montville, ASM Press, Washington, D.C, 383 - 409.

8

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com