NGHIÊN cứu ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG IN VITRO của VIÊN NANG AZITHROMYCIN 250 mg

LỜI
ƠN
BỘ YCẢM
TẾ
TRUỒNG ĐẠI HỌC DUƠC HÀ NỘI

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị
Kiêu Anh - Bộ môn Hóa phân tích, người thầy đã tận tình hướng dân, chỉ báo tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện để tài.
TRỊNH MINH QUYẺT

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật
viên
Bộ môn Hóa
phânĐÁNH
tích đã tạo
điềuSINH
kiện tốtKHẢ
nhất đểDỤNG
tôi hoàn IN
thành
khóa luận
NGHIÊN
CỨU
GIÁ
VITRO
tốt nghiệpCỦA
nãy. VIÊN NANG AZITHROMYCIN 250 mg
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHÓA 2003-2008)
Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ KIỀU ANH
hiện:

Phòng
thí nghiêm
trungnhà
tâm,trường,
Bộ mônPhòng
hóa phân
Tôi xin Nơi
trânthực
trọng
cảm
ơn Ban
Giám hiệu
Đàotích
tạo và
Thời gian
thựcthức
hiện:cho tôi trong suốt thờiĩgian ngồi trên ghế nhà
các thầy cô đã truyền
đạt kiêh

Sinh viẽn
Trịnh Minh Quyết
A1K58

HÀ NỘ]ị 5-2008


MUC LUC
Trang
ĐẬT VẤN ĐỂ.................................................................................... . ..............ỉ

PHẦN 1- TỔNG QUAN...................................................................................... 3
1.1................................................... Vài nét về Aỉãthromycỉn -.......................
.................................................. ....................................... 3
1.1.1..........................................................................Công thức..........................
3
1.1.2......................................................................................................................Tính
chất.................................................................................................................3
1.1.3................................................................................................Tác dụng dược lý
.................................................................................................4
1.1.4......................................................................................................................Tác
dụng không mong muốn...............................................................................4
1.1.5.........................................................................................................Chỉ định
.......................................................................................................... 5
1.1.6..................................................................................................................Liều dùng,
cách dùng.................................................................................................... 5
1.1.7...................................................................Dạng bào chế............................

5

1.1.8...................................................................Các phương pháp định lượng.
....................................................................5
1.2...............................................................................................Vài nét vể sinh khả
dụng in vitro......................................................................................... ........7
1.21. Khái niệm...................................................................................................7


Azi

Azithromycin.

EtOH

Ethanol.

HPLc

Sắc ký tỏng hiệu năng cao.

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối.

s
SKD

TB
UV-ViS
STT

2.1.2.
2.1.3.

Độ lệnh chuẩn.
Thiết bị- Dụng cụ.......
DANH
MỤC
CÁC
BẢNG
CHỮ
VIẾT

TẮT
DANH
MUCCÁC
HÌNH
Sinh khá dụng.
Đối tượng nghiên cứu

13
13

Trung bình:

2.1.4. Quang
Phươngphổ
pháp
nghiênkhả
cúu...........................
.............................................14
tử ngoạikiến.
Ký hiệuNội dung nghiên cứu....................................................................................16
Tên bảng
Trang
2.1.5.

1

3

Bảng 2.1 Giá trị mật độ quang của Azi dùng dẫn chất
18

2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.................................................................... 17
Bảng 2.2
20
Giá trị mạt độ quang cua Azi dùng dẫn chất
2.2.1............................................................................................................................ Kh
sau mỗi thời điểm phản ứng
ảo
sát 2.3
và lựaKết
chọn
kiện
lượng....................................................................
Bảng
quảđiều
khảo
sátđịnh
khoảng
nồng độ tuyến tính
21

4

17
Bảng
2:4

5

Bảng 2.5
độ tích...............

đúng
24
2.1.2.
Đánh giá phươngKhảo
pháp sát
phân
. .............................................21
Bảng 2.6
25
Phần trăm giải phóng hoạt chất Azi của chế

2

6

Kết qua khảo sát đô ]ăp Ịaị

23

phẩm A ở môi trường pH 6,8
7

Bảng 2.7

Phần trăm giải phóng hoạt chất Azi của chế

26

phẩm A ở mồi trường pH 4,5

8

Bảng 2=8Phin trâm giải phóng hoạt chất ầú sủa chế

27

phẩm A ở môi trường pH 1,2

9

Bảng 2.9

10

Bảng 2.10

Kết quả % giải phóng hoat chất của các chế

27

phẩm trong mòì trường pH 6,8
Kết quả % giải phóng hoạt chất của các chế

28

phẩm trong mòi trường pH 4,5

11

Bảng 2:11

Kết quả % giải phổng hoạt chất sủa sấe shế

29

phẩm trong mồi trường pH 1,2
12

STT

Bảng 2.12

Ký hiệu

1

Hình 1.1

2

Hình 2.1

So sánh SKD i n vitro giữa chế phẩm thử và
chế phẩm dối chiếu
Nội dung
Sơ đồ giải phóng dược chất từ viên nang

Phổ hấp thụ cúa dung dịch Azi được dẫn chất bàng

30

Trang
10
18

acid sulfuric
3

Hình 2.2

Đỗ thị biểu thị sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng
độ acid sulíuric đùng dẫn chất

19


4

Hình 2.3

Đổ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang

20

vào thời gian phản ứng
5

Hình 2.4

Đồ thị biểu diễn sư phụ thuộc tuyến tính giữa độ

21

hấp thụ và nồng độ của Azi
6 Hình 2.5

ĐỒ thị biểu diễn % giải phóng Azi của 4 chế phấm

28

tron® mỏi trường pH 6,8
7 Hình 2.6

8 Hình 2.7

Đổ thị biểu diễn % giải phóng Azi của 4 chế phẩm
trong môi trường pH 4,5
Đồ thị biểu diễn % giải phóng Azi của 4 chế phẩm
trong mối trường pH 1,2

29

30


ĐẶT VẤN ĐỂ

Azithromycin là một kháng sinh macrohđ bán tổng hợp. Thuốc có hiệu quả
điều

trị

nhiều

pneumonỉae,

ỉoại

vi

khuán

Mycopĩasma

như

Hemophỉhis

pneumoniae,

inýỉuemae,
Staphyỉococus

Sírepíococus
aureus,

Mycobacterium avium, nên được sử dụng rộng rãi để điểu trị các bệnh nhiễm
trùng hỏ hấp, nhiễm trùng da, đường tiẽụ hóa và các bệnh nhiêm khuẩn gây bởi
chủng vi khuẩn kháng penicillin. Đặc biệt thuốc tồn tại trong cơ thể khá lâu, cho
phép dùng liều llần/ngày vả rút ngán liêu trình điéu tri đối với phán lớn các
nhiễm trùng.

Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại chế phẩm có cùng một loại dược
chất do các hãng khác nhau sản xuất, có tác dụng giống nhau nhimg giá cả của
các chế phẩm sản xuất trong nước thấp hơn nhiều so với các chế phẩm ngoại
nhập. Ví dụ ở cùng một hàm lượng, chế phẩm Azithromycin của hãng Pfizer đắt
hơn gấp khoảng 30 lần so với thuốc cùng loại do các hãng trong nước sản xuất.
Vì vậy, cần phải đánh giá các thuốc sản xuất trong nước và thuốc sản xuất nước
ngoài cỏ tương đương sinh học không để khẳng định chất híựng thuốc sản xuất
trong nước và tạo niềm tin cho người tiêu dung yên tâm dùng sản phắm do các
hãng trong nước sản xuất, tránh lãng phí không cần thiết. Việc tiến hành đánh giá
tương đuơng sinh học gồm hai giai đoạn là thử in vitro và thử in Vỉ vo. Thử
nghiệm in vitro được tiến hành trước nhằm định hướng, sàng lọc cho bước thử in
vivo ở giai đoạn tiếp theo.

1


Để gop phẩn nâng cao chất lượng thuốc sản xuất trong nước, chúng tôi tiến
hành đề tài “Nghiên cứu đánh giá SKD in vỉtro của viên nang Azithromycin” với
các mục tiêu sau:
- Xây dưng mô hình đánh giá sinh khả dụng in vitro của viên nang
Azithromycin 250mg.
- Đánh giấ khả năng giai phóng hoat chất trong 3 môi trường mô phỏng dịch
dường tiêu hóa cua một sô' chế phẩm viên Azithromycin 250 mg sản xuất trong

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1.

VÀI NÉT VỂ AZITHROMYCIN

H3C

Công thức phân tử: C3SH72N20p
Khối lượng phân từ: 748,98.
Tên khoa học: N-methyỉ“l l-axa-lO-deoxo-lO-dihydroerythromycin A
7.7.2. Tính chất [5,13,16,17]
• Tính chất vật Lý
- Bột màu trắng, rất ít tan trong nước, dẻ tan trong cổn tuyệt đổi, và
dicloiomethan.
- Dung dịch 0,2 % Azithromycĩn trong hỗn hợp methânol: nước (1:1)

3


•

Tính chất hoá học:
- Tính base: do các osamin (đường amin) mang lại, pKa =8,74.
- Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ.
- Phản ứng màu: VỚI các acid (HCỈ, H2S04)

1.1.3.

Tác dụng dược lý [4,16]
•

Đặc tính dược lực học

Azithromycin là một kháng sinh mới cổ hoạt phổ rông thuộc nhóm
macrolid, được gọi là azalid. Azi có tác dụng tốt trẽn các vi khuẩn Gram (+) (như

Strepíococcus,

Pneumococcus,

Staphyỉococcus

aureus...)

và

Gram

(-)

(như

Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae...).

Azi có tác dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherỉchia coỉy, Salmoneiỉa
enterìtìs, Salmoneỉỉa typhỉ, Kỉebsieỉỉa.
• Cơ chế tác dụng:
Azỉ gắn với rĩbosom 50s của vi khuẩn gây bệnh, ngàn cản quá trình tổng
hợp protein của chúng.
•

Đặc tính dược động học

Azi sau khi uống, phân bố rộng rãi trong cơ thể. Thức ăn làm giảm hấp thu

4


- Azi được dung nạp tốt, và tỷ lệ tác dụng khống mong muốn thấp. Hay
gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10 %) với các triệu chứng như buổn
nôn, đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhưng thường nhẹ và ít
xảy ra hơn so với erythromycin.
- Anh hưởng thính giác: Sử dung lâu dài ở liều cao Azi có thể làm giảm
sức nghe có hổi phục ỏ một số người bệnh.

1.L5. Chỉ định [4,16]
Azi được chỉ định dùng trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn
nhạy cảm với thuốc như nhiễm khuẩn dường hô hấp dưới (viêm phổi, viêm phế
quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đường hô hấp trên (viêm
xoang, vicm họng và viôm amidan), nhiễm khuẩn đương sinh dục chưa biến
chứng do Chỉamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae không đa kháng.

1.1.6.

Liêu dùng và cách dùng [4]

- Dùng 1 lân mỗi ngày, uống 1 giờ trước bữa ãn hoặc 2 giờ sau khi ăn.
- Người lớn: ngày đầu uống ỉ liều 500 mg, và dùng 4 ngày nữa với liều
đơn 250 mg/ngày.
- Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ ngày đầu là 10 mg/kg thể trọng và tiếp theo là
5 mg/kg mỗi ngày, từ ngày thư 2 đến ngày thứ 5 uống 1 lần mỗi ngày.

1.1.7.

Dạng bào chế[3]

- Viên nang azithromycin diliyđrat tương đương azithromycin 250 mg và

5


1.1.8.

L Phương pháp vi sinh vật [6,15]

Khuyếch tán trên thạch, nuôi cấy và chế tạo nhũ dịch, đo đường kính vòng
vô khuẩn. Có thể định lượng dùng chùng vi khuẩn chỉ thị:
BaciUuspumilus NCTC (B) 63202.

Baciỉlus pumilus NCTC 8241.

Micrococcus hiteus ATCC 9341.
ững dụng: Định lượng Azi trong viên nang, viên nén, hổn dịch uống.
l.x.8.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơr điện hóa [17]
Định lượng theo chương trinh sau:
Cột L29 (5 mm X 4,6 cm X 5 ỊJ.m).
Detector điện hoá.
Pha động: 5,8 g KH2P04 trong 2130 ml nước và 870 ml acetonitril, Điều
chỉnh pH tới 11 bằng dung dịch KOH.
ứng dụng; định lượng Ạzị trọng viện nangi hỗn dịch uống.

1.1.8.3. Phương pháp HPLC vói detector uv
Định lượng Azi bàng HPLC với chương trình sau:

•

Điểu kiện sắc ký 1 [111
Cột: Lichrosorb RPS ( 250 mm X 4 mm X 5 pm)

6


Detector UV: 215 nm
Pha động: đệm phosphat’ acetonitril- methanol ( 35:45:20), điểu chính
tới pH=8 bằng amoniac hay acid phosphoric.
Dung dich chuẩn và dung dịch thử được pha ở nồng dộ 2 mg/ml trong
pha động,
1.1.8.4. Định lượng Azithromycin hằng phương pháp tạo cặp lon- chiết đo
quang [10]
Thuốc thử: dung dịch lục bromocresol CT2.
Môi trường tạo cặp ion: dung dịch đệm acetal pH 4,5
Dung mối chiết: CHC13
Khoảng nồng độ Azi 5- 20 pg/ml
ứng dụng: định lượng Azi trong viên nén, viên nang, bột thuốc tiêm.
12. VÀI NÉT VỀ SINH KHẢ DỤNG IN VITRO [8, 9,12]

1.2.1.

Khái niệm [8]
Sinh khả đụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ
dạng thuốc.

ỉ.2.2. Phương pháp thử [9]
- Thiết bị: máy thử độ hoà tan.

7


- Thời gian thử: Thường từ 30-60 phút (đối với dạng bào chế quy ước)
với lượng dược chất hoà tan nằm trong giới hạn 70- 80%.
- Tốc độ khuấy: Thường là 100 vòng/phút.
- Phương pháp định lượng: Tùy vào đặc tính cùa dược chất có thể dùng
cấc phượng pháp khác nhau, thường dùng phương pháp đo quang phổ
hấp thụ ƯV-VIS, HPLC.

1.2.3.

Ý nghĩa của sinh khả dụng in vitro [8]

- SKD ìn vìtro là công cụ kiểm soát chất lượng các dạng thuốc rắn để uống
(viên nén, viên nang, pellet...), đặc biệt là đảm bảo sự đồng nhất giữa các lô mẻ
sản xuất, giữa các nhà sản xuất.
- SKD in vitro dùng để sàng lọc, định hướng cho đánh giá SKD in vivo:
Việc đánh giá SKD in vivo rất đắt tiền, tốn kém, không thể làm tràn lan do dớ
trước hết phải dùng SKD in vitro sàng lọc, định hướng cho việc thử in vivo để
giảm bớt chi phí, thòi gian.
- SKD ìn viíro dùng thay thế cho SKD in vivo trong trưòng hợp đã chứng
minh được có sự tương quan đồng biến giữa SKD in viiro và in VỈVO với điều kiện
cồng thức và qui trình sản xuất không thay đổi. Thực ra do tốn kém nỂn SKD in
vìvo chỉ được dánh giá một lần khi lập hồ sơ xin phép sản xuất. Từ đó về sau phai
dùng SKD in vi tro để kiểm soát quá trình sản xuất, đảm bảo tính ổn định cho
SKD ỉn vịyọ.
- SKD in vitro là công cụ cơ bản để xây dựng công thức, thiết kế dạng
thuốc trên cơ sở coi tỷ ]ệ hoà tan dược chất là thông số chất lượng của đẩu ra, từ

8


1

nhanh, nhưng chưa chốc đã được hấp Ihu tốt. Tuy SKD in viiro IĨ1Ô phỏng một số
điều kiện sinh học nhưng còn khác xa với điều kiện thực tế trên cơ thể sống.
1.3.

VÀI NÉT VỂ Sự HÒA TAN [8,12]
Hòa tan là quá trình chất rắn tan trong môi trường dung môi để tạo thành

dung dịch.
Muốn được hấp thu, dược chất phải được hòa tan tại vùng hấp thu. Như
vây sự hòa tan phụ thuộc hai ỵếu tố: quá trình giải phóng dươc chất từ dạng thuốc
và đặc điểm môi trưòng hòa tan. Nếu bước giải phóng không hạn chế hòa tan thì
sự hấp thu tiếp theo chủ yếu phụ thuộc vào độ hòa tan của dược chất.
Với dược chất ít tan: trẽn thực tế, các dược chất ít tan thường được đưa vào
các dạng thuốc rắn là những dang thuốc hay có vấn đề về giải phóng. Do đó, với
các dạng thuốc này, bước hòa tan thường là bước hạn chế quá trình hấp thu.
Trong trường hợp này, nhà bào chế phải có các giải pháp làm tăng dộ hòa tan và
tốc độ hòa tan cùa dược chất để đảm bảo cho hấp thu như dùng chất làm tăng độ
tan, dùng hỗn hợp dung môi, chế hệ phân tán rắn.
Với dược chất dễ tan: nếu dược chất đễ tan được giải phóng nhanh và dễ
hấp thu thì dễ gây tác dụng không mong muốn. Trong trường hợp này phải làm
châm hấp thư bằng cách kéo dài giải phóng như tãng độ nhớt môi trường khuếch
tán (với dạng thuốc lỏng như siro, hỗn dịch...), kéo dài thòi gian rã, bao màng
kiểm soát giải phóng (với dạng thuốc rắn như viên nén, viên nang...) [12].
Tốc độ hòa tan của được biểu diễn theo phương trình Noyes - Whitney

được biểu thị như sau [10]
— = K.A.(CS - C)

9


K : hằng số tốc độ hòa tan.
A : diện tích bể mặt tiếp xúc của dược chất với môi trường hòa tan.

Cs: nồng độ bão hoà của dược chất,
c : nồng độ dược chất tại thời điểm t.
Trong cơ thể, hòa tan và hấp thu là một quá trinh đông. Khi dược chất vừa
được hòa tan thì được hấp thu ngay, làm cho hiêu số Cs — c luôn tồn tại, do đó
làm chữ quá trình hòa tan diễn ra liên tục.

Quá trình hòa tan cửa viên nang [12]

Hình ỉ.ỉ: Sơ đổ giải phóng dược chất ỉửviên nang

1.4.

VÀI NÉT VỂ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẨP THỤ UV-VIS d, 2}

10


Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ I() qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ c, bồ dày lớp dung dịch là 1. Khi đi qua dung dịch,
một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần ánh sáng bị phản xạ, phần còn lại (I) di
qua dung dịchĐinh luật được biểu hiên bàng biểu thức sau:

A =lg - = e , l . c
Trong đó:

Ầ : Đọ hấp thụ.
I0 : Cường đò ánh sáng đơn sắc tới.
I : Cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch.
£

: hệ số hấp thụ phân tử phụ thuộc vào bàn Chat của dung dịch,

bước sóng của chùm tia đơn sắc.
1

: độ dày lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua (cm).

c : nồng dộ chất lìghiêh cứu (rhol/l).

1.4.2.

Điều kiện áp dụng định luật Lamhert- fìeer:

- Thiết bị phải có khả năng tạo ra chùm tia có đệ đơn sắc nhất định. Độ
đơn sắc càng cao càng tốt.
-

Chất thử phải bền trong dung dịch và bễn dưới tác dung của tia UV-VIS.
- Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp.

- Điiiĩg dịch phải trông suốt để hận chê tối đã cắc hiện tượng quãng hộc
khác,

11


pháp so sánh, phương pháp dường chuẩn, phương pháp thêm chuẩn. Trong phạm
vi đề tàí này, chúng tôi trình bày phương pháp đường chuẩn, phương pháp so
sánh.
- Phương pháp đường chuẩn
Chuẩn bị một dãy chuẩn khoảng 5 đung dịch có các nồng độ chất chuẩn cs
khác nhau. Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn
quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ các dung dịch chuẩn.
Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch thử, dựa vào đường chuẩn ta xác định dược
Eổng độ mẫu thu cx.
Để han chế sai số, nổng độ các dung dịch thử phải nằm trong khoảng nồng
độ của dẫy chuẩn.
- Phương pháp so sánh:
Theo định luật Lambert-Beer, sau khi đo độ hấp thự của dung dịch chuẩn so
sánh (S) và dưng dịch mẫu thử (X) ta có:
As= K .L, .Cs
AX=K .L ,cx

Nổng độ của dung dịch thử cx và dung dịch chuẩn cs không được chênh lệch
nhau nhiều quá. Các nồng độ này càng gần nhau, kết quả càng chính xác.

12


PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VẢ KẾT QUẢ

2.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1,

ỉ. Hóa chất - Thuốc thử - Chất chuẩn
- Chất đối chiếu azithromycin: 100,0 % (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung
ương).

- Ethanol tuyệt đối: PA - Trung Quốc.
- Kãli clôriổ: PÂ — Merck (Đốc).
- Dinatri hyđrophosphat: PA - Trung Quốc.
- Natri acetat: PA - Trung Quốc.
- Acid sulfuric 98 % : PA “ Trung Quốc.
- Acid acetic băng: PA - Trung Quô*c.
- Acid hydrocloric: PA — Trung Quốc.

- Pâncrẽâtin: PA - Mẽfsfe (Đức).

2.2.2.

Thiết bị - Dụng cụ

- Máy thử độ hoà tan Varian 705 - DS (Mỹ).
- Máy đo phổ hấp thụ Shimadzu ỤV- Mini - 1240 (Nhật).
- Máy đo pH: 632pH- meter Metrohm (Thụy sỹ).
" Cân phân tích Sartorius (Đức).

13

- Azithromycin 250 mg của Traphaco, SDK: VNB-2357-04; số lô:
01/160506; Hạn dùng: 05/2009, (ChếPhẩm B).
- Azithromycin của Naphaco, SDK: VNB-2709-05; số lô: 06102; hạn dùng:
12/2009, (Chế phẩm C).
■* Chế phẩm đối chiếu: viên nang Mybrucin 250mg của hãng Brawn- Ấn Độ;
SDK: VN-2128-06; số lô: BC Ữ18Q01; hạn dùng: 12/2010, (Chế phẩm D).

2,1.4,

Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu để thu được
độ hấp thụ lớn nhất khỉ đo quang. Từ đó tiến hành xác đinh khả năng giải phóng
hoạt chất bằng máy thử độ hoà tan ở 3 môi trường, thu thập số liệu và xử lý thống
kê để đánh giá kết quả.
• Phương pháp đánh giá đõ hòa tan:
4 Thiết
-

bị: máy thử độ hòa tan 6 cốc, cánh khuấy.

+ Môi trường: dung dịch đệm pH 1,2; 4,5 và 6,8.
- Dung dịch đệm pH 1,2: Cân 3,73 g KC1 hòa tan trong 900 ml
nước cất, điều chính đến pH 1,2 bằng HC1 1 N, thêm nước vừa đủ 1000 ml, thêm
0,1 g pàncreatin, khuấy đều.
- Dung dịch đệm pH 4,5: Cân 1,80 g CH^COONa. hòa tan trong
900 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 4,5 bằng acid acetic 2 N, thêm nước vừa đủ
1000 mỉ, thêm 0,lg pancreatin, khuấy đều.
- Dung dịch đệm pH 6,8: cân 6,88 g Na 2P04 hòa tan trong 900 ml

14


+ Cách định lượng: lấy chính xác 5,0 ml dung dịch Azi + 5,0 ml dung
dịch acíd sulluric, sau một thời gian phản ứng đem đo quang ở bước sóng cực
đại.
+ Tính kết quả: Hàm lượng Azi được tính dựa vào phương trình hồi quy
xây dựng từ chất chuẩn Azi trong từng ngày phân tích:
y — bx + a
Từ đó tính X = (y-a)/b
Trong đó: y là mật độ quang do dược

X : nỏng độ Azithromycin
* Phản tích sỏ Bệu thực nghiệm
+ Các đặc trung thống kê để xử ìý kết quả phân tích
1"
- Gỉá trị trung bình X - YJC,
-

ntr

- Độ lệch chuẩn:

s—]

- Độ lệch chuẩn tương đối:

lĩõ^ữ
----------RSD {%) = Ậ. 100

JC

- Khoảng tin cây :

~ts

ụ=x±-Ỵ=r = x±e

yJN
với độ tin cậy p = 0,95
s: sai số tương đối.

15


Tính hệ số tương đồng ĩ2 theo công thức sau:
f2 =5ữỉ!ôg<
Trong dó:

|+(1/«)Í( Ri-Tiy
(=]

n: số điểm xác định % hoạt chất giải phóng
Rt : độ hòa tan trung bình của chế phẩm chuẩn (12 viên) tại mỗi

thời điểm

Tt : độ hòa tan trung bình của chế phẩm thử (12 viên) tại mỗi thời

điểm.

Hai chế phẩm có SKD in vitro tương đồng nhau nếu f2 lởn hơn 50.

2.1.5.

Nội dung nghiên cứu

• Khảo sát và lựa chọn phương pháp phãn tích:

-

- Thuốc thử dẫn chất hóa: bản chất, nồng độ, lượng thuốc thử.
Đánh giá phương pháp phân tích:

-

Khoảng nồng đô tuyến tính

-

Độ ỉập lại của phương pháp.

-

Độ đúng của phương pháp.

-

Đánh giá sinh khả dụng ỉn vitro trong 3 môi trường mô phỏng dịch đường
tiêu hóa của 3 chế phẩm viện Azị trọng nựớc so VỚỊ chế phẩm đối chiếu cùng

16


D

Nồng độ acid sulíuric (% kl/tt)
60

Lầnl

65

70

75

80

0,2915

0,3632

0,4781

0,4332

0,4294

Lần 2

0,2749

0,3781

0,4525

0,4136

0,4191

Lần 3

0,3082 - Quét
0,4435
0,4794
phổ ở khoảng
bước sóng04524
từ 400 - 6000,4366
nm, từ đó xác định được bước
2.2.
KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
0,3177sóng hấp
0,4136
0,4485
thụ cực đại0,4593
(Ằ max). Kết quả
được trình0,4452
bày ò bảng 2.1, hình 2.1; hình

Lần 4

Lần 5
TB
RSD(%)

0,3301

0,3764

2.2.

0,4505

0,4451

0,3005
0,3988
0,4639
0,4386
2.2-7. Khảo sát rà lựa chọn điều kiện định ỉưỢìĩg.
5,73
4,84
2,99
3,59

0,4445
0,4350
2,52

2.2.1.1. Khảo sát và ỉựa chọn thuốc thử dẫn chất hóa.
Azithromvcin là một macrolid có khả nâng cho phản ứng màu với các thuốc

thử xanthyldrol, p-dimethylamino benzaldehyd, acid sulíuric đậm đặc, tạo sản
phẩm cố đặc tính hấp thụ quang học. Dựa vào điều kiện thực tế và kết quả khảo
sát, chung tôi chọn acid sulíuric làm thuốc thử cho phản ứng tạo màu với Azi,
sau đó đem đo quang để xác định nồng độ của Azi400 420

440

460 480

500

520

540

560

580

600

VVavelength(nm)
* Chuẩn
dung
Hình
2.1:bị
Phổ
hấpdịch.
thụ của dung dịch
Azi dược dẩn chất bằngacid suỉỷuric

2.1 :Kểt
quả giãpH
trị mật
quang
dẫnPƠ
chấthoà
Azi tan
phụ trong
thuộc 150 ml
-Dung Bảng
dịch đệm
phosphaí
ố,0:độ
Cân
7,18của
g Na
2
4
nước, điều chỉnh pH đến 6,0 bàng dung dịch HCt, thêm 0,015 g pancreatin, ưộn
vào nồng độ thuốc thử.
đều.
-Dung dịch chuẩn Azi: Cân chính xác khoảng 20 mg chất chuẩn Azi cho
vàọ bình đinh mức 1ỌỌ mỊ, thêm khoảng 2,5 mỊ EtỌH, Ịắc kỹ chọ tan hệt, thêm
-Dung dịch acid sulluric các nồng độ: 60, 65, 70, 75, 80 % (kl/kl).
• / ìên

năn ứng:

- Cho 5,0 ml dung dịch chuẩn nồng độ 50 Ịug/ml vào ống nghiêm 10 mỉ
nắp xoáy, thêm 5,0 ml dung dịch acid sulfuric, lắc kỹ. Để 30 phút ồ nhiệt độ

phòng. Mỗi nồng độ acid sulfuric làm 2 mẫu.
- Song song làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.

18
17


Thời gian (phút)

Mẫu 1

Mãu 2

TB

5

0,4062

0,3947

0,4005

10

0,3687

0,4823

0,4255

15

0,4951

0,5035

0,4993

20

0,5435
0,5571
0,5503
Bảng
2.2:
Kếtkết
quả
giá
trị cho
mật
độ
quang
của
dẫn
chấtphản
Azi
phụ
gian
Độ

đúng
của
phương
pháp
đuợc
đánh
giá
bằng
phương
pháp
thẽm
chuẩn.
Nhận
xét:
Kết
quả
trên
thấy
khi
tiến
hành
ứngthuộc
tạo vàữ
màu
với
thời
Nhận
xét:
Từ
quả

thu
được
cho
thấy
thấy
trong
khoảng
nồng
độ thời
khảo
sát

25

0,5126
0,4919
0,5021
phán
ứng
Thèm
iượng
chính
xác thu
chất
chuẩn
vào
một
mẫu
thử
đãđộ

biết
nồng
độ,
gian
ỉà một
20
phút,
hấp
được
là tương
lớn
nhất,
nên chúng
tôi
lựa
chọn
thời gian
từ
25-75
pg/ml
cóđộ
sự
phụ thụ
thuộc
tuyến
tính
đối lượng
chặt
chè
giũa

mật
quang
30
0,4754
0,4965
0,4860
sao cho
tổng
độ20
của
chứng
trong
khoảng
phản
ứng
tạonồng
mau là
phút
chonằm
các nghiên
cứu tiếpnồng
theo.độ đã khảo sát.
hệ số tương
quan hồi quy0,4863
rất gần 1 35và nồng độ Azi với 0,4823
0,4904
Tiến hành định lượng như mô tả ở mục 2.1.5. Kết quả được trình bày ở bảng 2.5.
40
0,4857
0,48012.5:Kết quả

0,4829
khảo phấp.
sát tỉnh đúng.
2.2.2.2.
Khảo sát Báng
độ lặp lại của phương
2.2.2.
Đánh giá 0,4905
phương pháp phân
tích.
45
0,4931
0,4918
2.2.2.1.Khảo
sát hành
độ tuyến
tính
Tiến
khảo
sát
độ lặp lại của
phương pháp bằng cách chuẩn bị các đung
50
0,4865
0,4818
0,4841
địch Azi ở 5 nồng độ từ 25 - 75 Ịig/ml. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá
25,0 sát sự phụ
37,5thuộc tuyến
50,0tính của độ

62,5
75,0
Kháo
hấp thụ vào
nồng độ Azi bằng cách
Nồng độ
dựa trên việc khảo sát độ lặp lại của 5 thí nghiệm song song tại mỗi nồng độ.
(Ịtg/ml) chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn Azi có nồng độ biến thiên trong khoảng 25 - 75
Mật dỗ quang
0,2271
ỡ,3594
0,4726
0,6874
0,7052
pg/ml,Phương
Tiến hành
làm
phản
ứng
tạo
màu
rổi
đo
quang
theo
chỉ dẫn ở mục 2.1.5.
Bángy=
2.4;
Kết quả0,0033
khảo sát độ lặp lại

trình hổi quy:
0,0095xHệ số quan
tươnggiữa
quanmật
: r =0,9996
Xác lập mối tương
độ quang và nồng độ Azi biểu thị bằng phương
STT
Nồng
độ
(ptg/ml)
Hình 2.2. :ĐÔ thị biểu thị sự phụ thuộc mật độ quang vào
2.3:
Kết quả
khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
trinh hồi quy vàBảng
hệ sô'
tương
quan.
nồng
độ acid suỊỷuric
25,0
37,5
50,0
62,5
75,0
Nhận xét; Từ kết quả trôn, nhận thấy acid sulíuric 70 % (kl/tt) cho Uộ hấp
1
0,2292
0,3577

0,4791
0,5854
0,6836
thụ lớn nhít nên chúng tôi quyết định chọn nồng độ này để lảm phán úng tạo

2

0.2275

3
4
5
Trung bình

0,3591

0.4585

0,5856

0,7054

mầu cho các giai đoan sau.
0,2224
0,3455
0,4654 0,5828
0,6953
2.2.1.2.Khảo sát và lựa chọn thời gian phản ứng:
0,2459
0,3756

0,5029
0,6104
0,7254
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy phương phấp có độ đúng khá cao,
Chuẩn bị các
mẫu như0,4658
trên với0,5784
nồng độ H 2S04 0,694
70 %.ỉ Tiến hãnh làm phán
0,2374
0,3568
tỷ lệ thu hổi Azi đều xấp xỉ 100 %.
ứng 0,2325
như mô tả 0,3589
ở mục 2.1.5,
sau thời điểm
5, 10, 15,
20, 25, 30, 35, 40, 45, 50
0,4734
0,5885
0,6986

đem
mật
độờquang
ở bước
482 nm.
RSD(%) phút
3,97Từ
3,01

2,14
cácđokết
quả
trên, 3,71
cho
thấysóng
phương
pháp định2,48
lượng Azi mà chúng tôi
STT

1

xằy đựng
cố
đứng
khấ
cao, Lượng
độ ìậpchuẩn
ỉậi khấ lốt,
lính khá rộng fìôn
LượngNhận
cânđộxét:
Tỷthấy
lệkhsẩng
tìmở cáctuyến
Lượng
chuẩn
Từ các
kết qua

ở bảng 2.4 cho
mức nổng độ khác nhau
việcthử
áp(mg)
dụng
phương
pháp
trong
việc
địnhlạilượng
trong
nghiên cứu
0 Đồ
-I----------—
-----■——-———
-------------.
tìm
lạiphụ
được
(%) độAzi
thèm
vào
Hìnhtuyến
2.3:
thị
biểunày
diễn
sự
thuộc
mật

vàocác
trong khoảng
có
RSD
dưới
4 %của
tỏquang
phương
pháp có độ lặp
t chứng
0 tính đều 2D
40
60
SO
tiếp theo là đáng tin (mg)
cậy.
(rag)
G
thời
gian phân ứng
lại khá tốt,
30,5
12,6
12,37
100,35
- -----------------------------—----------------------------(ng/ml)---

2

29,9 sát độ đúng:

12,2
2.2.23. Khảo

3
4
5

12,41

101,72

30,0Đánh giá khả
12,2
12,14
99,51
2.2.3.
nấng giải phóng
hoạt chất trong
môi trướng hòa tan.
Hình 2.4: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyên tính giữa mật độ quang
29,1
13,1
12,97
99,29
29,2

12,6

Giá trị trung bình X
RSD (%)

12,61

100,11
2í
19
22
23
20

100,19
0,95


% Azi giải phóng tại các thời điểm so với hàm lượng ghi trên
Viên

nhãn
10 phút

1

65,6

15 phút
74,8

20 phút
90,3

25 phút
96,4

30 phút50 phút
98,6

106,1

2

94,0 tả ở mục
99,4 2,1.5; lấy
105,2mẫu ở108,1
1,2; pH61.8
4,5 và pH78,5
6,8 như mô
các thời điểm 10 phút,

3

76,9 25
91,9
1561,4
phút, 20 phút,
30trăm
phút,
50giải
phút
để 99,6
theo

dõi 104,8
khả
năng
Bàng
2.7:phút,
Phần
Aĩi95,8
phóng
của chế
phẩm
A ở giải phóng hoạt

4

61,9
76,0
chất
cùa chế phẩm.

5

2.2.3.1. Đối với chế phẩm A

64,6

6

74,2

87,4

91,6
99,4
môi trường pH 4,5
92,1
96,6
97,9

97,9
104,9

62,7

8

79,0
90,7
101,1
103,8
107,0
Tiến hành như trong mục 2.1.5. Kết quả dược trình bày ở bảng 2.6; 2.7 và 2.8
67,8
77,1
92,4
96,9
96,3
106,4
Bàng 2.6: Phần trăm giải phóng hoạt chất Azi của chế phẩm A
77,5
81,2

91,5 ở môi98,3
97,8
trường pH 101,3
6,8

9

68,7

82,5

90,5

95,0

98,5

96,5

10

75,7

81,2

85,3

89,6

93,6

93,1

11

68,7

68,8

79,3

90,1

93,3

95,6

12

73,9

79,7

89,3

92,2

94,0

97,0

TB

67,5
+ 3,5

77,0
±2,2

86,6
± 2,5

95,3

101,3

±2,1

95,5
±2,4

8,32

4,86

4,45

3,58

3,92

5,31

7

±s
RSD

±3,4

(%)
% Azi giải phóng tại các thời điểm so với hàm lượng ghi trên nhãn
Viẻn

10 phút

15 phút

1

81,7

82,4

85,4

90,8

89,7

91,1

2

89,1

90,7

88,7

90,9

95,2

96,9

3

90,4

91,9

87,9

92,3

96,3

95,1

92,6

91,8

92,9

94,9

96,7

4

89,4

20 phút

25 phút

30 phút

50 phút

5

89,6

88,8

90,7

90,5

93,2

94,1

6

87,7

94,7

94,6

94,3

94,9

95,3

7

95,6

102,2

99,4

100,7

101,7

8

94,7

96,3

97,5

98,1

98,5

102,9

9

95,0

93,9

96,8

96,5

98,7

100,6

10

95,4

100,0

102,1

104,2

104,4

105,8

11

96,8

98,1

97,2

98,9

99,6

99,3

12

91,5

102,5

98,5

24
100,0

101,8

103,1

81,4

93,9
±3,3

94,4

95,9

97,3

98,5

TB±E

±2,7

94,9

±3,5

±2,5

±2,9

±3,4


RSỊ)

4,75

5,66

5,84

4j46

4,17

4,44

m
% Azi giải phóng tai các thời điểm so với hàm lượng ghĩ trên
Viên

nhãn

10 phút
ỉ 5 phút 20 phút
25 phút
30 phút
50 phút
mẫu đầu, và nhỏ hơn 10 % ở các thời điểm lấy mẫu sau, đủ điều kiện so sánh
86,8
92,0
92,8
92,7
94,0
96,9
Bang 2.8: Phẩntương
trăm đồng
giải phóng
chất
của chế phẩm A ỏ
với chếhoạt
phẩm
đốiazi
chiếu.
87,4
99,0
100,6
97,6
96,0
101,6
môi
trường
pH

1.2
2.2.1,2, Đối với chê phẩm B, c, D.
88,8
100,7
93,3
100,3
101,1
99,1

1
2
3
4

hành thử 12101,2
viên trong mỗi
89,6 Tiến
101,6
100,3môi trường,
103,1ở 3 môi trường
99,9 pH 1,2; pH 4,5;

5

87,8

6

8

92,1
100,6
100,2
98,1
99,3
100,3
Kết quả phần trảm hòa tan Azi của chê' phẩm B,C,D được trình bày trong bang
97,2
96,8
94,4
97,3
99,5
98,6
2.9; 2.10, 2.11 và hình 2.5, hình 2.6, hình 2.7.
91,4
92,6
95,0
98,5
97,1
97,5

9

98,4

98,5
96,3 hoạt chất
98,6của cấc chế
99,2phẩm
Bảng 2.9: Kết96,2

quả % giải phóng

10

91,1

96,4

95,9

97,4

97,7

96,6

99,5

98,9

101,0

99,7

98.9

97,1

98,9

99,0

101,3

99,1

7

il

102,0

94,6

12

92,2

TB±
e
RSD

101,6

pH 102,1
6,8 như mục 98,3
2.1.5.

81,5 98,3
±2,3±2,1

97,3 98,6
±1J9
±2,0

4,09 3,46

3,15 2.60

98,9

901,6

98,8

+ 2,2

±1,8

2.35

1,44

<■*)
Thời gian
(phút))

Chế phẩm B
TB±e

Chế phẩm c
RSD (%)

TB + e

Chế phẩm D

RSD (%)

TB±e

RSD (%)

10

30,8 ±3,2

16,79

73,6+4,1

8,76

70,7 + 3,3 6,30

15

83,9±4,5

8,49

90,7+ 1,9

3,24

83,0 ±3,0

5,08

20

102,9 ±3,6 Nhận5,56
1,6
98,2
±2,7A đểu
4,39giải phóng tốt, sau
xét: ở cả 3100,1
môi ±trường,
Azi2,58
trong chế
phẩm

25

20 phút đều giải phóng hơn 80 %; đều có RSD nhò hơn 20 % ở thời điểm lấy
104,2 ±2,1
3,02
105,6 ± 1,2
1,77
100,4+1,0 1,68

30

105,2 ± 2 ?4

3,50

106,2 ±2,0

3,04

1024 ±2,3

3,69

25
2726
50

105,3 + 2,74

3,88

106,2 ±1,2

1,74

102,8 + 3,1 3,35

Chế phẩm B

Thời gian
(phút)

TB±e

Chế phẩm c

RSD (%)

12,7 ±0,4

10

TB±e

25,09

Chế phẩm D

RSD (.%)

79,8 ±6,9

TB±e

RSD (%)

10,98

86,2 ±7,8

4,41

15

29,8 ±2,9

15,39

90,5 ±4,1

6,31

92,1 ±3,2

4,83

20

61,ỉ ±4,4

11,45

98,3 ±3,1

4,70

102,6 + 2,9

4,33

25

77,7 ±5,1

10,47

102,1 ±3,4

5,24

102,1 ±2,6

3,84

30

90,3 ±4,9

8,56

105,7 ±3,8

4,18

103,6 ±2,0

3,01

50

100,3 ±0,9

1,53

104,0 ±2,8

4,21

104,4+2,1

3,14

Chế phẩm B

Thời

Chế phẩm c

TB±SRSD (%)

gian
10

13,3 + 0,5

15

26,8 ±2,1

20

37,2±2,8

25

56,0 ±2,4

Chế phẩm D

TB±S

TB±e

RSD (%)

TB± s

27,29

90,2±3,6

5,56

87,2 + 3,9

4,30

10,19

100,4 ±3,2

4,85

98,7±2,8

4,14

10,7

100,5 ±1,4

2,13

100,4 + 2,1

3,14

102,2 ±1,9

2,83

104,5 ± 3,5

5,34

8,46

Hình 2.6: Đồ thị hiểu diễn % giải phóng Azi của 4 chế phẩm trong môi trường
79,2± 2,6
7,24
±1,7
2,54phóng 104,7±2,2
3,35
Hình
27: Đồ 103,9
thị biểu
diễn % giúi
Alt của 4 chê'phẩm
Hình 2.5: Đồ thị biếu diễn % giải phóng Azì của 4 chế phẩm trong môi truờng
,2 ±3,5
98,5±3,4
6,13
106,4trong
±1.6 mỏi truờng
2,48 pH ỉ103,1
5,15

30
50

Hệ
sô'
tương
đồng

f

c

Nhận xét: Qua kết quả trên cho thấy 2 chế phẩm
và D có độ hòa tan tốt,
Chế phẩm A
Chế phẩm B pH4,5
Chếởphẩm
đạt tiêu chuẩn vể độ hòa tan, có RSĐ của 12 viẽn
các thời điểm đạt yêu cầu để
pH Nhận
pH xét: pH
pH
pH
pH
Trong mồi iruờng pH
hòa tan pH
tốt, chể phẩm c
pH 4,5
6,8 các chếpHphẩm pH
so
sánh
về
độ
tương
đổng
như
quy
đinh
ở
mục

2.1.5.
Còn
chế
phẩm
1,2
4,5
6,8
1,2
4,5
6,8
1,2
4,5
6,8 B không đủ
và DNhận
có RSD
chứng
tỏ có độ
đềuchê
cao,
đạt hòa
điềutan
kiện
sánh
vói chế
xét: nhỏ
Trong
môi trường
ptiđồng
6,8 các
phẩm

tốt,sosau
20 phút
đã
1,2
trong
môi
trường
pH 4,5
điều
kiện
để
so
sánh
tiếp
ở
giai
đoạn
tiếp
theo.
66,05 61,64 64,01
72,62 73,11
66,42

c

-

2

2.2.3.3. Đánh giá sự tương đóng về SKD in vitro giữa chè phẩm thư và chẻ

phẩm đối chiếu:
Từ kết quả ở bảng 2.9; 2,10; 2.11;
tính hệ số tương đồng t2 theo còng thức ờ
đoi chiếu

29

30