BÀI LUẬN DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH KHÓA 30, NĂM 2011. TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÀI LUẬN DỰ TUYỂN NGHIấN CỨU SINH KHểA 30, NĂM
2011. TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÁC SĨ: NGễ THỊ THU HƯƠNG
BỘ MÔN NHI – TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CHUYÊN NGÀNH NỘI TIẾT – CHUYỂN HÓA

HÀ NỘI. THÁNG 7. 2011


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Arg: arginine
Asn: asparagine
Gln: glutamine
Lys: lysine

Met: methionin
Ile: isoleucine
Pro: prolin
Stop: mã kết thúc

Phe: phenylalanine
Trp: tryptophan
Val: valine

ARN

acid ribonucleic

CYP

cytochrome P450

CYP21

cytochrome P450 21( steroid 21- hydroxylase)

CYP21

gen steroid 21 - hydroxylase

DNA

acid deoxyribonucleic

E

Exon

I

Intron

I2g

đột biến điểm ở intron 2 ( 656A/C →G)

HLA

human leukocyte antigen

KCĐ

không cổ điển

MM

Mất muối

NST

Nhiễm sắc thể

NHĐT

Nam hóa đơn thuần

PCR

Polymerase Chain Reaction

TSTTBS

tăng sản thượng thận bẩm sinh

3β- HDS

3β- hydroxysteroid dehydrogennase

17-OHP

17 – hydroxyprogesteron

21-OH

21- hydroxylase

∆8bp

Mất 8bp ở exon 3

MỤC LỤC


NỘI DUNG

Trang

1. Đặt vấn đề

1

2. Mục tiêu nghiên cứu

2

3. Tổng quan

2

3.1 Giới thiệu bệnh TSTTBS thể thiếu enzyme 21-OH

2

3.2 Đặc điểm di truyền của bệnh. Phát hiện người lành mang gen

7

3.3 Chẩn đoán trước sinh

9

3.4 Chẩn đoán sau sinh

11

4. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

14

5. Dự kiến kết quả nghiên cứu

20

6. Dự kiến bàn luận

20

7. Dự kiến kiến nghị và giải pháp

21

8. Tính khả thi của đề tài

21

9. Kế hoạch nghiên cứu

22

10 Tài liệu tham khảo


1

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU
Tên đề tài nghiên cứu
Phát hiện người lành mang gen đột biến CYP 21 gây bệnh tăng sản
thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzyme 21 – hydroxylase để tư vấn di
truyền
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh
gây nên do đột biến gen lặn CYP21 định khu trên nhiễm sắc thể số 6, gen
mã hóa để tổng hợp enzyme 21-OH, tham gia vào quỏ trình tổng hợp
cortisol từ cholesteron của vỏ thượng thận. Đột biến gen CYP21 gây hậu
quả không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp hormon vỏ thượng thận cortisol
và aldosteron, tăng tổng hợp testosteron dẫn đến hình ảnh lâm sàng suy
thượng thận, nam hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm giả ở trẻ trai. Thể thiếu

enzyme 21-OH chiếm 90% - 95% các thể bệnh của bệnh TSTTBS.
[as]Tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới là 1/14.000 - 1/15.000, trong đó thể thiếu
enzym 21-OH chiếm tỷ lệ 1/10.000 trẻ sinh ra [7]. Ở Việt Nam, chưa có
đề tài nghiên cứu về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ người lành mang gen bệnh
bên cạnh đó tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi
trung ương, số lượng bệnh nhân hàng năm mới được chẩn đoán tăng lên,
trung bình cứ mỗi năm 40 – 70 trẻ mới mắc và được điều trị tại khoa và
tính tới hết tháng 6 năm 2010 số bệnh nhân lên đến 512 trẻ [24].
Bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy
thượng thận cấp đe dọa tử vong cho trẻ, nếu không được điều trị hay
dùng liều thuốc chưa thích hợp sẽ dẫn đến dậy thì sớm giả ở trẻ trai, nam
hóa ở trẻ gái. Bệnh có thể điều trị được bằng liệu pháp hormone thay thế
suốt đời. Liệu pháp gen cũng đã được nghiên cứu. Bệnh có thể dự phòng


2

bằng phương pháp tư vấn di truyền như sàng lọc phát hiện người lành
mang gen bệnh để tư vấn di truyền. Trên thế giới tỷ lệ người lành mang
gen ước tính khoảng 1/60 tùy theo từng chủng tộc [19]. Từ những năm
1970 -1980 nhờ sự phát triển kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) người ta đã
xác định được nguyên nhân gây bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21-OHP là
do đột biến gen CYP21[6] do vậy, trong trường hợp cả hai bố mẹ đều có
mang gen đột biến bệnh thì khả năng sinh con bị bệnh là 25% việc chẩn
đoán trước sinh cho các bà mẹ mang gen đột biến trong gia đình khi
mang thai là thực sự cần thiết để chẩn đoán sớm trước sinh cho con, đặc
biệt khi thai bị bệnh là giới nữ, các bác sĩ có thể điều trị sớm để sau này
trẻ phát triển bình thường, không bị nam hóa từ trong bào thai, tránh cho
trẻ không phải chịu cuộc phẫu thuật chỉnh hình sau sinh. Ngoài ra, khi
biết bà mẹ mang thai trẻ bị bệnh là giới nam các bác sĩ cần lập kế hoạch

chăm sóc điều trị ngay sau sinh để phòng tránh cơn suy thượng thận cấp
đem lại sự phát triển bình thường về sau cho trẻ [2]. Do vậy chẩn đoán
trước sinh có vai trò rất quan trọng. Để góp phần điều trị sớm bệnh và tư
vấn di truyền cho các gia đình mang gen bệnh chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài này với hai mục tiêu sau|:
• Phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình
bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzyme 21 – hydroxylase.
• Chẩn đoán trước sinh cho một số phụ nữ mang gen đột biến CYP21
khi họ mang thai và tư vấn di truyền cho gia đình bị bệnh TSTTBS.
2. TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về bệnh TSTTBS thể thiếu enzym – 21 hydroxylase
2.1.1. Khái niệm về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
Tăng sản thượng thận bẩm sinh là một bệnh di truyền gen lặn nằm
trên NST thường, gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzyme


3

tham gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình
tổng hợp hormon vỏ thượng thận. Trong đó, thể thiếu enzym 21-OH là thể
bệnh hay gặp nhất chiếm tỷ lệ 90 - 95%, thứ hai là thể 11β- hydroxylase 5 9%, còn thiếu hụt các enzyme khỏc gõy cỏc thể bệnh: 3β - HSD, 17αhydroxylase và 20, 22- desmolase ít gặp hơn
Tùy theo loại đột biến dẫn đến mức độ thiếu enzyme 21- hydroxylase
là một phần hay hoàn toàn mà gây ra các thể lâm sàng: MM, NHĐT, không
cổ điển hay thể khởi phát muộn [1][9]
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh
Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm
1930 ( Broster 1934, Jacobziner 1936) và được mô tả chi tiết vào năm 1951,
bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường.
Năm 1984, Hite và cs xác định được gen CYP21 và giả gen CYP21P
có kích thước 3,4kb; nằm trờn nhỏnh ngắn nhiễm sắc thể số 6 [17].

Năm 1986, Higashi và cs [22]đã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ
gen CYP 21 và giả gen CYP21. Sau đó các đột biến đặc hiệu của gen CYP
đã được tìm thấy, đây là nguyên nhân chính gây thiếu hụt enzyme 21-OH
2.1.3 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21
Vị trí gen CYP21 nằm trên NST số 6

Hình 1.1: Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21[26]


4

Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A1P, cả hai
cùng nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trờn cỏnh ngắn của
NST số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A1P nằm
xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần
của C4 bổ thể [18], [27]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tủ của gen CYP21[9]

Mỗi gen CYP21 gồm 10exon , chiều dài 3,1kb, trình tự nucleotide của hai
gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng 96% trong các intron do
vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến mất đoạn
giữa hai allen hoặc nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc
của gen CYP21A2 bị thay thế một đoạn của giả gen CYP21A1P hoặc gây
mất đoạn của gen CYP21A1P[11].

Hình 1.3 Vị trí của gen CYP21 trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC. Mũi tên chỉ
hướng phiờn mó. C4A và C4B= các gen mã hóa thành phần C4 bổ thể. RP1= gen mã
hóa protein nhân tế bào chưa rõ chức năng.RP2= bản sao thu ngắn của gen RP1.
TNXB= gen tenascin –X; TNXA= bản sao thu ngắn của TNXB ( Aston C. E. Serman

S. L. 1988)


5

Trên thế giới đã tìm thấy gần 100 đột biến khác nhau gây bệnh
TSTTBS do thiếu hụt enzyme 21- OH hay gặp là đột biến điểm, mất đoạn,
thêm đoạn hoặc thay đổi cấu trúc gen. Trong đó hay gặp nhất là đột biến trên
gen CYP21A2, với gen CYP21A1P hay gặp mất đoạn 8bp ở exon 3, dịch
khung exon 7 và đột biến vô nghĩa ở exon 8 [19]
Chức năng gen CYP21
Gen CYP 21 mã hóa cho enzyme 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò
phiờn mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các
intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh.
Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzyme 21-OH.

Hình 1.4 Quá trình tổng hợp enzym 21-OH từ gen CYP21
(Gelehrter T.D, Collins F.S 1990)

2.1.4 Một số đột biến gen CYP21
Hầu hết các đột biến gen gây thiếu enzyme 21-OH là hậu quả của một trong
hai kiểu tái tổ hợp giữa 2 gen CYP21A2 và CYP21P.


6

Bảng 1. Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [7], [20]
Đột biến
Mất đoạn gen
Pro30Leu

I2g

Vị trí nucleotide

Exon/Intron

89C→T
656A/C→G

E1
I2

Mất 8bp
Ile 172Asn
Ile236Asn,

∆708-715
1001T→A
1382T→A,

Val237Glu,

1385T→A,

Met239Lys
Val281Leu
Phe306+1nt
Gln318Stop
Arg356Trp

1391T→A
1685G→T
1759+T
1996C→T
2110C→T

Tỷ lệ %
25-30
5-10
20-25

Kiểu hình
MM
KCĐ
MM-

E3
E4
E6

5-10
5-10
5-10

NHĐT
MM
NHĐT
MM

E7

E7
E8
E8

5-10
<5
5-10
10

KCĐ
MM
MM
MM

2.1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh

Sơ đồ 1.1: Chi tiết sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận
TSTTBS thể thiếu hụt enzym21-OH chiếm 90-95% các thể bệnh, do thiếu
hụt enzym 21-OH nờn gõy thiếu hụt hormon Cortisol và Aldosteron đồng
thời gây tăng một tiền chất 17-OHP và androgen điển hình là testosteron. Do
vậy, ngay từ trong thời kỳ bào thai androgen đã tăng cao ớt gõy biến đổi ở
thai nhi nam, nhưng gây nam hóa của thai nhi nữ gây nên tình trạng mơ hồ
giới tính sau sinh. Biểu hiện lâm sàng của cả trẻ trai và trẻ gái sau sinh bị
mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH: âm vật phì đại ở trẻ gái, phát
triển sớm kích thước dương vật ở trẻ trai, có rối loạn điện giải ở thể mất


7

muối. Nếu không được điều trị sớm sẽ gây dậy thì sớm giả ở trẻ trai như

mọc lông mu, tăng phát triển dương vật, lớn nhanh, rậm lông, mọc trứng cá,
đặc biệt là cốt húa cỏc đầu xương dài sớm gõy lựn sau này. Đối với trẻ gái
nếu không điều trị biểu hiện xạm da, ngoại hình nam, rậm lông, bộ phận sinh
dục phì đại, rối loạn kinh nguyệt và vô sinh ở nữ [1]
2.2 Đặc điểm di truyền của bệnh. Phát hiện người lành mang gen bệnh
2.2.1 Đặc điểm di truyền của bệnh
TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn,
nằm trên NST thường số 6 và tuân theo quy luật của Mendel. Bệnh chỉ xảy
ra ở người mang đồng hợp tử gen lặn.

I

AA

AA

I
I

I
I aa
I
Sơ đồ 1.2
I

Aa

Aa

AA

aa

AA

AA

AA

AA

Aa

Aa

A
A
AA

Aa

Aa

AA

Aa

AA

Aa

Aa

Aa

aa

Aa

Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường

(Autosome Recessive). Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh.

Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ. Thường gặp
bệnh xuất hiện trong cùng một thế hệ. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là như nhau.
+ Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Aa x Aa) khả năng con bị bệnh (aa) là
25%, con dị hợp tử (Aa) mang gen lặn là 50%, con bình thường hoàn toàn
(AA) là 25%. Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (AA) kết hôn với người
mang gen dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thường (AA) là 50%,
con bị dị hợp tử (Aa) là 50%.


8

+ Nếu cha( hoặc mẹ ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh
(aa) thì khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa)là 100%
Nguy hiểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường là có người lành
mang gen bệnh, bề ngoài là người hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh nhưng
khi xây dựng gia đình sinh con thì truyền bệnh cho con theo tỷ lệ phân ly

gen bệnh của qui luật Mendel .
Tần xuất người mang gen bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21 – OHP là
1/60 tùy thuộc vào chủng tộc. Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có
cả hai đột biến về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nờn xỏc xuất xảy ra vô
cùng nhỏ. Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả
năng sinh con bị bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần
thể[2]
2.2.2 Biểu hiện lâm sàng của người mang gen dị hợp tử
Mặc dù người ta cho rằng những cá thể mang gen dị hợp tử có thể có các
triệu chứng của thừa androgen hơn những người không mang gen, nhưng
các nghiên cứu bệnh chứng không ủng hộ quan điểm này.
Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử các đột biến gen CYP21 có
tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận hơn
những người bình thường không mang gen [7]
Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét nghiệm định lượng nồng độ 17OHP, testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21. Trong đó, nồng độ
17-OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất trước chỗ tắc
do thiếu hụt enzym 21-OH nên giá trị 17-OHP tăng sớm và tăng cao ở trên
bệnh nhân và người mang gen, người ta còn ứng dụng giá trị này để làm
sàng lọc chẩn đoán bệnh ở các nước phát triển[a]
*Phát hiện người lành mang gen bệnh


9

Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện ở bệnh di truyền lặn vì
không biểu hiện tính trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu
hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì.
Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Người ta
định lượng 17-OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh,
với 17-OHP <300ng/ml thì là bình thường và 17-OHP >300 - 1499ng/ml thì

là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al
2000). Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể
xác định đột biến gen CYP21 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng
cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và
tế bào ối thai nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA
giống nhau, và có thể chẩn đoán thai nhi thiếu 21-OH hoặc người lành mang
gen với độ tin cậy cao[3,10,23]
Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia
đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể tỷ lệ mắc bệnh cao để
quản lý người mang gen và người bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đưa ra
lời khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn cùng dòng họ
cũng như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc
giữa người mang gen bệnh với người bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn phải
quản lý thai nghén về phương diện di truyền. [18]
2.3 Chẩn đoán trước sinh
2.3.1 Khái niệm về chẩn đoán trước sinh(Prenatal diagnosis)
Chẩn đoán trước sinh là sử dụng các phương pháp xét nghiệm siêu âm, sinh
hóa, di truyền tế bào, di truyền phân tử để xác định xem thai có bị bệnh di
truyền hay các dị tật bẩm sinh hay không khi thai còn trong tử cung trước
khi đứa trẻ sinh ra[5]


10

Đối với bệnh TSTTBS người ta sử dụng các phương pháp siêu âm
thai, di truyền phân tử để phát hiện xem thai có mang gen đột biến CYP21
không từ lúc thai tuần thứ 5 đến 14 tuần. Nếu thai là giới nữ thì cần điều trị
sớm từ tuần thứ 7 – 8 của thai kỳ bằng cách sử dụng dexamethason cho mẹ.
Nếu thai là con trai thì ngưng điều trị nhưng phải lập kế hoạch chăm sóc sau
sinh phòng cơn suy thượng thận cấp ở thể mất muối [15, 19]

Mục đích của chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS không phải
phát hiện bệnh để đình sản thai nghén mà mục đích phát hiện sớm để điều trị
vì đây là bệnh di truyền điều trị được bằng phương pháp thay thế hormone
suốt đời.
2.3.2 Các phương pháp sử dụng để chẩn đoán trước sinh với bệnh
TSTTBS
*Các đối tượng cần chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS
Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH lần
này có thai cần thiết chẩn đoán trước sinh.
Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại cú cụ, chỳ, bỏc
ruột, cậu ruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trước sinh.
Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi.
*Các phương pháp sử dụng chẩn đoán trước sinh đối với bệnh TSTTBS
- Phương pháp siêu âm: siêu âm thai được sử dụng trong chẩn đoán trước
sinh từ năm 1972 là phương pháp chẩn đoán thai không xâm phạm, an toàn
cho thai. Do vậy, siêu âm thai là phương pháp can thiệp không thể thiếu
trong sàng lọc phát hiện bệnh dị tật của thai nhi. Trong bệnh TSTTBS siêu
âm giúp cho định khu thai và gai rau [5]
- Chẩn đoán tế bào gai rau: năm 1960 phương pháp sinh thiết gai rau đã
được sử dụng nhưng đến năm 1983 nhờ có siêu âm chỉ dẫn nên phương pháp
này mới được sử dụng rộng rãi giúp cho chẩn đoán thai sớm 3 tháng đầu khi


11

mà phương pháp chẩn đoán bằng tế bào ối được tiến hành muộn hơn là 3
tháng giữa. Kỹ thuật sinh thiết gai rau tiến hành qua đường bụng hoặc đường
âm đạo dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Thường tiến hành thủ thuật vào thai
tuần thứ 8 đến tuần thứ 11[3]
- Phương pháp di truyền phân tử để phát hiện gen đột biến bằng phương

pháp PCR. Từ những năm 1970 -1980 nhờ kỹ thuật khuyếch đại gen (PCR)
mà người ta đã xác định được một số gen đột biến gây dị tật ở thai nhi[6]
- Phương pháp lấy tế bào và AND của thai từ máu mẹ: mặc dù tỷ lệ AND
con trong máu mẹ thấp, có thể chiết tách AND có nguồn gốc từ thai trong
máu mẹ cho các xét nghiệm phân tử trong chẩn đoán trước sinh. Phương
pháp này rất tốt để chẩn đoán trước sinh TSTTBS vì rất cần kết quả sớm từ
khi thai 5 – 6 tuần để điều trị cho bé gái so với sinh thiết gai rau và chọc ối,
nhưng phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế [5]
Do vậy, để chẩn đoán bệnh trước sinh cho bệnh TSTTBS, có thể sử
dụng một số phương pháp giúp chẩn đoán như định lượng nồng độ 17-OHP
trong nước ối, xác định týp HLA của tế bào gai rau và tế bào nước ối, phân
tích di truyền phân tử của các tế bào gai rau và tế bào nước ối để tìm đột
biến gen CYP21.
Năm 1975, người ta đã phát hiện nồng độ 17-OHP nước ối tăng cao ở
phụ nữ có con mắc bệnh TSTTBS thể mất muối. Khi týp HLA được phát
hiện liên quan đến bệnh TSTTBS, phân tích di truyền phân tử bằng cách sử
dụng DNA chiết tách từ tế bào gai rau hay tế bào ối đối với gen CYP21, C4
và HLA lớp I, II [11, 13.]
Chẩn đoán trước sinh nhằm mục đích xác định thai bệnh để điều trị
trước sinh. Nếu thai nhi là nam bị bệnh thì không phải điều trị trước sinh.
Nếu thai nhi là nữ bị bệnh thì cần điều trị trước sinh bắt đầu từ tuần thứ 7 – 8
của thai kỳ cho đến lúc sinh bằng cách sử dụng dexamethason cho mẹ với


12

liều chuẩn là 20μg/kg/ngày, tối đa 1,5mg/ngày chia làm 3 lần để ức chế sản
xuất androgen thượng thận của bào thai và làm giảm hiện tượng nam húa
gõy phì đại âm vật, tránh cho trẻ phải chịu đựng một cuộc phẫu thuật chỉnh
hình bộ phận sinh dục sau này. Ngưng điều trị nếu kết quả xét nghiệm gen

cho biết thai nhi không bị bệnh.
Đồng thời, cần lập kế hoạch điều trị ngay sau sinh để phòng cơn suy
thượng thận cấp và đem lại sự phát triển bình thường về sau cho trẻ [9], [10].
2.4 Chẩn đoán sau sinh
* Sàng lọc sơ sinh
Mục đích chính của sàng lọc sơ sinh là phát hiện sớm những trẻ bị
bệnh để giúp chẩn đoán sớm, ngăn chặn trẻ có nguy cơ xuất hiện cơn suy
thượng thận cấp đe dọa tính mạng và ngăn ngừa nhận định sai lầm giới tính
nam ở trẻ nữ bị lưỡng giới cơ quan sinh dục ngoài. Ngoài ra, sàng lọc sơ
sinh còn giúp ngăn ngừa nồng độ androgen tăng cao, kèm theo các biểu hiện
lâm sàng, giúp cho sự phát triển và dậy thì bình thường, cải thiện chiều cao
cuối cùng. Vì vậy sàng lọc sơ sinh TSTTBS rất có ích và được khuyến cáo
cho tất cả trẻ mới ra đời [10,13].
Chẩn đoán nghi ngờ bệnh TSTTBS khi nồng độ 17-OHP trong máu
bằng giấy thấm máu ở gót chân vào ngày thứ 2 - 3 sau sinh tăng cao. Ở trẻ
đẻ non, trẻ mắc bệnh lý hay stress giá trị 17-OHP có xu hướng tăng cao hơn
những trẻ đủ tháng và thường gặp dương tính giả. Ngưỡng cắt của nồng độ
17-OHP được khuyến cáo tùy theo cân nặng, đối với trẻ < 1300 gram là từ
165 ng/ml và đối với trẻ > 2200gram là từ 40ng/ml tại Wisconsin (Miền tây
Hoa Kỳ). Tại Thụy Điển, ngưỡng cắt 17-OHP là 400nmol/l đối với trẻ đẻ
non trước 35 tuần và 150 nmol/l đối với trẻ 35-36 tuần. Kết quả sàng lọc
dương tính cần được khẳng định bằng định lượng lần 2 nồng độ 17-OHP
máu, các steroid nước tiểu hay phân tích gen CYP21 [14].


13

Sàng lọc di truyền phân tử, phân tích gen CYP 21 không cần thiết cho chẩn
đoán nhưng có thể hữu ích giúp khẳng đinh bản chất của đột biến, giúp tư
vấn di truyền và thiết lập chẩn đoán trong những trường hợp nghi ngờ.

Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trong nước
Năm 1974, Nguyễn Thu Nhạn mô tả một bệnh nhân TSTTBS thể NHĐT
trong “ Hội chứng dậy thì sớm ở trẻ em”
Năm 1990, N. T Nhạn, C.Q. Việt, N.T.Nga, N.T. Hoàn và cộng sự đã
tổng kết 36 bệnh nhân mắc HCSDTT trong giai đoạn 1981 – 1990, chiếm tỷ
lệ 1,9% tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% .
Năm 1993, Nguyễn Thị Phượng đã nghiên cứu về phương diện di truyền
trên 31 bệnh nhân hội chứng sinh dục thượng thận tại bệnh viện Nhi trung
ương từ năm 1980 – 1990. Tác giả đã nhận thấy bệnh mang đủ các đặc tính
di truyền lặn nằm trên NST thường .
Năm 1994, N. T. Nhạn và N. N. Nga tổng kết các dấu hiệu lâm sàng, cận
lâm sàng chung của 55 bệnh nhân TSTTBS điều trị tại bệnh viện Nhi trung
ương. Với phác đồ điều trị cấp cứu cơn suy thượng thận hiện nay, gần 95%
bệnh nhân được cứu sống .
Năm 1997, Võ Thị Kim Huệ, Nguyễn Thu Nhạn và Nguyễn Thị Phượng
đã nghiên cứu có hệ thống TSTTBS do thiếu enzyme 21-OH đồng thời bước
đầu đưa ra các dấu hiệu lâm sàng và sinh hoá áp dụng vào chuẩn đoán sớm
[16] [21].
Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ, Nguyễn Thu Nhạn và Nguyễn Thị Phượng
công bố nghiên cứu chuẩn đoán và điều trị TSTTBS do thiếu enzyme 21-OH
ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương 1989-1997.
Nghiên cứu này đưa ra các dấu hiệu lâm sàng và sinh hóa thường gặp và
giúp chuẩn đoán và sử dông Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay
cho prednisolon, đặc biệt tác giả đưa ra giới hạn giá trị của 17-OHP,


14

progesterone và testosterone để chẩn đoán và dùng kỹ thuật khuếch đại gen
(PCR) để phát hiện đột biến gen mất 8 bp ở exon 3

Năm 2001, Thỏi Thiờn Nam đã nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho
bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH và thành viên gia đình [5]. Lê
Thị Minh Châu đã nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh
TSTTBS ở lứa tuổi sơ sinh [4].
Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và
bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình
trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân
Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen
cyp 21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzyme 21hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh [2].
Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và
một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại bệnh viện Nhi trung
ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là
chiều cao
Năm 2010, tụi đó tiến hành nghiên cứu “Nghiờn cứu giá trị 17_OHP
trong theo dõi điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH tại bệnh viện
Nhi trung ương”
Ngoài ra, đó cú một vài đề tài nghiên cứu về phát hiện đột biến gen
CYP21 cho các bệnh nhân còn với gia đình bệnh nhân chỉ có một đề tài của
Trần Kiêm Hảo với 5 gia đình được làm xét nghiệm đột biến bằng phương
pháp PCR với mẫu bệnh phẩm là tóc. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài này để giúp cho các bác sĩ nhi khoa có cơ sở vững chắc để tư vấn di
truyền và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân có nguy cơ.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu


15

Mục tiêu 1: Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1 là cha, mẹ, anh, chị,
em ruột của bệnh nhân TSTTBS đã được phát hiện đột biến gen CYP21

đang theo dõi và điều trị tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa- Di truyền Bệnh
viện Nhi trung ương.
Mục tiêu 2: Các bà mẹ hoặc chị ruột của bệnh nhân TSTTBS đã được
phát hiện là người lành mang gen đột biến CYP21 hiện tại đang mang thai ở
tuần thứ 6 trở lên.
Tiêu chuẩn loại trừ:
Gia đình không đồng ý chẩn đoán trước sinh
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Chúng tôi sử dụng phương pháp nghiờn cứu tiến cứu thời gian từ tháng
9 năm 2011 đến 9 năm 2014 tại hai địa điểm
- Khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi trung ương là
nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân TSTTBS
- Các kỹ thuật di truyền phân tử sẽ tiến hành tại trung tâm Gen và
Protein trường Đại học Y Hà Nội.
Mỗi đối tượng nghiên cứu sẽ có một hồ sơ nghiên cứu bao gồm các thông tin
về bệnh nhân: lâm sàng, chẩn đoán, đột biến gen và phả hệ của gia đình, các
thông tin về anh, chị, em ruột của bệnh nhân
3.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu
+ Dự kiến cỡ mẫu = 50 gia đình (tương ứng 150 cha, mẹ, anh, chị, em
bệnh nhân)
+ Dự kiến cỡ mẫu để chẩn đoán trước sinh = 10 bà mẹ mang thai.
Các chỉ tiêu nghiên cứu:
- Lập phả hệ gia đình bệnh nhân TSTTBS.
- Dấu hiệu xét nghiệm 17-OHP cho bố, mẹ, anh, chị, em bệnh nhân.


16

- Kết quả phân tích đột biến gen CYP21 cho bố, mẹ, anh, chị, em bệnh
nhân TSTTBS đã tìm thấy đột biến.

3.2.3 Kỹ thuật di truyền phân tử
Các thành viên trong gia đình bệnh nhân bị TSTTBS đều được lấy
máu ngoại vi để làm xét nghiệm định lượng nồng độ 17 – OHP trong máu
đồng thời lấy máu ngoại vi để chiết tách ADN theo phương pháp Phenol/
chloroform. Theo quy trình sau: [6]
3.3.1. Chiết tách ADN
- Lấy 2ml máu ngoại vi của các thành viên trong gia đình bệnh nhân bị
TSTTBS.
- Tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi: theo nguyên tắc sau: loại
hồng cầu và phá vỡ màng tế bào → phá vỡ màng nhân → loại protein
→ tủa DNA → rửa tủa → hòa tan DNA.
- Tủa DNA thu được để khô tự nhiên, sau đó hòa tan bằng đệm TE hoặc
nước cất khử ion
- Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4 0C trong thời gian ngắn
hoặc lưu giữ ở - 200C trong thời gian dài. Sản phẩm tách chiết DNA
được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano Drop, kiểm tra
độ nguyên vẹn bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
3.3.2 Kỹ thuật PCR
Gen CYP 21 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu


17

Hình 1.6 Sơ đồ sự sao chép gen trên NST
Cặp 1: P6F : Mồi xuôi
P4R : Mồi ngược
Cả mồi P6 và P4 đều đặc hiệu cho gen CYP21A2, khuếch đại đoạn 1 của
gen này, đoạn này dài 854bp từ promotor đến exon 3.
Chu trình nhiệt phản ứng: 980C-10 phút, x 30 chu kỳ.
Cặp 2: : P3F : Mồi xuôi

P5R : Mồi ngược
Khuếch đại đoạn 2 của gen CYP21A2 dài 414bp từ intron 2 đến exon 4
trong đó P3F là mồi đặc hiệu cho gen CYP21A2.
Chu trình nhiệt phản ứng 980C-5 phút, x 30 chu kỳ, 750C-5 phút
Cặp 3: P1F : Mồi xuôi
P10R : Mồi ngược
Khuếch đại đoạn 3 của gen CYP21A2, đoạn này dài 2083bp từ exon 3 đến
intron 10, trong đó P1F là mồi đặc hiệu cho gen CYP21A2.
Chu trình nhiệt phản ứng 980C-10 phút, x 30 chu kỳ.
Phân tích trờn mỏy CEQ8000 – Beckman Coulter:


18

Các mẫu được chạy trờn mỏy CEQ 8000 theo phương trình phân tích đoạn.
Sau đó tiến hành phân tích các đỉnh với độ lớn tương ứng. Các mẫu được so
sánh với mẫu đối chứng bình thường.

Hình 1.7 Hình ảnh đột biến điểm sau phân tích trực tiếp bằng ADN của các thành
viên trong gia đình bệnh nhân TSTTBS ở Trung Quốc. Gia đình thứ 1 có hai con gái
bị bệnh. Hình a,c: con gái bị bệnh 1; hình b,d: con gái bị bệnh thứ 2, hình e: bố bệnh
nhân; hình f: mẹ bệnh nhân. Gia đình thứ 2: hình g: con gái bị bệnh, hình h: em trai
bệnh nhân không bị bệnh, có mang gen bệnh; hình i: bố bệnh nhân không bị bệnh.

Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose


19

Nạp 9àl mẫu điện di đã chuẩn bị vào trong các giếng của bản gel. Tiến hành

điện di mẫu DNA bệnh cùng với thang DNA chuẩn và mẫu DNA đối chứng
trong 40 phút ở hiệu điện thế 70V và 10 phút ở hiệu điện thế 90V. Sau đó
nhuộm bản gel điện di và quan sát, chụp hình sản phẩn khuếch đại .

Hình 1.8 : Kết quả phân tích gen CYP21 của bệnh nhân TSTTBS

3.3.3 Phương pháp phân tích kết quả


20

- Các nucleotid trên gen sẽ được biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với 4 mầu
tương đương với 4 loại nucleotid A,T,G,C.
- Lập biờủ đồ đột biến gen cho từng gia đình bệnh nhân.
Các đột biến gen CYP21A2 được tìm thấy ở các thành viên trong gia đình
bệnh nhân được mô tả theo quy ước quốc tế dưới dạng DNA và Protein.
Mục tiêu 2: Chẩn đoán trước sinh
Dự kiến 5 – 10 phụ nữ là thành viên của 50 gia đình bệnh nhân trong nghiên
cứu ở mục tiêu 1 đã được phát hiện là người lành mang gen hiện đang có
thai từ tuần thứ 6 trở lên.
- Siêu âm thai và thực hiện kỹ thuật sinh thiết gai rau hoặc chọc ối tại khoa
sản BV Bạch Mai.
- Khi được bệnh phẩm là gai rau sẽ tiến hành các quy trình chiết tách AND
và thực hiện các phản ứng PCR như đã trình bày ở mục tiêu 1 để xác định
xem thai nhi có mang gen bệnh hay không?
- Nếu thai nhi bị bệnh mang gen CYP21 là trẻ gỏi thỡ tiến hành điều trị
Dexamethasone cho mẹ đang mang thai cho đến lúc sinh. Sau khi sinh trẻ sẽ
được theo dõi và điều trị theo phác đồ của khoa Nội tiết – Di truyền- Chuyển
hóa Bệnh viện Nhi trung ương.
- Nếu thai nhi là trẻ trai bị bệnh chúng tôi ngừng điều trị và chờ đến khi thai

phụ sinh ra sẽ điều trị ngay cho trẻ theo phác đồ của khoa Nội tiết – Di
truyền- Chuyển hóa Bệnh viện Nhi trung ương.
* Tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân:
- Mỗi gia đình sẽ được giải thớch rừ về bệnh hướng dẫn cách điều trị, theo
dõi cho bệnh nhân.
- Giải thích sự cần thiết hợp tác của gia đình để phát hiện người lành mang
gen cho các anh, chị, em họ hai bên nội, ngoại để họ tự nguyện chấp nhận
được chẩn đoán.


21

- Những người đã được phát hiện là dị hợp tử mang gen bệnh cần dặn dò khi
kết hôn tránh hai dị hợp tử lấy nhau để tránh nguy cơ sinh con bị bệnh cho
nên cần giải thích xét nghiệm cho cả hai trước khi kết hôn.
- Những người dị hợp tử cần được quản lý khi thai nghén nếu cần thiết phải
chẩn đoán trước sinh để điều trị sớm.
3.4 Xử lý kết quả
Các số liệu được xử lý theo thuật toán thống kê y học và phần mềm máy tính
EPI INFO 6.04 của Tổ chức Y tế thế giới.
3.5 Đạo đức trong nghiên cứu
- Phát hiện sớm người lành mang gen ở dạng dị hợp tử để có thể chắc
chắn tư vấn di truyền.
- Phát hiện sớm bệnh nhân bị TSTTBS ở thời kỳ bào thai.
- Giúp cho các bác sĩ lâm sàng có thể phát hiện trẻ bị TSTTBS để có
thể can thiệp điều trị sớm và quản lý bệnh nhân.
- Sự chấp thuận;
+ Đề tài được sự chấp thuận của hội đồng Y đức, Bệnh viện Nhi trung ương
+ Được sự đồng ý của các thành viên trong gia đình bệnh nhân
+ Đảm bảo tính bí mật cho các gai đình nghiên cứu

DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Đặc điểm của các gia đình nghiên cứu
2. Sự thay đổi nồng độ hormon của 17-OHP ở người lành mang gen
3. Kết quả phát hiện các đột biến gen CYP21 ở các thành viên trong gia
đình bệnh nhân.
4. Kết quả phát hiện sớm đột biến gen CYP21 ở các thai nhi có mẹ bị
bệnh TSTTBS hoặc mẹ mang gen dị hợp tử.
DỰ KIẾN BÀN LUẬN


22

1. Xét nghiệm 17-OHP phát hiện được bao nhiêu % dị hợp tử?
2. Giá trị 17-OHP là bao nhiêu có thể khẳng định là dị hợp tử cho các
thành viên khác trong gia đình?
3. Sử dụng giá trị 17 – OHP có thể triển khai cho sàng lọc ở cộng đồng
để phát hiện dị hợp tử hay không?
4. Danh sách các dạng đột biến gen CYP21 ở các thành viên trong gia
đình.
5. Các dạng đột biến mới ở thai nhi bị bệnh TSTTBS trong thời kỳ mang
thai của các bà mẹ có con bị bệnh TSTTBS, hoặc chị gái, em gái bệnh
nhân TSTTBS.
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ VÀ GIẢI PHÁP
1. Phát hiện sớm người lành mang gen bệnh
2. Chẩn đoán sớm trước sinh bệnh TSTTBS để có biện pháp can thiệp từ
trong thời kỳ bào thai đối với thai nữ bị bệnh
3. Chẩn đoán sớm và điều trị hormon ngay sau sinh đối với bệnh nhân bị
TSTTBS thể mất muối.
4. Tư vấn di truyền, tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn trước sinh cho các gia
đình có người bị bệnh TSTTBS.

KHẢ NĂNG THỰC THI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài được tiến hành tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền
Bệnh viện Nhi trung ương là một cơ sở đầu ngành của nhi khoa. Bệnh viện
là địa điểm mà học viên sẽ thu thập số liệu bệnh nhân nghiên cứu. Số lượng
bệnh nhân đủ cho nghiên cứu. Hàng năm khoa đã tổ chức đều đặn hội tăng
sản thượng thận bẩm sinh và sinh hoạt khoa học nên bệnh nhân và gia đình
có điều kiện tham gia để học hỏi chia xẻ khó khăn trong quản lý và điều trị