Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.) (FULL TEXT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.)

Chuyên ngành:

Hoá học hữu cơ

Mã số:

62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm
2. TS. Hoàng Lê Tuấn Anh

HÀ NỘI - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn khoa học của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh. Các số
liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

i


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được
nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn
bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.
TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh - những người Thầy đã tận tâm
hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán
bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển
đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Bùi Hữu Tài, TS. Phạm Hải Yến và ThS.
Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý
quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia
Chungnam, Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính gây độc tế bào và
hoạt tính kháng viêm.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và đồng nghiệp của tôi tại Bộ
môn Hóa học - Khoa Đại học Đại cương, tới Phòng Tổ chức Cán bộ và Ban Giám
hiệu Trường đại học Mỏ - Địa chất đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình,
bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền
ii

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................x
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. xii
DANH MỤC PHỤ LỤC ...........................................................................................xv
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA) ................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona) .....................................................3
1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona .............................3
1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane ................................................4
1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin .....................................................................7
1.1.2.3. Các hợp chất alkaloid ........................................................................19
1.1.2.4. Các hợp chất amide ...........................................................................23
1.1.2.5. Các hợp chất peptide vòng ................................................................24
1.1.2.6. Các hợp chất khác .............................................................................25
1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Annona ..............................27
1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................27
1.1.3.2. Hoạt tính kháng viêm ........................................................................30
1.1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm...............................................30
1.1.3.4. Hoạt tính kháng virus và ký sinh trùng .............................................31
1.1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa ...................................................................32
1.1.3.6. Hoạt tính khác ...................................................................................32
1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI NA BIỂN ....................................................................34
1.2.1. Đặc điểm thực vật ......................................................................................34
iii

1.2.2. Công dụng..................................................................................................35
1.2.3. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) trên thế giới .................35
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) ở Việt Nam .................36
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................38
2.1. MẪU THỰC VẬT .............................................................................................38
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .............................................39
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .............................................................................39
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ..........................................................................39
2.2.3. Sắc ký cột (CC)..........................................................................................39
2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC ...................................39
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ...............................................................................39
2.3.2. Độ quay cực ([α]D) ....................................................................................40
2.3.3. Phổ khối lượng (MS) .................................................................................40
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ...............................................................40
2.3.5. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) ............................................................................40
2.3.6. Phương pháp xác định đường ....................................................................40
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC.................................41
2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ........................................41
2.4.1.1. Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ..................................41
2.4.1.2. Phân tích hình thái của các tế bào chết theo chương trình sử dụng
chất nhuộm Hoechst 33342 ............................................................................43
2.4.1.3. Western Blot .....................................................................................43
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm ............................................44
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................................45
3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN ........................................45
3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT .................48
iv

3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............48
3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................48
3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................49
3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................49
3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ......................................................................49
3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................50
3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................50
3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al..............................50
3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .......................50
3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E ..................................................................50
3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .................................................................51
3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid .................................51
3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới) .........................................................................................51
3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside ...................................................................................................51
3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .........................................................52
3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A ........................................................................52
3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1 .........................................................................52
3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ........................................................................52
3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside ...............................52
3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside ..............53
3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid................................................53
3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M .....................................................................53
v


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................54
4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT .....................................................54
4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............54
4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................60
4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................65

4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................70
4.1.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ......................................................................76
4.1.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................78
4.1.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................80
4.1.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al.............................82
4.1.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .......................84
4.1.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E ..................................................................85
4.1.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .................................................................87
4.1.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid .................................89
4.1.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới) .........................................................................................91
4.1.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside ...................................................................................................97
4.1.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .........................................................99
4.1.16. Hợp chất 16: Blumenol A ......................................................................101
4.1.17. Hợp chất 17: Icariside B1 .......................................................................102
4.1.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ......................................................................103
4.1.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside .............................105
4.1.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside............106
vi


4.1.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid..............................................107
4.1.22. Hợp chất 22: Squamocin M ...................................................................108
4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ....................................................112
4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn ........................112
4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ...........................112
4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất ................................115
KẾT LUẬN .............................................................................................................118
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................120
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................121
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................122

PHỤ LỤC .................................................................................................................... I

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
13
C-NMR

Tiếng Anh
Cacbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
A
Annona
A-498
Human kidney carcinoma
A-549
Human lung carcinoma
CD
Circular dichroism
1
COSY
H-1H- Correlation Spectroscopy
DEPT
Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer
DMSO
Dimethylsulfoxide
DNA
Deoxyribo Nucleic Axit
DPPH
1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl
ESI-MS
Electron Spray Ionization Mass
Spectra
FBS
Fetal bovine serum
Glc
Glucose
HEL-299
Homo Sapiens Lung Normal
HeLa
HeLa cell
Hep G2
Hepatocellular carcinoma
HL-60
Human promyelocytic leukemia
HMBC
Heteronuclear Mutiple Bond
Connectivity
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
HR-ESI-MS High Resolution Electronspray
Ionization Mass Spectrum

HSQC
Heteronuclear Single-Quantum
Coherence
HT-29
Human colon adenocarcinoma
IC50
Inhibitory concentration at 50%
IL
iNOS

Interleukin
Inducible nitric oxide synthase

KB
LPO
LPS
LU-1
MCF-7
MKN-45

Human epidemoid carcinoma
lipid peroxide
Lipopolysaccharide
Human lung carcinoma
Human breast carcinoma
Human Gastric Cancer

Diễn giải
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
Annona
Ung thư biểu mô thận người
Ung thư phổi người
Phổ lưỡng sắc tròn
Phổ COSY
Phổ DEPT
(CH3)2SO
Phổ khối ion hóa phun mù điện
tử
Huyết thanh bò
Glucozơ
Tế bào mô phổi thường
Tế bào ung thư cổ tử cung
Ung thư biểu mô gan
Ung thư máu
Phổ tương tác dị hạt nhân qua
nhiều liên kết
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phổ khối lượng phân giải cao
phun mù điện tử
Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1
liên kết
Ung thư ruột kết người
Nồng độ ức chế 50% đối tượng
thử nghiệm
Một enzyme tạo ra nitric oxide
từ amino L-arginine acid
Ung thư biểu mô người

Ung thư phổi người
Ung thư vú người
Ung thư dạ dày

viii


MTT

PACA-2
PC-3
RPMI

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide
Nuclear Overhauser Enhancement
Spectroscopy
Human Pancreatic Carcinoma
Human Prostate Adenocarcinoma
Roswell Park Memorial Institute

SK-MEL2
SMMC-7721
TLC
TMS
TNF-α
VERO

Melanoma
Human Hepatocellular Carcinoma

Thin layer chromatography
Tetramethylsilane
Tumor necrosis factor alpha
Monkey epitheloid renal

MTT
NOESY

ix

Phổ NOESY
Ung thư biểu mô tuyến tụy người
Ung thư tuyến tiền liệt người
Môi trường nuôi cấy tế bào
RPMI
Ung tư da
Ung thư biểu mô gan
Sắc ký lớp mỏng
(CH3)4Si
Yếu tố hoại tử khối u
Tế bào thường thận khỉ


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các hợp chất ent-kaurane từ chi Annona ................................................................ 4
Bảng 1.2. Các hợp chất acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ......... 8
Bảng 1.3. Các hợp chất acetogenin chứa 1 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ................. 9
Bảng 1.4. Các hợp chất acetogenin chứa 2 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ............... 15
Bảng 1.5. Các hợp chất alkaloid từ chi Annona..................................................................... 19
Bảng 1.6. Các hợp chất amide từ chi Annona ........................................................................ 23

Bảng 1.7. Các hợp chất peptide vòng từ chi Annona ............................................................ 24
Bảng 1.8. Các hợp chất khác từ chi Annona .......................................................................... 26
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo ................................... 55
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 62
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3........................................................................... 66
Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 71
Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và hợp chất tham khảo ................................... 77
Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 6 và hợp chất tham khảo ................................... 79
Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và hợp chất tham khảo ................................... 81
Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và hợp chất tham khảo ................................... 83
Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và hợp chất tham khảo ................................... 84
Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và hợp chất tham khảo ............................... 86
Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và hợp chất tham khảo ............................... 88
Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và hợp chất tham khảo ............................... 90
Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ............................... 92
Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 14 và hợp chất tham khảo ............................... 98
Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 15 và hợp chất tham khảo ............................. 100
Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 16 và hợp chất tham khảo ............................. 101
Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất 17 và hợp chất tham khảo ............................. 103
x


Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất 18 và hợp chất tham khảo ............................. 104
Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất 19 và hợp chất tham khảo ............................. 105
Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................. 106
Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất 21 và hợp chất tham khảo ............................. 108
Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất 22 và hợp chất tham khảo ............................. 109
Bảng 4.23. Thống kê hợp chất phân lập được từ loài na biển............................................. 111
Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và
quả loài na biển (A. glabra) ................................................................................................... 112

Bảng 4.25. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22..................................................... 114
Bảng 4.26. Tác dụng ức chế NO trong đại thực bào ........................................................... 117

xi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona ............................................................ 3
Hình 1.2. Loài na biển (Annona glabra Linn.) ...................................................................... 34
Hình 2.1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của loài na biển (A. glabra) .......................... 38
Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra) ............................................. 47
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane.................................. 48
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước ..................................................... 48
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo ..................................................... 54
Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1 ............................... 56
Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 ............................................................................ 56
Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1.................................................................................. 57
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1................................................................................. 57
Hình 4.6. Phổ DEPT của hợp chất 1....................................................................................... 58
Hình 4.7. Phổ HSQC của hợp chất 1 ...................................................................................... 58
Hình 4.8. Phổ HMBC của hợp chất 1..................................................................................... 59
Hình 4.9. Phổ COSY của hợp chất 1 ...................................................................................... 59
Hình 4.10. Phổ NOESY của hợp chất 1 ................................................................................. 60
Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 60
Hình 4.12. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2............................................... 62
Hình 4.13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2 .......................................................................... 63
Hình 4.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2................................................................................ 63
Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 .............................................................................. 64
Hình 4.16. Phổ HSQC của hợp chất 2.................................................................................... 64
Hình 4.17. Phổ HMBC của hợp chất 2................................................................................... 65

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3 ............. 65
xii


Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3 .......................................................................... 67
Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3................................................................................ 68
Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 .............................................................................. 68
Hình 4.22. Phổ HSQC của hợp chất 3.................................................................................... 69
Hình 4.23. Phổ HMBC của hợp chất 3................................................................................... 69
Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 70
Hình 4.25. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY quan trọng của hợp chất 4 ............. 72
Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 4 .......................................................................... 72
Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4................................................................................ 73
Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 .............................................................................. 73
Hình 4.29. Phổ DEPT của hợp chất 4..................................................................................... 74
Hình 4.30. Phổ HSQC của hợp chất 4.................................................................................... 74
Hình 4.31. Phổ HMBC của hợp chất 4................................................................................... 75
Hình 4.32. Phổ COSY của hợp chất 4.................................................................................... 75
Hình 4.33. Phổ NOESY của hợp chất 4 ................................................................................. 76
Hình 4.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 5 ...................... 76
Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 .......................................................................... 78
Hình 4.36. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 7 ...................... 80
Hình 4.37. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 8 ...................... 82
Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 .......................................................................... 84
Hình 4.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 10 .................... 85
Hình 4.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 11 .................... 87
Hình 4.41. Cấu trúc hóa học của 12 và hợp chất tham khảo................................................. 89
Hình 4.42. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 12 ..................................................... 90
Hình 4.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................................. 91
Hình 4.43. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất 13 ................................. 93

xiii


Hình 4.44. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 13........................................................................ 94
Hình 4.45. Phổ 1H-NMR của hợp chất 13 ............................................................................. 94
Hình 4.46. Phổ 13C-NMR của hợp chất 13 ............................................................................ 95
Hình 4.47. Phổ DEPT của hợp chất 13 .................................................................................. 95
Hình 4.48. Phổ HSQC của hợp chất 13.................................................................................. 96
Hình 4.49. Phổ HMBC của hợp chất 13 ................................................................................ 96
Hình 4.50. Phổ NOESY của hợp chất 13 ............................................................................... 97
Hình 4.51. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 14 .................... 97
Hình 4.52. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 15 .................... 99
Hình 4.53. Cấu trúc hóa học chất 16..................................................................................... 101
Hình 4.54. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 17 .................. 102
Hình 4.55. Cấu trúc hóa học và các tương tác chính của hợp chất 18................................ 103
Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất 19 ...................................................................... 105
Hình 4.57. Cấu trúc hóa học của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................... 106
Hình 4.58. Cấu trúc hóa học của hợp chất 21 ...................................................................... 107
Hình 4.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất 22 ...................................................................... 108
Hình 4.60. Các hợp chất phân lập được từ loài na biển....................................................... 110
Hình 4.61. Mức độ chết theo cơ chế apoptosis của tế bào HL-60 dưới sự tác động của hợp
chất 18 và 22 tại thời điểm 24 h và 48 h ở nồng độ IC50 ..................................................... 115
Hình 4.62. Ảnh hưởng của hợp chất 18 và 22 đến các biểu hiện ở cấp độ protein trên dòng
tế bào HL-60 ở nồng độ IC50 tại 24 h và 48 h ...................................................................... 115

xiv


DANH MỤC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 1 (AGQ30) .......................................................................... II

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 2 (AGQ32) .................................................................... XXII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 3 (AGQ31) ................................................................XXXVI
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 4 (AGQ29) .......................................................................... L
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 5 (AGQ26) ..................................................................LXXII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 6 (AGQ6) ............................................................... LXXVIII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 7 (AGQ2) ................................................................. LXXXII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 8 (AGQ8) ............................................................... LXXXIX
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 9 (AGQ11) ................................................................... XCVI
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 10 (AGQ7) .........................................................................CI
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 11 (AGQ4) ................................................................... CVIII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 12 (AGQ9) .................................................................... CXV
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 13 (AGQ19) ................................................................. CXXI
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 14 (AG3) ...................................................................... CXLI
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 15 (AG1) .................................................................. CXLVII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 16 (AG15) .................................................................... CLIII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 17 (AG2) ..................................................................... CLVII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 18 (AGQ20) ...............................................................CLXIII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 19 (AGQ18) .............................................................. CLXIX
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 20 (AGQ25) ............................................................CLXXIII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 21 (AGQ17) .......................................................... CLXXVII
PHỤ LỤC HỢP CHẤT 22 (AGQ1) ............................................................. CLXXXI
PHỤ LỤC 23: Sắc ký đồ của các dẫn xuất TMS của D-glucose, L-glucose và các
hợp chất ........................................................................................................ CLXXXV
PHỤ LỤC 24: Phổ CD của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................. CLXXXV
PHỤ LỤC 25: Phiếu giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu ...........CLXXXVI

xv


MỞ ĐẦU

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về
những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương đông
mà các nước phương tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Theo thống kê,
ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn
đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt
tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Xu
hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự
quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu
và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp.
Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ
thực vật đa dạng và phong phú. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài
thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Việc
sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con
người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng.
Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn
có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều
loại bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối
hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được
khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng.
Cây na biển (Annona glabra) là loại cây ăn quả và thường được dùng trồng
để chắn sóng ở các vùng ngập mặn. Cây thường được dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ
và làm thuốc sát trùng. Vỏ cây giã ra cũng có công dụng tương tự. Dịch lá cây dùng
để trừ chấy. Hạt nghiền nát có tính làm săn da, sát trùng. Thịt quả lại có vị ngọt mát,
giải nhiệt. Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã công bố trên thế giới cho thấy
loài này chứa nhiều lớp chất quý có cấu trúc độc đáo, đặc biệt là lớp chất
diterpenoid ent-kaurane và acetogenin. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học

1

cho thấy một số hợp chất đã được phân lập từ loài này thể hiện hoạt tính sinh học
rất đáng quan tâm như: hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng
viêm, giảm đau.... Tuy nhiên, hiện có ít công trình khoa học trong nước công bố cả
về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này.
Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của cây na biển (Annona glabra L), chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.)"

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu
của loài na biển (A. glabra). Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng
viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính , làm cơ
sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo
nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho
những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và
góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này.

Nội dung luận án bao gồm:
1. Phân lập các hợp chất từ quả loài na biển (A. glabra) bằng các phương pháp
sắc ký;
2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
vật lý và hóa học;
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được;
4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA)

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona)
Annona là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), gồm các cây bụi, cây gỗ
nhỏ hay lớn, sống hàng năm hay lâu năm. Lá cây dai như da, đôi khi có lông, hoa có
3 đài, xếp van, cuống thường ngắn, hoa lưỡng tính, ở ngoài nách lá đối diện với lá
hoặc trên cành già với một hoa hoặc một cụm có ít hoa. Hoa có 6 cánh, nhị nhiều,
noãn nhiều, lúc đầu rời nhau, khi thành quả thì dính nhau tạo thành một khối nạc.
Bề mặt quả bao phủ bởi các núm, chỗ phình ra có gai hoặc trơn, nhiều hạt. Hạt đen
hoặc nâu, vỏ hạt nhẵn bóng [7].
Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân chi Annona có khoảng 125 loài tìm thấy ở
Trung và Nam Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Úc [1].
Ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ về chi Annona. Theo tác giả
Nguyễn Tiến Bân thống kê và mô tả có 4 loài thuộc chi Annona ở Việt Nam đó là:
A.muricata, A. squamosa, A. reticulata, và A. glabra, trong đó 3 loài chỉ gặp ở dạng
cây trồng [1]. Bốn loài này cũng được mô tả và có thể sử dụng làm thuốc ở nước ta
[4, 47].

Annona muricata L. Annona squamosa L. Annona reticulata L.

Annona glabra L.

Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona
1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona
Theo thống kê, trong số 125 loài thuộc chi Annona có khoảng 21 loài đã
được nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: A. atemoya, A. bullata, A.
cherimolia, A. cornifolia, A. coriacea, A. crassiflora, A. densicoma, A. foetida, A.
3


glabra, A. glauca, A. montana, A. muricata, A. nutans, A. pickelii, A. purpurea, A.
salzmanii, A. sericea, A. senegalensis, A. reticulata, A. rugulosa và A. squamosa.

Thống kê từ các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước và trên thế
giới cho thấy thành phần hóa học chính của chi Annona là các hợp chất diterpenoid
khung kaurane, acetogenin, alkaloid, peptit vòng ….

1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane
Lớp chất diterpenoid ent-kaurane là một trong những lớp chất chính của chi
Annona. Cho đến hiện tại, có khoảng 59 hợp chất diterpenoid ent-kaurane (1-59)
được công bố từ chi Annona (xem Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các hợp chất ent-kaurane từ chi Annona
KH
1
2
3
4
5
6
7

Tên chất
ent-kauran-16α-ol
16β,17-dihydroxy-ent-kaurane
16α,17-dihydroxy-ent-kaurane
ent-kauran-17α-oic acid
ent-kauran-17β-oic acid
annoglabasin F
19-nor-ent-kauran-17β-oic acid

8
9
10

11
12
13

19-nor-ent-kauran-17α-oic acid
annosquamosin B
annosquamosin D
annosquamosin C
annosquamosin E
16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

14

16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

15
16
17

16β-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oic
acid
ent-16,17-diacetoxykauran-19-oic acid
17-hydroxy-16βH-ent-kauran-19-oic acid

18

17-hydroxy-16αH-ent-kauran-19-oic acid

4

Loài
A. cherimola
A. cherimola
A. cherimola
A. glabra
A. glabra
A. glabra
A. glabra
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. glabra
A. cherimola
A. squamosa
A. squamosa
A. glabra
A. cherimola
A. squamosa
A. glabra
A. squamosa
A. senegalensis
A. squamosa
A. cherimola
A. squamosa
A. cherimola

TLTK
[15]
[15]
[15]
[25, 72]
[25, 72]
[36]
[25, 144]
[138]
[138, 144]
[144]
[144]
[144]
[15, 72,
136, 138,
144]
[15, 25, 72,
136, 138]

[25, 72,
144]
[53]
[15, 138,
144]
[15, 138,
144]


21

17-acetoxy-16βH-ent-kauran-19-oic acid
(16R)-17-dimethoxy-ent-kauran-19-oic
acid
16αH-ent-kauran-17,19-dioic acid

22
23
24
25
26

16βH-ent-kauran-17,19-dioic acid
annoglabasin C
16α-methoxy-ent-kauran-19-oic acid
16α -hydroxy-ent-kauran-19-oic acid
ent-kaur-16-en-19-oic acid

27

ent-19-carbomethoxykauran-17-oic acid

28
29
30
31

16αH-ent-kauran-17,19-dimethyl ester
16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid
methyl ester
16βH-19-al-ent-kauran-17-oic acid

16αH-19-al-ent­kauran-17-oic acid

32
33

annoglabasin A
16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al

34
35

16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al
annosquamosin A

36

16βH-17-hydroxy-ent-kauran-19-al

37
38
39

16αH-17-hydroxy-ent-kauran-19-al
16αH-17-acetoxy-ent-kauran-19-al
methyl-16α-hydro-19-al-ent-kauran-17oate
annoglabasin D
16αH-19-al-ent-kauran-17-oic acid
16β-ent-kaurane-16,17,19-triol
16α,17,19- trihydroxy -ent-kaurane
(16R)-ent-kauran-17,19-diol

(16S)-ent-kauran-17,19-diol
annoglabasin E
ent-kaur-16-en-19-ol
annoglabasin G
annoglabasin B
ent-3β-hydroxykaur-16-ene

19
20

40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

5

A. squamosa
A. cherimola

[138]
[15]

A. squamosa
A. glabra
A. squamosa
A. glabra
A. glabra
A. glabra
A. glabra
A. senegalensis
A. squamosa
A. cherimola
A. senegalensis
A. glabra
A. glabra
A. cherimola

[72, 144]

A. squamosa
A. squamosa
A. glabra
A. glabra
A. squamosa
A. glabra
A. squamosa
A. squamosa
A. glabra
A. squamosa
A. glabra
A. glabra
A. glabra

A. glabra

[138]
[72, 144]

A. glabra
A. glabra
A. squamosa
A. squamosa
A. cherimola
A. cherimola
A. glabra
A. squamosa
A. glabra
A. glabra
A. senegalensis

[36]
[25]
[138]
[136]
[15]
[15]
[36, 72]
[25, 138]
[72]
[25, 72, 99]
[53]

[144]

[36]
[36]
[72]
[15, 25, 53,
72, 99,
107, 138,
144]
[53, 99]
[36]
[15]

[25]
[72, 138,
144]
[144]
[25, 138]
[72, 138,
144]
[72]
[72]
[25]


51
52
53
54
55
56
57

58
59

ent-kaur-15-en-17,19-diol
ent-kaur-15-en-19-oic acid
ent-kaur-15-en-17-ol-19-oic acid
annomosin A
annoglabayin
annosquamosin F
annosquamosin G
16α,17,18-trihydroxy-ent-kaurane
ent-15β,16β-epoxy-17-hydroxy-kauran19-oic acid

A. glabra
A. glabra
A. glabra
A. squamosa
A. glabra
A. squamosa
A. squamosa
A. squamosa
A. glabra

[25]
[72]
[72, 99]
[144]
[31]
[144]
[144]

[136]
[99]

R2
R3
R1

KH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

23
24
25

R1

R2

R3

CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OCHO
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH

COOH
COOH
COOH
COOH
COOH

CH3
OH
CH2OH
H
COOH
COOCH3
COOH
H
OH
OAc
CH2OH
OH
OH
CH2OH
OH
CH2OAc
H
CH2OH
H
H
COOH
H
COOCH3
CH3

CH3

OH
CH2OH
OH
COOH
H
OAc
H
COOH
CH2OH
CH2OH
H
CH2OAc
CH2OH
OH
CH2OAc
OAc
CH2OH
H
CH2OAc
CH(OCH3)2
H
COOH
OAc
OCH3
OH

KH
26

27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49

6

R1

R2

COOH
COOCH3
COOCH3
COOCH3
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OAc
CH2OAc

=CH2
COOH
COOCH3
CH2OH
H

COOH
OAc
OH
CH2OH
OH
H
CH2OH
CH2OAc
COOCH3
COOCH3
COOH
OH
CH2OH
H
CH2OH
COOH
=CH2
CHO
COOH

R3
H
H
OH
COOH
H
COOCH3
CH2OH
OH
CH2OAc

CH2OH
H
H
H
OAc
H
CH2OH
OH
CH2OH
H
H
H
H


R2

R2
R1
51 CH2OH CH2OH
52 COOH CH3
53 COOH CH2OH

HO
R1

50

R2

H

H

R3

O
O
HOO

CHO

OH

H

OH

R2 R3
56 OHCH2OAc
57 OHCH2OH
OH

OH

COOH

HO

CHO

54

O

58

55

59

1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin
Ngoài các hợp chất diterpenoid khung ent-kaurane, các hợp chất acetogenin
cũng được phát hiện là thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Annona.
Acetogenin là một lớp chất tự nhiên quan trọng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
như ức chế sự phát triển của tế bào ung thư diệt côn trùng, kháng ký sinh trùng sốt
rét, trị giun sán, kháng virus. Những hợp chất này có đặc trưng là chuỗi alkyl dài
(32 hoặc 34 nguyên tử cacbon), kết thúc bằng một vòng γ-lactone và có các nhóm
như tetrahydrofuran, epoxide, hydroxyl, vv .. Có khoảng 183 hợp chất acetogenin
được phân lập từ 17 loài thuộc chi Annona (A. atemoya, A. bullata, A. cherimolia,
A. cornifolia, A. coriacea, A. crassiflora, A. densicoma, A. glabra, A. glauca, A.
montana, A. muricata, A. nutans, A. purpurea, A. salzmanii, A. senegalensis, A.
reticulata và A. squamosa).
1.1.2.2.1. Các acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran
Thống kê cho thấy đã có 29 hợp chất acetogenin (60-88) không chứa vòng
tetrahydrofuran được phân lập từ 6 loài A. atemoya, A. coriacea, A. montana, A.
muricata, A. nutans và A. reticulata (xem Bảng 1.2).

7

Bảng 1.2. Các hợp chất acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran từ chi Annona
KH
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72

Tên chất
murihexol
donhexocin
(+) monhexocin
(-) monhexocin
reticulatamol
reticulatamone
artemoin A
artemoin B
artemoin C
artemoin D
cohibin A
cohibin B

cohibin C

73

cohibin D

74
75
76
77
78
79
80
81

muridienin I
muridienin II
muridienin III
muridienin IV
muricadienin
montecristin
coriadienin
chatenaytrienin I

82

chatenaytrienin II

83

chatenaytrienin III

84
85
86
87
88

chatenaytrienin IV
epoxymurin A (epomuricenin A)
epomuricenin B
epoxymurin B
sabadelin
M

OH

threo

threo

OH

OH

OH

34

4

O

32
19

15

11

10
3

OH

Loài
A. muricata
A. muricata
A. montana
A. montana
A. reticulata
A. reticulata
A. atemoya
A. atemoya
A. atemoya
A. atemoya
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. nutans

A. muricata
A. nutans
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. coriacea
A. nutans
A. muricata
A. nutans
A. muricata
A. nutans
A. muricata
A. nutans
A. muricata
A. muricata
A. muricata
A. muricata

1

5

OH

[61]
[61]
[60]

[60]
[60]
[59]
[100]
[60]
[60]
[60]
[60]
[67, 116]
[116]
[67]
[58]

20 19

OH
16

OH

OH

8

1
4

O

OH

62 (+)
63 (-)

60 M =erythro
61 M =threo

OH

9

15
5

10

O

[57]

threo

OH
32

TLTK
[145]
[145]
[88]
[88]

[122]
[19]
[24]
[24]
[24]
[24]
[56]
[56]
[57]

O