Hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn th ơng hàn đa kháng thuốc

bộ Y tế
___________________________________________________________________

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ

hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để Chẩn
đoán và theo dõi vi khuẩn thơng hàn
đa kháng thuốc

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Lê Văn Phủng

Cơ quan chủ trì

Trờng đại học Y Hà Nội

Cơ quan chủ quản

Bộ Y tế

6057
01/9/2006

Năm 2006


Lời cảm ơn
Thay mặt nhóm nghiên cứu, tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp
ở các cơ sở sau đây, đã giúp đỡ nhiệt tình và vô t để công trình có thể hoàn
thành: Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, bệnh viện Trung ơng Huế (Thừa Thiên

Huế) và bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội); Labo trung tâm Y sinh học, Bộ môn
Vi sinh Y học, Phòng NCKH, Phòng Tài vụ (ĐHY Hà Nội); Vụ Khoa học-Đào
tạo (Bộ Y tế).

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Lê Văn Phủng

2


Những chữ viết tắt
PCR

Polymerase Chain Reaction

RIA

Radioimmunoassay (Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ)

IHA

Indirect Haemaglutination (Ngng kết hồng cầu gián tiếp)

CHL

Chloramphenicol

MIC

Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

NAL

Nalidixic Acid

CAT

Chloramphenicol Acetyltransferase

Cat

Gen cat

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

CTP

Cytosine triphosphate

GTP

Guanosine triphosphate

TTP

Thymidine triphosphate

Taq

Thermus aquaticus

TAE

Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE)

EMBL

European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh học
phân tử châu Âu)

DDBJ

DNA Data Bank of Japan (Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản)

NCBI

National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin
sinh học Quốc gia, Mỹ)

3


Những ngời thực hiện

TT

Họ và tên

Học hàm, học vị
chuyên môn

Cơ quan

1

Lê Văn Phủng

PGS. TS, Vi sinh vật

Đại học Y Hà Nội

2

Nguyễn Trọng Tuệ

ThS, Sinh học

Đại học Y Hà Nội (Th ký)

3

Phạm Thanh Tân

BS, Đa khoa

Đại học Y Hà Nội (Th ký tài chính)

4

Bùi Khắc Hậu

PGS. TS, Vi sinh vật

Đại học Y Hà Nội

5

Trần Hồng Vân

BS, Đa khoa

Đại học Y Hà Nội

6

Cao Văn Viên

PGS. TS, Truyền
nhiễm

Viện các bệnh truyền nhiễm và
Nhiệt đới Quốc gia

7

Nguyễn
Liên

8

Phan Văn Bé Bảy

BS, Vi sinh vật

Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp

9

Lê Thị Phợng

BS, Truyền nhiễm

Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp

Thị

Nam ThS, Vi sinh vật

4

Bệnh viện trung ơng Huế


Mục lục

Nội dung

Trang

Phần A: Tóm tắt các kết quả nghiên cứu nổi bật.....................7
1. Đóng góp mới của đề tài ..........................................................................................................................................7
2. áp dụng vào thực tiễn .................................................................................................................................................7
3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng đã đợc phê duyệt .................7
4. ý kiến đề xuất ......................................................................................................................................................................7
Phần B: báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu ....................................8
Đặt vấn đề ...........................................................................................................................................................................8
Chơng 1: Tổng quan ....................................................................................................................................................9
1.1. Tình hình bệnh thơng hàn trên thế giới và trong nớc .....................................9
1.1.1. Bệnh thơng hàn trên thế giới .................................................................................................................9
1.1.2. Bệnh thơng hàn trong nớc .....................................................................................................................10
1.2. Salmonella .........................................................................................................................................................................11
1.2.1. Phân loại và danh pháp....................................................................................................................................11
1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên ...................................................................................................................................12
1.2.3. Vật liệu di truyền ...................................................................................................................................................12
1.3. Các phơng pháp chẩn đoán bệnh thơng hàn ...............................................................12
1.3.1. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ......................................................................................................................12
1.3.2. Huyết thanh học ......................................................................................................................................................14
1.3.3. Kỹ thuật sinh học phân tử ............................................................................................................................14
1.4. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn thơng hàn ........................................................15
Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu ........................................18
2.1. Đối tợng nghiên cứu

...........................................................................................................................................

18

2.2. Vật liệu, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu ...................................................................................18
2.3. Phơng pháp nghiên cứu ....................................................................................................................................19
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu ..........................................................................................................................22
3.1. Thiết kế mồi .....................................................................................................................................................................22
3.2. Kết quả PCR đa mồi với các chủng Salmonella mẫu ........................................................25
5


3.3. Kết quả tối u phản ứng PCR đa mồi ..................................................................................................27
3.4. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi

......................................................................................

31

3.5. Theo dõi sự hiện diện của vi khuẩn thơng hàn trong máu .......................................32
3.6. Phản ứng chéo .................................................................................................................................................................33
3.7. Kháng kháng sinh của Salmonella và gen cat ...........................................................................34
Chơng 4: Bàn luận ..........................................................................................................................................................36
4.1. Bộ mồi cho PCR đa mồi chẩn đoán bệnh thơng hàn ......................................................36
4.2. Tối u các điều kiện phản ứng PCR đa mồi .................................................................................37
4.3. Độ nhạy của phản ứng PCR ............................................................................................................................38
4.4. Độ đặc hiệu và phản ứng chéo của phản ứng PCR ...............................................................39
4.5. Về khả năng phát hiện đa đề kháng thông qua gen cat ..................................................40
4.6. Về khả năng theo dõi bệnh thơng hàn của PCR đa mồi .............................................41
Kết luận ..................................................................................................................................................................................42
Kiến nghị ................................................................................................................................................................................42
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................................................43
Phụ lục

6


Phần A: Tóm tắt các kết quả nghiên cứu nổi bật
1. Đóng góp mới của đề tài
- áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán căn nguyên gây
bệnh thơng hàn. Kỹ thuật này có u điểm là độ nhạy và đặc hiệu cao, thời
gian xét nghiệm ngắn hơn so với các kỹ thuật khác, có khả năng phát hiện
đợc 4 loài vi khuẩn thơng hàn trong một lần xét nghiệm; lợng bệnh phẩm
cần ít (chỉ bằng 1/10 so với cấy máu). Vì vậy, bệnh đợc chẩn đoán sớm hơn
trớc.
- Phát hiện khả năng đa kháng thuốc của vi khuẩn thơng hàn cùng
một lúc với chẩn đoán căn nguyên. Điều này phục vụ cho điều trị đúng sớm
hơn, không cần thời gian chờ đợi làm kháng sinh đồ.
- Tiên lợng bệnh tốt hơn do biết sớm đợc đa đề kháng hay không và
theo dõi đợc hiện diện của vi khuẩn trong máu sẽ điều chỉnh đợc kháng sinh
đang sử dụng.
- Đa kỹ thuật giải trình tự gen, áp dụng lần đầu tiên, vào trờng
ĐHY Hà Nội; góp phần nâng cao chất lợng đào tạo và nghiên cứu khoa học
của Trờng.
- Góp phần đào tạo sinh viên với việc đa sinh viên tiếp cận các kỹ
thuật cao, mới trên thế giới.
2. áp dụng vào thực tiễn
- Chẩn đoán sớm bệnh thơng hàn hoặc phát hiện vi khuẩn thơng
hàn ngoài môi trờng (nớc, thực phẩm).
-

Phát hiện sớm khả năng đa đề kháng của vi khuẩn thơng hàn.

3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng đã đợc phê duyệt
- Đề tài đã hoàn thành tốt tất cả các nội dung đã đợc phê duyệt trong
đề cơng: đa đợc ra quy trình thực hiện phản ứng PCR đa mồi, có 2 tính
năng tốt: 1) phát hiện đợc 4 loài vi khuẩn thơng hàn thờng gặp ở nớc ta và
2) phát hiện đợc khả năng đa đề kháng của căn nguyên gây bệnh.
-

Đã đào tạo 1 sinh viên đại học và 2 cao học.

4. ý kiến đề xuất
- Phổ biến rộng rãi kết quả nghiên cứu để áp dụng cho ngời bệnh,
kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm, giám sát chất lợng nớc ngoài môi
trờng; giám sát đa kháng thuốc kháng sinh.

7


Phần B: báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu
Đặt vấn đề
Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, bệnh thơng hàn (typhoid
fever) và phó thơng hàn (paratyphoid fever) vẫn đang là vấn đề sức khoẻ quan
trọng ở nhiều nớc trên thế giới, đặc biệt là các nớc đang phát triển. Khu vực
đông-nam châu á và châu Phi là những vùng có dịch thơng hàn lu hành và
là một trong những vấn đề y tế nan giải hiện nay.
Vấn đề thơng hàn càng trở nên trầm trọng hơn do hiện nay đã xuất hiện
và lan tràn rất nhanh các chủng vi khuẩn thơng hàn đa đề kháng, làm cho
điều trị khó khăn hơn nhiều và những biến chứng trầm trọng hơn (thủng ruột)
có thể xuất hiện do chẩn đoán chậm và điều trị đặc hiệu không kịp thời.
Các phơng pháp thông thờng chẩn đoán bệnh thơng hàn đòi hỏi 4-6
ngày trong trờng hợp dơng tính và 7 ngày trong trờng hợp xác định âm

tính. Vì vậy, đã không đáp ứng đợc yêu cầu cấp bách của điều trị thơng hàn.
Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR bổ sung
cho các kỹ thuật chẩn đoán kinh điển. Kỹ thuật này cho kết quả nhanh hơn và
độ nhạy cũng cao hơn rất nhiều. Tuy vậy, các công trình này đều chỉ tập trung
vào phát hiện S. typhi hoặc S. paratyphi A bằng các phản ứng riêng lẻ và
không phát hiện đợc khả năng đa đề kháng của chúng. Điều đó gây tốn kém
và không đáp ứng đợc nhu cầu của điều trị.
Việc tăng phổ phát hiện của PCR đối với các Salmonella khác (S.
paratyphi B và S. paratyphi C chẳng hạn) và phát hiện sơ bộ khả năng đa đề
kháng của chúng là cần thiết cho việc điều trị có hiệu quả cao hơn hiện nay.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Hoàn chỉnh hệ thống
PCR đa mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn thơng hàn đa kháng thuốc
nhằm 02 mục tiêu:
1. Phát triển hệ thống PCR mới, đa mồi để phát hiện các Salmonella gây
bệnh thơng hàn thờng gặp ở nớc ta.
2. Bớc đầu đánh giá độ nhạy, đặc hiệu và phản ứng chéo của PCR nói
trên trong chẩn đoán bệnh thơng hàn và theo dõi sự hiện diện của vi khuẩn
thơng hàn đa kháng thuốc trong máu.

8


Chơng 1: Tổng quan
1.1. Tình hình bệnh thơng hàn trên thế giới và trong nớc
1.1.1. Bệnh thơng hàn trên thế giới
Bệnh thơng hàn hiện nay tập trung chủ yếu ở các nớc đang phát triển;
tuy vậy, ở các nớc phát triển vẫn có các trờng hợp bệnh lẻ tẻ do ngời nhập
c, du lịch hoặc những ngời có công việc phải đi lại với các nớc đang lu
hành bệnh. Vì vậy, bệnh thơng hàn không những vẫn là vấn đề y tế quan
trọng ở các nớc đang phát triển mà vẫn còn là vấn đề phải đợc quan tâm ở

tất cả các nớc trên thế giới.
Theo Edelman và cộng sự [1], năm 1984 số bệnh nhân mắc bệnh thơng
hàn là 12,5 triệu ngời. Đến năm 1997, Hội nghị quốc tế về bệnh thơng hàn
tại Indonesia và năm 1999 tại Đài loan đã thông báo, hàng năm có khoảng 33
triệu ngời mắc, trong đó khoảng 1,5 triệu ca tử vong [2]. Nh vậy, thời gian
gần đây, tình hình mắc bệnh thơng hàn trên thế giới tăng lên.
Tại Cộng hoà dân chủ Congo, một vụ dịch thơng hàn lớn dã xảy ra từ
ngày 27/9/2004 đến 1/2005 với 42.564 trờng hợp mắc bệnh, 214 ca chết trong
tổng số 696 trờng hợp viêm phúc mạc và thủng ruột (WHO, 2006) (WWW.
who.int/vaccine_rearch/diseases/diarrhoeal/en/).
Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới [3], tình hình mắc bệnh thơng
hàn ở một số khu vực trên thế giới nh sau:
Bảng 1. Tình hình mắc và tử vong do bệnh thơng hàn trên thế giới
Khu vực

Tỷ lệ mắc
(/100.000 dân)

Số mắc

Châu Phi

500

2.655.000

130.000

Châu á

500

13.310.000

440.000

Nam Mỹ

150

595.000

10.000

Châu Đại dơng

150

7.500

124

2

22.620

74

16.590.120

580.198

Các nớc phát triển
Tổng

Số chết

Nh vậy, châu á vẫn là khu vực có bệnh thơng hàn trầm trọng nhất. Một
thống kê dới đây cho thấy rõ hơn tình hình này ở các quốc gia cụ thể:

9


Bảng 2. Tình hình bệnh thơng hàn trong khu vực Đông Nam châu á
Tỷ lệ mắc/105 dân

Tỷ lệ chết/mắc
(%)

Toàn khu vực

15,44

0,34

Thái Lan

22,25

0,17

Indonesia

11,04

0,56

Myanma

37,72

0,71

Singapore

5,9

0,8

Nớc

Có thể thấy, một lần nữa qua số liệu nêu trên, bệnh thơng hàn đồng hành
cùng điều kiện vệ sinh môi trờng và trình độ phát triển chung của xã hội.
ở các nớc đang phát triển khác, bệnh thơng hàn vẫn đang gia tăng: ấn
độ, Pakistan, Bangladesh, Trung Quốc, Nepal; ở Trung và Nam Phi nh Chi
Lê, Peru, Mehico; châu Phi nh Nigeria, Madagasca tỷ lệ mắc lên tới
810/100.000 dân [4].
Thơng hàn cũng đợc ghi nhận với mức độ gia tăng tại các nớc phát
triển nh Mỹ, Pháp, Anh, Thuỵ Sỹ; gần đây, là Nga, CH Séc, Tajikistan và đặc
biệt là đã có 2 vụ dịch thơng hàn xảy ra do cuộc chiến tranh sắc tộc kéo dài

giữa Bosnia và Hersegovia [5].
Tóm lại, bệnh thơng hàn vẫn là vấn đề y tế lớn ở các nớc đang phát
triển và vẫn là mối quan tâm của tất cả các nớc trên thế giới vì khả năng giao
lu thuận tiện hiện nay.
1.1.2. Bệnh thơng hàn trong nớc
Bệnh thơng hàn ở nớc ta đợc ghi nhận là trầm trọng kể từ đầu thập kỷ
90. Năm 1992, một vụ dịch thơng hàn đã xảy ra ở Bỉm Sơn (Thanh Hoá) với
31 trờng hợp đã đợc ghi nhận [6]. Năm 1995, một vụ dịch thơng hàn lớn đã
xảy ra ở Kim Sơn (Ninh Bình), sau đó lan ra các tỉnh thành khác [7-9]. Năm
1998, dịch lớn đã xảy ra ở Lai Châu với tỷ lệ mắc 284,54/100.000 dân [10].
ở miền Trung, từ năm 1990 - 1994 có 1.453 trờng hợp mắc (Nguyễn
Đình Sơn và CS); năm 1996 đã xảy ra dịch lớn ở Thừa thiên - Huế, sau đó là
Quảng Nam, Ninh Thuận và một số tỉnh khác [11-14].
ở miền Nam, từ năm 1990-1994 đã ghi nhận 55.397 trờng hợp mắc
thơng hàn, tỷ lệ mắc và chết tăng dần, đỉnh cao là năm 1995 với sự xuất hiện
các chủng Salmonella typhi đa kháng [15-17]. Trong vòng 18 năm (19811998), tại 19 tỉnh thành phía Nam, có 123.651 trờng hợp mắc bệnh, trong đó
có 70 trờng hợp tử vong (Phạm Kim Sắc và CS) [18].
Theo thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng [10], tỷ lệ mắc bệnh
thơng hàn trên 100.000 dân nh sau:
10


Bảng 3. Tỷ lệ mắc bệnh thơng hàn từ năm 1991-1999 (/100.000 dân)
Địa phơng

1991

1994

1995

1996

1997

1998

1999

Miền Bắc

8,2

2,86

32,6

40,1

30,9

32,3

26,7

Miền Trung

25,2

103,2

116

121,1

125

152,1 136,8

Miền Nam

58,4

69,6

71,9

63,6

68,2

72,8

Tây Nguyên

-

196,6 232,2

336

330,8 252,1 245,6

Cả nớc

26,4

58,8

68,9

67,3

71

64,4

59
56,8

Nh vậy, miền Trung và Tây nguyên là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh
cao nhất trong cả nớc.
Theo tài liệu của Bộ Y tế [15], từ năm 1991 đến tháng 3/1999, có 152.405
trờng hợp mắc bệnh; trong số đó, có 112 trờng hợp tử vong; phân bố cụ thể
nh sau:
Bảng 4. Số mắc và chết do thơng hàn từ 1991-3/1999
Năm

1991

Mắc

7.597 9.209

Chết

12

1992

10

1993

1994

1995

1996

14.069

20.539

30.901

27.394

12

8

23

15

1997

1998

19.397 20.815
18

13

3/1999

Tổng

2.484

152.405

1

112

Tại Đồng Tháp, cũng trong khoảng thời gian nh trên, tổng số mắc là
15.395, tử vong 26 trờng hợp. Đặc biệt, bệnh viện đa khoa Tỉnh cho biết, từ
tháng 4/1997 - 4/1998 đã điều trị 778 trờng hợp thơng hàn, trong đó 26

trờng hợp có biến chứng thủng ruột [16].
Nh vậy, bệnh thơng hàn ở nớc ta vẫn trong tình trạng trầm trọng và có
thể bùng phát dịch dễ dàng nếu không quan tâm đầy đủ đến dây chuyền dịch
tễ học của bệnh, trong đó có việc chẩn đoán sớm, chẩn đoán chính xác và điều
trị kịp thời, đúng đắn. Vì nếu không, đây sẽ là nguồn gieo rắc mầm bệnh ra
cộng đồng và trong bối cảnh vệ sinh môi trờng cha đảm bảo nh nớc ta,
việc ô nhiễm nguồn nớc và thực phẩm, dẫn đến gây dịch, là khả năng có thể
xảy ra bất cứ lúc nào.
1.2. Salmonella
1.2.1. Phân loại và danh pháp
- Phân loại:
Phân loại Salmonella rất phức tạp. Giống Salmonella thuộc họ vi khuẩn
đờng ruột (Enterobacteriaceae). Gần đây (7/12/2005), ngời ta cho rằng,
giống Salmonella chỉ có 2 loài: Salmonella bongori và Salmonella enterica.
Loài S. enterica có 6 loài phụ:
1. enterica, 2. salamae, 3a. arizonae, 3b. diarizonae, 4. houtenae,
5. obsolete (nay là bongori), 6. indica.
11


Trên 99,5% các Salmonella gây bệnh cho ngời thuộc loài phụ enterica.
Cách phân loại này phản ánh chính xác hơn các cách phân loại trớc đây
về mối liên quan di truyền giữa các thành viên trong giống.
- Danh pháp:
Danh pháp chính xác của Salmonella typhi là Salmonella enterica
subspecies enterica serovar Typhi; S. paratyphi A là Salmonella enterica
subspecies enterica serovar Paratyphi A; tơng tự nh vậy đối với S. paratyphi
B và C.
Tuy vậy, do tính chất phức tạp và không thực tế của danh pháp chính
thống, hiện nay, ngời ta vẫn dùng theo thói quen cũ là Salmonella typhi

(đúng ra, phải viết là Salmonella Typhi ); và cũng nh vậy đối với các
Salmonella paratyphi A, B và C.
1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên
Giống nh các Enterobacteriaceae khác, Salmonella có 3 loại kháng
nguyên cơ bản: O, H và K.
Kháng nguyên O đợc chia thành các nhóm, mỗi nhóm có nhiều yếu tố
kháng nguyên khác nhau.
Kháng nguyên H có 2 pha: 1 và 2.
Kháng nguyên K là Vi.
Mỗi Salmonella mang các yếu tố kháng nguyên O, H khác nhau; tạo ra
rất nhiều týp huyết thanh (hiện tại có trên 2000) [19].
Công thức kháng nguyên:
S. typhi
9, 12[Vi]: d, S. paratyphi A
2, 12: a: 1, 5
S. paratyphi B
4, 5: b: 1, 2
S. paratyphi C
6, 7[Vi]: c: 1, 5
Dựa vào các yếu tố kháng nguyên đặc hiệu này, ngời ta đã tìm đến các
gen mã hoá cho chúng; dùng các trình tự đặc hiệu cho từng loài để thiết kế
mồi cho PCR.
1.2.3. Vật liệu di truyền
Ngoài chromosome mã hoá cho các kháng nguyên O, H và Vi,
Salmonella có thể chứa các plasmid khác nhau; trong đó hay gặp nhất là các
plasmid kháng thuốc hoặc plasmid chịu trách nhiệm về các đặc tính chuyển
hoá khác, thờng đợc dùng trong định loại vi khuẩn (ví dụ nh lên men
đờng lactose, sucrose) (Le Minor et al, 1973, 1974). Các Salmonella còn
chứa các phage ôn hoà (template phage), các phage này chịu trách nhiệm về
các biến đổi kháng nguyên thờng gặp ở nhiều loài Salmonella khác nhau

(Bergey Manual, 1984).
12


1.3. Tình hình nghiên cứu các phơng pháp chẩn đoán bệnh thơng hàn
1.3.1. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn có giá trị khẳng định bệnh. Tuy vậy, tỷ lệ phân lập
đợc vi khuẩn không cao, nhất là các trờng hợp bệnh nhân đến muộn.
- Cấy máu: trong các bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn thơng
hàn, máu là bệnh phẩm thờng dùng nhất. Tỷ lệ phân lập đợc Salmonella từ
máu trong tuần đầu của bệnh khoảng 70-80%, sau đó giảm dần xuống 60 và
40% vào tuần thứ 2 và 3. Tuy vậy, rất ít khi gặp bệnh nhân vào viện ngay tuần
đầu của bệnh.
- Cấy tuỷ xơng: cho kết quả nhanh và tỷ lệ dơng tính cao nhất
(90%) [20, 21]. Tuỷ xơng đặc biệt hữu ích trong những trờng hợp bệnh nhân
đã điều trị dở dang ở tuyến trớc, khi mà trong máu, lợng vi khuẩn đã giảm
nhng vì Salmonella là loại vi khuẩn ký sinh nội bào, nên trong tuỷ xơng (hệ
thống lới nội mô, chúng tồn tại bên trong tế bào) chúng tránh đợc tác động
của nhiều loại kháng sinh. Tuy vậy, kỹ thuật lấy bệnh phẩm rất phức tạp.
- Cấy phân: tỷ lệ dơng tính rất thấp (<10%) trong giai đoạn đầu của
bệnh nhng tăng dần lên trong những tuần sau do vi khuẩn đợc đào thải ra
ngoài qua đờng mật. Tuy vậy, cấy phân dơng tính với Salmonella cha
khẳng định đợc bệnh nhân đang mắc bệnh thơng hàn vì có tình trạng ngời
lành mang vi khuẩn.
- Cấy đào ban: có nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ dơng tính tới 63% [20].
Tuy vậy, không phải bệnh nhân thơng hàn nào cũng xuất hiện đào ban và kỹ
thuật lấy bệnh phẩm từ đào ban cũng khó khăn.
- Cấy nớc tiểu: tỷ lệ dơng tính thấp (7%) [20] và thờng là dơng
tính trong giai đoạn muộn của bệnh vì vi khuẩn đã gây nhiễm khuẩn huyết, sau
đó mới đợc đào thải ra ngoài qua đờng tiết niệu.

- Cấy dịch mật, dịch tá tràng: tỷ lệ dơng tính thấp, muộn, lấy bệnh
phẩm khó khăn.
- Cấy kết hợp nhiều loại bệnh phẩm: kết hợp cấy máu, cấy tuỷ xơng,
cấy dịch mật cho tỷ lệ dơng tính cao hơn [22]. Tuy vậy, điều này khó thực
hiện khi phải đối mặt, cùng một lúc, với nhiều bệnh nhân trong vụ dịch.
Hoffman và CS đã nghiên cứu trên 154 bệnh nhân thơng hàn, cho thấy
tỷ lệ phân lập đợc S. typhi từ các loại bệnh phẩm, lần lợt nh sau: tuỷ xơng
85,6%; dịch tá tràng 57,6%; máu 54,2% và phân 35,6% [22].
Tại bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, trong số 778 bệnh nhân đợc nhận vào
điều trị thờng hàn, có 268 trờng hợp cấy máu dơng tính với S. typhi, tỷ lệ
dơng tính là 43,4% [16].
u điểm của phơng pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn là cho chẩn đoán
xác định (đặc hiệu) và có vi khuẩn để làm kháng sinh đồ một cách chính xác;
13


nhng nhợc điểm cơ bản của nó là cho kết quả chậm, thờng là từ 3 - 5 ngày;
và tỷ lệ dơng tính không cao (kém nhạy). Chính vì vậy, tìm kiếm thêm các
biện pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao là nhu cầu cần thiết.
1.3.2. Huyết thanh học
- Phản ứng Widal: đây là phản ứng ngng kết trực tiếp, đã đợc áp
dụng từ lâu (hơn 80 năm nay). Đến nay, vẫn còn đợc áp dụng ở nhiều nớc
đang phát triển [23-25] vì kỹ thuật đơn giản và giá thành thấp. Giá trị của nó
chủ yếu phục vụ cho các nghiên cứu hồi cứu về dịch tễ học; giá trị phục vụ
chẩn đoán bệnh hạn chế vì cho kết quả chậm (sau mắc bệnh từ 1-2 tuần trở
lên). Mặc khác, phản ứng này cũng dơng tính trong những trờng hợp đã
dùng vacxin, cũng nh phản ứng chéo với một số kháng nguyên của các
Enterobacteriaceae khác [26, 27].
- ELISA: có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn Widal [28] nhng không ổn
định (52 - 95%, tuỳ theo tác giả và loại bệnh phẩm).

- RIA, IHA: có độ nhạy và đặc hiệu khá cao nhng chỉ làm đợc ở một
số ít cơ sở có điều kiện trang thiết bị tốt [4, 29, 30].
Nhợc điểm của các phơng pháp huyết thanh học là đều cho kết quả
chậm (do phải có thời gian để cơ thể hình thành kháng thể), vì vậy giá trị phục
vụ cho điều trị không cao.
1.3.3. Kỹ thuật sinh học phân tử
- Kỹ thuật PCR: Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu dùng
kỹ thuật PCR bổ sung cho các kỹ thuật chẩn đoán kinh điển [31, 32]. Kỹ thuật
này cho kết quả nhanh hơn, độ nhạy cũng cao hơn rất nhiều [33] và đã đợc áp
dụng không những cho ngời mà còn cho động vật [34] hoặc cho giám sát thực
phẩm [35-37] và giám sát môi trờng [38-40]. Tuy vậy, các công trình này đều
chỉ tập trung vào phát hiện S. typhi hoặc S. paratyphi A bằng các phản ứng
riêng lẻ và không phát hiện đợc khả năng đa đề kháng của chúng [41-43].
Điều đó gây tốn kém và không đáp ứng đợc nhu cầu của điều trị.
Để có thể khuyếch đại đặc hiệu đợc đoạn gen đặc trng cho từng loài
Salmonella, các tác giả thờng tập trung khai thác các gen mã hoá cho các
kháng nguyên đặc hiệu của chúng. Hashimoto và CS [32] dựa vào gen mã hoá
cho kháng nguyên Vi, vì cho rằng, ngoài S. typhi, chỉ một số ít vi khuẩn
(Citrobacter freundii chẳng hạn) sản xuất kháng nguyên này; còn Hirose và
CS [41] lại dựa vào các gen mã hoá cho kháng nguyên lông (H) và các gen mã
hoá cho các enzym đặc hiệu trong quá trình sinh tổng hợp kháng nguyên thân
(O).
Về loại hình PCR, nhiều loại PCR đã đợc áp dụng: PCR đơn mồi [44],
đa mồi [45-47] hoặc định lợng [31, 48-50]. Mỗi loại PCR có những u, nhợc
điểm của nó; tuỳ theo từng trờng hợp cụ thể mà áp dụng cho phù hợp. Trong
chẩn đoán bệnh thơng hàn, xu thế hiện nay là dùng PCR đa mồi với kỹ thuật
Real-Time [31, 49, 50].
14

Tuy vậy, ở nớc ta, việc ứng dụng những tiến bộ nh trên còn chậm. Đã
có nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cho mục đích này (Lê Huy Chính và CS,
2000). Tác giả cho rằng, vì PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (hàng trăm
lần cao hơn các phơng pháp thông thờng), thời gian cho kết quả nhanh hơn
nhiều (5-6 giờ) so với các phơng pháp chẩn đoán khác (4-6 ngày) nên ứng
dụng nó trong chẩn đoán bệnh thơng hàn là rất giá trị. Tuy vậy, đây mới chỉ
là nghiên cứu thử nghiệm với 1 loại Salmonella (S. typhi), không áp dụng đợc
cho các loại Salmonella khác và đặc biệt là không có khả năng phát hiện đa đề
kháng.
Trong tầm hiểu biết của chúng tôi, ở nớc ta, cha thấy có báo cáo về
việc áp dụng thành công kỹ thuật PCR đa mồi nào trong chẩn đoán bệnh
thơng hàn. Hơn nữa, mặc dù S. typhi có tỷ trọng lớn nhất trong tất cả các căn
nguyên gây bệnh thơng hàn, nhng ở nớc ta vẫn gặp các loài Salmonella
khác nh S. paratyphi A, B và C [6-12, 14, 15, 18, 51-54]. Chính vì vậy, ứng
dụng những nghiên cứu trên thế giới về PCR chẩn đoán S. typhi không thôi là
cha đủ trong thực tế bệnh lý ở nớc ta [51].
Làm thế nào để có thể phát hiện đợc các loại Salmonella gây bệnh
thờng gặp ở nớc ta và phát hiện khả năng đa đề kháng của chúng trong 1
phản ứng PCR duy nhất, nhằm giảm tối thiểu thời gian chẩn đoán xác định
bệnh, định hớng cho điều trị và có khả năng chấp nhận đợc (về mặt kinh tế)
khi làm đi làm lại nhiều lần, nhằm theo dõi và đánh giá nhanh chóng hiệu quả
của điều trị?
Đó là những vấn đề cần thiết hiện nay và cũng chính là mục tiêu cần giải
quyết của nghiên cứu này.
1.4. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn thơng hàn
Salmonella typhi đa kháng thuốc không còn là câu chuyện hiếm trên thế
giới [55-58]. Kháng 6 kháng sinh (amoxicillin, chloramphenicol,
streptomycin, spectinomycin, sulfonamides và tetracycline (đa đề kháng kiểu
ACSSpSuTe; viết tắt theo thứ tự từng kháng sinh) là 48,8%.
Dòng DT104 có kiểu cách đa đề kháng ACSSpSuTe là 83,2%, trong đó

có cả chủng sản xuất -lactamase phổ rộng (Extended-spectrum betalactamase, ESBL) loại TEM-52 (0,3%) với MIC của ciprofloxacin rất cao (>
32 àg/ml) [55].
Trong các kiểu đa đề kháng đã công bố, kiểu nào cũng thấy có mặt
chloramphenicol [59-72].
Salmonella paratyphi A, B và C cũng kháng nhiều kháng sinh, trong đó
có cả ciprofloxacin (MIC > 4 àg/ml) và nalidixic acid (NAL) [73].
Tình hình kháng fluoroquinolone ngày càng trầm trọng và gây quan ngại
lớn cho điều trị thơng hàn trong tơng lai, vì cho đến nay, nhóm kháng sinh
15


này vẫn là nhóm chủ đạo trong điều trị các vi khuẩn thơng hàn đa kháng
thuốc [74-76].
ở nớc ta, các chủng vi khuẩn thơng hàn đa đề kháng đã xuất hiện từ
năm 1993 tại Kiên Giang và đã lan tràn mạnh ra nhiều vùng trên cả nớc [18].
Chúng kháng lại hầu hết các kháng sinh thông thờng vẫn dùng điều trị thơng
hàn, ví dụ nh tại Bệnh viện đa khoa trung ơng Huế, 1999-2001: Salmonella
typhi (N=973) đã kháng chloramphenicol 93,5%, ampicillin 90,1%, cotrimoxazole 93,3%, tetracycline 90,1%, doxycyclin 91,5%. Tình hình cũng
tơng tự nh vậy ở bệnh viện đa khoa Đồng Tháp (N=147), 2002:
chloramphenicol 91,1%, ampicillin 91,5%, co-trimoxazole 91,2%, tetracycline
91,1%, doxycyclin 91,5% (Nguyễn Thị Nam Liên và Phan Văn Bé Bảy, 2003).
Gen kháng các kháng sinh này đã đợc chứng minh là đều cùng nằm
trên một R-plasmid (Lê Văn Phủng và CS, 1999-2002) [63]), vì vậy khả năng
truyền tính kháng thuốc của chúng rất lớn.
Tình hình kháng thuốc hiện nay còn trầm trọng hơn do đã xuất hiện, và
ngày càng nhiều, các chủng đa đề kháng nh trên, đồng thời kháng cả
nalidixic acid (Đồng Tháp 97,2%, An Giang 90% - Phan Văn Bé Bảy, 2002)
và giảm độ nhạy cảm với fluoroquinolone. Cơ chế của hiện tợng đề kháng
này đã đợc chứng minh là do đột biến điểm ở gen gyrA trên nhiễm sắc thể
của Salmonella typhi (Lê Văn Phủng và CS, 2002) [77].

Việc điều trị bệnh thơng hàn đa kháng thuốc, đặc biệt là kháng cả
NAL, rất khó khăn. Thời gian cắt sốt dài hơn, thời gian nằm viện kéo dài hơn,
kháng sinh phải dùng liều cao hơn và kéo dài hơn, biến chứng hay gặp hơn,
nhiều trờng hợp phải can thiệp ngoại khoa do thủng ruột (Lê Thị Phợng,
1999).
Nguyên nhân đa đề kháng của Salmonella thờng là do R-plasmid [7887]. Đây là một plasmid có kích cỡ lớn [52] và thờng mang nhiều gen kháng
các kháng sinh khác nhau, bao gồm ampicillin [88, 89], tetracyclin [67, 90],
trimethoprim [91, 92] và đặc biệt là chloramphenicol [59-72].
Có thể dễ dàng nhận thấy rằng, trong tất cả các mô hình đa đề kháng do
R-plasmid đã đợc nghiên cứu, mô hình nào cũng thấy xuất hiện kháng
chloramphenicol, không thấy kháng chloramphenicol đơn thuần [61, 64, 67,
79, 84, 93-97]. Nhận xét này là cơ sở để nghĩ rằng, có thể dùng dấu ấn kháng
kháng sinh này là chỉ điểm của sự đa đề kháng.
Kháng chloramphenicol thờng xuất hiện ở các vi khuẩn Gram âm do
cảm ứng. Cơ chế của hiện tợng này là do enzym Chloramphenicol
Acetyltransferase (CAT); enzym này liên kết đồng hoá trị với 1 hoặc 2 nhóm
acetyl, từ acetyl-S-coenzyme A, với nhóm hydroxyl trên phân tử
chloramphenicol. Sự acetyl hoá này ngăn cản chloramphenicol gắn với
ribosome trong quá trình sinh tổng hợp protein; vì vậy, ngăn cản tác động của
chloramphenicol đến quá trình sinh học quan trọng này [98, 99]. Gen kháng
16


chloramphenicol (cat gene) nằm trên plasmid và luôn luôn đi kèm với các gen
kháng nhiều kháng sinh khác [99, 100].
Chloramphenicol đã là kháng sinh chọn lựa trong điều trị bệnh thơng
hàn qua nhiều thập kỷ. Tuy vậy, từ khi xuất hiện R-plasmid ở Salmonella, nó
dần dần trở nên kém hiệu quả và hiện nay, những chủng đa đề kháng đã kháng
lại hoàn toàn kháng sinh này và vì vậy, chloramphenicol đã không còn là thuốc
chọn lựa cho điều trị bệnh thơng hàn ở những vùng có dịch thơng hàn lu

hành các chủng đa đề kháng [68].

17


Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp
nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
-

Vi khuẩn:

Gây bệnh thơng hàn: Salmonella typhi, S. paratyphi A, S.
paratyphi B và S. paratyphi C.
Không phải Salmonella:
S. aureus, E. coli, B. cepacia, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. cloacae, P.
mirabilis, Pseudomonas spp, P. multocida, C. freundii.
Các vi khuẩn này đợc Dự án bảo tồn gen vi sinh vật gây bệnh cho ngời
(ĐHY Hà Nội) cung cấp.
- Máu bệnh nhân thơng hàn (đã đợc xác định bằng cấy máu +): 36 mẫu,
do bệnh viện đa khoa Đồng Tháp và Trung ơng Huế cung cấp.
- Máu bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết (cấy máu +) do các vi khuẩn không
phải Salmonella: 115 mẫu, do các bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, Trung ơng
Huế và Thanh Nhàn (Hà Nội) cung cấp.
- Máu ngời lành: 60 mẫu, chọn lọc từ những ngời khoẻ mạnh trong đợt
khám sức khoẻ định kỳ của cơ quan.
2.2. Vật liệu, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu
2.2.1. Sinh phẩm, hoá chất chính
(Đức).
-

Tách chiết ADN: Kit Qiagen (QIAmp DNA Blood Mini Kits 51304)
Dung dịch MgCl2 25 mM, Applied Biosystems.
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Applied Biosystems.
Taq Gold DNA Polymerase, Applied Biosystems.
Mồi: 10 cặp mồi đặc hiệu (đặt hàng, Invitrogen) (Bảng 5).
Agarose NA, Amersham Biosciences (Mỹ).
Đệm tra mẫu (Gel loading buffer) (Invitrogen)
Dung dịch đệm TAE 50x, Applied Biosystems.
Ethidium bromide 0,5 àg/ml, Applied Biosystems.

2.2.2. Máy móc chính
-

Máy định danh vi khuẩn: BioMérieux, Inc., (Mỹ).
Máy PCR: Gene Amp PCR System 9700 (Mỹ).
Máy PCR: Mastercycler Gradient, Eppendorf (Đức).
Máy giải trình tự gen: ABI Biosystems Avant 3100 (Mỹ).
Máy ly tâm lạnh: Avanti 30 Centrifuge, Beckman (Mỹ).
Máy điện di ngang: Advance Co. Ltd (Nhật bản).
18


-

Hệ thống máy đọc gel, máy in ảnh: Chemi Doc EQ Bio-Rad (Mỹ).

2.3. Phơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Định danh vi khuẩn
Các vi khuẩn dùng trong nghiên cứu đều đợc định danh lại trên máy

định danh tự động, Vitek-32 (BioMérieux, Inc., Mỹ) với các sinh phẩm (GNI
và GPI Card) mua từ chính Hãng.
2.3.2. Chọn kháng nguyên đặc hiệu, thiết kế mồi và giải trình tự gen
- Chọn kháng nguyên đặc hiệu: Mời kháng nguyên đặc hiệu cho
từng loài Salmonella thông qua các yếu tố kháng nguyên O, H đặc hiệu và
CAT:





-

S. typhi
S. paratyphi A
S. paratyphi B
S. paratyphi C
Salmonella spp

O9, [O2], H1-d và Vi
O2, H1-a
O4, H1-b
O6, H1-c và Vi
CAT

Thiết kế mồi

Lấy thông tin về các gen đợc quan tâm trong ngân hàng gen
(GenBank, EMBL, DDBJ).
Thiết kế mồi bằng phần mềm chuyên dụng: Primer3 v. 0.2

Thử thách tính chất bổ sung giữa các cặp mồi: Dùng phần mềm
từ: />- Giải trình tự gen: Theo nguyên lý kết thúc chuỗi của Sanger [101],
dùng BigDye Terminator 3.1 với máy giải trình tự gen tự động (ABI
Biosystems Avant 3100, Mỹ).
2.3.3. PCR đa mồi với các vi khuẩn mẫu
2.3.3.1. Salmonella typhi, S. paratyphi A, B và C
Nuôi cấy vi khuẩn: thạch thờng, 35C/18 giờ.
Tách chiết ADN: lấy vi khuẩn đã nuôi cấy 18 giờ, hoà trong PBS với độ
đục tơng đơng Mc Farland 0,5; đun cách thuỷ 100C/10 phút, sau đó ly tâm
4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy dịch nổi chuyển sang ống sạch khác,
cặn ly tâm bỏ đi.
Chuẩn bị hỗn hợp mồi: Các mồi đợc giữ riêng biệt trong lạnh sâu, khi
làm PCR thì pha thành một hỗn hợp với nồng độ 10 àM cho mỗi mồi. Hỗn hợp
mồi này đợc pha vừa đủ cho 1 lần chạy PCR, không dùng lại cho lần sau.
Thành phần và điều kiện phản ứng PCR:
14,0 àl

Nớc cất
19


Đệm 10x
dNTPs 2 mM
Mồi (10 cặp) 10 àM (mỗi mồi)
ADN mẫu
MgCl2 25 mM
Taq ADN polymerase 1 UI/àl

2,5 2,5 2,0 1,0 1,0 2,0 25 àl

Tổng thể tích

Chu trình nhiệt: 95C/3 phút; 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: 94C/1phút,
56C/30 giây và 72C/1 phút; 1 chu kỳ: 72C/7 phút; 4C.
2.3.3.2. Các vi khuẩn khác, không phải Salmonella: Quy trình tách chiết ADN
và các điều kiện cho PCR giống nh các Salmonella. Các vi khuẩn là S.
aureus, E. coli, B. cepacia, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. cloacae, P.
mirabilis, Pseudomonas spp, P. multocida, C. freundii.
2.3.4. Nghiên cứu các điều kiện tối u cho PCR đa mồi
2.3.4.1. Nhiệt độ gắn mồi
Nhiệt độ gắn mồi đợc thay đổi nhờ máy PCR (Mastercycler Gradient,
Eppendorf) có chức năng gradient nhiệt độ, máy tự động tính toán, phân chia
các mức nhiệt độ trong giải nhiệt độ chọn lựa (G=10):
46; 46,3; 47,4; 49,2; 51,5; 54,1; 56,8; 59,5; 62; 64,1; 65,7; 66,5 (C).
Khi vận hành, mỗi hàng giếng trên máy có nhiệt độ riêng theo đúng chế
độ đã cài đặt. Vì vậy, mỗi lần chạy, sẽ có 12 kết quả khác nhau với 12 loại
nhiệt độ khác nhau tạo ra. Căn cứ vào kết quả đó, có thể chọn đợc nhiệt độ tối
u.
Khi tìm nhiệt độ gắn mồi tối u, chỉ có chỉ số này thay đổi còn các chỉ
số khác đều giữ nguyên.
2.3.4.2. Nhiệt độ kéo dài mồi
Tiến hành tơng tự nh nhiệt độ gắn mồi, nhng nhiệt độ kéo dài mồi
thì thay đổi, còn các điều kiện khác thì giữ nguyên. Giải nhiệt độ nh sau:
68,0; 68,2; 68,6; 69,4; 70,3; 71,4; 72,5; 73,6; 74,6; 75,5; 76,1; 76,4 (C).
2.3.4.3. Nồng độ MgCl2
Chạy PCR với từng nồng độ MgCl2 khác nhau, các điều kiện khác giữ
nguyên. Mỗi lần chạy, chỉ đợc 1 nồng độ.
Thang nồng độ nghiên cứu nh sau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5;
4,0; 4,5 (mM). Sau khi chạy xong 10 loạt nh trên, tiến hành điện di cùng một
lúc để tìm nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.

2.3.5. PCR chẩn đoán và theo dõi bệnh thơng hàn
-

Bệnh phẩm: máu, gồm 3 nhóm:
20


+ Nhóm I: bệnh thơng hàn đã đợc xác chẩn bằng cấy máu, mỗi
bệnh nhân đợc lấy máu qua 4 ngày liền, mỗi ngày 1 lần (để tìm độ nhạy của
PCR và theo dõi sự hiện diện của Salmonella trong máu theo thời gian).
+ Nhóm II: ngời lành (để tìm độ đặc hiệu của PCR).
+ Nhóm III: bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do các vi khuẩn không
phải Salmonella (cũng đã đợc chọn lọc qua cấy máu dơng tính, để tìm phản
ứng chéo của PCR).
Lấy bệnh phẩm: lấy 1 ml máu, chống đông bằng EDTA (nồng độ cuối
cùng 10 mM). Nếu cha xử lý ngay thì để trong lạnh sâu (- 20C).
Tách chiết ADN từ máu: Kit Qiagen (QIAmp DNA Blood Mini Kits
51304), tóm tắt nh sau:
Lấy 20 àl proteinase K cho vào đáy ống eppendorf (loại 1,5
ml).
2. Thêm 200 àl máu toàn phần vào.
3. Thêm 200 àl đệm AL vào, lắc 15 giây.
4. ủ 56C trong 10 phút.
5. Ly tâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy ống.
6. Thêm 200 àl methanol, lắc cho đều rồi lại ly tâm nhẹ.
7. Lấy hỗn dịch ở bớc 6 vào cột QIAamp. Ly tâm 8000
vòng/phút trong 1 phút.
8. Lấy cột ra, thêm 500 àl dung dịch đệm AW1. Ly tâm 8000
vòng/phút trong 1 phút.
9. Cho thêm vào cột 500 àl AW2. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong

3 phút.
10. Cho thêm vào cột 200 àl dung dịch đệm AE hoặc nớc cất. Để
ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Thu lấy dịch ly tâm để chạy PCR (ADN khuôn mẫu).
1.

-

Tính độ nhạy: Số mẫu PCR (+) trong nhóm bệnh/ Tổng số mẫu thơng hàn
(+) (%).

-

Tính độ đặc hiệu: Số mẫu PCR (-) trong nhóm lành/ Tổng số mẫu lành
(%).

-

Tính phản ứng chéo: Số mẫu PCR (+) trong nhóm nhiễm khuẩn khác/
Tổng số mẫu nhiễm khuẩn khác (ngoài thơng hàn) (%).

2.3.6. Địa điểm lấy mẫu và thực hiện các kỹ thuật
Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi: Bộ môn Vi sinh Y học và Labo
trung tâm Y sinh học, Trờng đại học Y Hà Nội.
Đánh giá kỹ thuật PCR: Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp và bệnh
viện trung ơng Huế có bệnh nhân thơng hàn đã xác chẩn bằng cấy máu
dơng tính với Salmonella.
21

Chơng 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Thiết kế mồi
Bộ mồi dùng để chẩn đoán 4 loài Salmonella đề xuất trong nghiên cứu
gồm 10 cặp mồi (Bảng 5); trong số đó, 8 cặp đã có trình tự đợc công bố trên
ngân hàng gen (GenBank), nên các mồi đợc thiết kế dựa trên các trình tự này
rất thuận lợi; hai cặp mồi còn lại (H1:b và H1:c) chúng tôi không tìm thấy trên
ngân hàng gen nên phải tự giải trình tự gen, sau đó mới thiết kế đợc mồi đặc
hiệu. Hai đoạn gen tự giải trình tự (tại Labo Trung tâm, trờng đại học Y Hà
Nội) đã đợc đăng ký trên ngân hàng gen (GenBank, Accession No.
AY657000 và AY657001). Nguyên bản trên GenBank đợc trình bày dới
đây.

22


3.1.1. §o¹n gen FliC-b (AY657001) vµ ®o¹n måi cho H1:b (g¹ch ch©n):
LOCUS
DEFINITION

AY657001 1488 bp DNA linear
BCT 12-JUL-2004
Salmonella enterica isolate VCMM 4477 flagellar antigen H1:b
(fliC)gene, complete cds.
ACCESSION
AY657001
VERSION
AY657001.1 GI:49854240
SOURCE
Salmonella enterica
ORGANISM

Salmonella enterica; Bacteria; Proteobacteria;
Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae;
Salmonella.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1488)
AUTHORS
Phung,L.V. and Tue,N.T.
JOURNAL
Submitted (18-JUN-2004) Microbiology, Hanoi Medical
University, 1-Ton That Tung, Hanoi 04, Vietnam
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1488
/organism="Salmonella enterica"
/mol_type="genomic DNA"
/isolate="VCMM 4477"
/db_xref="taxon:28901"
gene
1..1488
/gene="fliC"
CDS
1..1488
/gene="fliC"
/codon_start=1
/transl_table=11
/product="flagellar antigen H1:b"
/protein_id="AAT68768.1"
/db_xref="GI:49854241"
/translation="MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIA

QTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQT
LGLDTLSVQDAYTPKGTAVTRDVTTYKNGGTTLTAPNAAAIDTALGTTGAAGTAAVKFKDGNYFVEVTGTTKDGLYEATVDAAGAVTMTANK
ATVTGASTVTENQIVDAVTPTPVDTVAAATALTNAGVTGATGNTSLVKMSFEDKNGKVTDAGYALKVGNDYYAADYDEKTGEIKAKTVNYTD
ATGATKTGAVKFGGANGKTEVVTTVDGNTYQASDVKGHNFQSGGALSEAVTTKTENPLAKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNT
VNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR"

ORIGIN
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321

1381
1441

atggcacaag
tcccagtccg
gcgaaagacg
ctgactcagg
gcgctgaacg
aacagcacca
aacgaaatcg
gacaacaccc
aagcagatca
ccaaaaggta
acagcaccta
gcggctgtga
ggtctgtatg
acagtaactg
ccagttgata
ggtaatacca
ggttacgcgc
gagataaaag
gtgaaatttg
tatcaggcta
gtaaccacta
gcgctgcgtt
ggcaataccg
accgaagtct
gcgcaggcga

tcattaatac

ctctgggcac
atgcggcagg
cttcccgtaa
aaatcaacaa
actcccagtc
accgtgtatc
tgaccatcca
actctcagac
ccgctgttac
acgcagcagc
aatttaaaga
aagcgacagt
gggctagtac
cagtcgcagc
gcttggttaa
ttaaagttgg
ctaaaactgt
gcggtgcgaa
gtgatgtaaa
aaactgaaaa
ctgacttggg
taaacaacct
ccaacatgtc
accaggttcc

aaacagcctg
cgctatcgag
tcaggcgatt
cgctaacgac
caacctgcag

tgacctcgac
cggccagact
ggttggcgcg
cctgggtctg
cagagatgtt
aattgatacc
cggtaactac
tgatgcagct
agttactgaa
agctactgca
aatgtcattt
aaatgattat
aaattatact
tggtaaaact
agggcataat
cccgctggct
tgcggttcag
gtctgaagcc
ccgcgcgcag
gcaaaacgtc

23

tcgctgttga
cgtctgtctt
gctaaccgtt
ggtatctcca
cgtgtgcgtg
tccatccagg
cagttcaacg

aacgacggtg
gatactttaa
accacctata
gctttaggta
ttcgttgagg
ggcgcggtga
aaccaaattg
ttgaccaatg
gaagataaaa
tatgccgctg
gacgctactg
gaagttgtga
ttccagagtg
aaaattgatg
aaccgtttca
cgtagccgta
attctgcagc
ctctctttac

cccagaataa
ctggtctgcg
ttaccgcgaa
ttgcgcagac
aactggcggt
ctgaaatcac
gcgtgaaagt
aaactatcga
gtgtacagga
aaaatggtgg
cgactggtgc

tgaccggtac
caatgaccgc
tagacgctgt
caggtgtgac
atggcaaagt
attacgatga
gtgcgacaaa
ccaccgttga
gtggcgcttt
ccgcgctggc
actccgctat
tcgaagattc
aggccggtac
tgcgttaa

cctgaacaaa
tatcaacagc
catcaaaggt
cactgaaggc
tcagtctgct
ccagcgcctg
cctggcgcag
tatcgatctg
tgcctatacg
tactactctt
ggcgggtact
aactaaagat
aaataaagca
tacaccgacg
aggtgcgaca

tactgatgcg
aaaaactggt
aaccggtgct
tggtaatact
aagcgaggct
gcaagttgat
caccaacctg
cgactacgcg
ctccgttctg


3.1.2. §o¹n gene FliC-c (AY657000) vµ ®o¹n måi cho H1:c (g¹ch ch©n):
LOCUS
DEFINITION

AY657000
1474 bp
DNA
linear
BCT 12-JUL-2004
Salmonella enterica isolate VCMM 3420 flagellar antigen H1:c
(fliC)gene, partial cds.
ACCESSION
AY657000
VERSION
AY657000.1 GI:49854235
SOURCE
Salmonella enterica
ORGANISM
Salmonella enterica; Bacteria; Proteobacteria;

Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae;
Salmonella.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1474)
AUTHORS
Phung,L.V. and Tue,N.T.
JOURNAL
Submitted (17-JUN-2004) Microbiology, Hanoi Medical
University, 1-Ton That Tung, Hanoi 04, Vietnam
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1474
/organism="Salmonella enterica"
/mol_type="genomic DNA"
/serotype="Paratyphi C"
/isolate="VCMM 3420"
/db_xref="taxon:28901"
gene
1..>1474
/gene="fliC"
CDS
1..>1474
/gene="fliC"
/codon_start=1
/product="flagellar antigen H1:c"
/protein_id="AAT68767.1"
/db_xref="GI:49854236"
/translation="MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIA
QTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQT

LGLDTLNVQKKYDVSDTAVAASYSDSKQNIAVPDKTAITAKIGAATSGGAGIKADISFKDGKYYATVSGYDDAADTDKNGTYEVTVAADTGA
VTFATTPTVVDLPTDAKAVSKVQQNDTEIAATNAKAALKAAGVADAEADTATLVKMSYTDNNGKVIDGGFAFKTSGGYYAASVDKSGAASLK
VTSYVDATTGTEKTAANKLGGADGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHNFKAQPELAEAAATTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAI
TNLGNTVNNLSSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQ"

ORIGIN
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381

1441

atggcacaag
tcccagtctg
gcgaaagacg
ctgactcagg
gcgctgaacg
aacagcacca
aacgaaatcg
gacaacactc
aagcagatca
gtgagcgata
gataaaacag
gcagatatta
gcagatacag
acttttgcga
gttcaacaga
ggagttgcag
aatggcaaag
tctgttgata
ggtaccgaaa
actatcgacg
ccagagctgg
gctttggcgc
tccgctatca
gaagattccg
gccggtacct

tcattaatac
ctctgggtac

atgcggcagg
cttcccgtaa
aaatcaacaa
actcccagtc
accgtgtatc
tgaccatcca
actctcagac
ctgctgtagc
ctattactgc
gctttaaaga
ataaaaatgg
ctacaccaac
atgatactga
atgcagaagc
ttattgatgg
aatctggcgc
aaactgctgc
gtaaaaccta
cggaagcggc
aggtggatgc
ccaacctggg
actacgcgac
ccgttctggc

aaacagcctg
cgctatcgag
tcaggcgatt
cgctaacgac
caacctgcag
tgacctcgac

cggtcagact
ggttggtgcc
cctgggccta
tgcttcctat
aaaaattggt
tggcaagtat
aacctatgaa
agtggttgac
aatagcagca
tgatacagct
tgggttcgca
agctagcttg
gaataaatta
caatgccagc
tgctacaacc
gctgcgttct
caataccgta
cgaagtttcc
gcaggcgaac

24

tcgctgttga
cgtctgtctt
gctaaccgtt
ggtatttcta
cgtgtgcgtg
tccatccagg
cagttcaacg
aacgacggtg

gatacgctga
tccgactcga
gcagcaacca
tacgcgactg
gtcactgttg
ttaccaactg
acaaatgcga
actttagtga
tttaagacct
aaagttacta
ggtggcgcag
aaagccgctg
actgaaaacc
gacctgggtg
aataacctgt
aacatgtctc
cagg

cccagaataa
ccggtctgcg
tcaccgcgaa
ttgcgcagac
aactggcggt
ctgaaatcac
gcgtgaaagt
aaactatcga
atgtgcagaa
aacagaatat
gtggtggtgc
tcagtggata

ccgcagatac
atgcaaaagc
aagctgcatt
aaatgtctta
ccggtggtta
gctacgttga
acggtaaaac
ggcacaactt
cgctgcagaa
cggttcagaa
cttctgcccg
gcgcgcagat

cctgaacaaa
tatcaacagc
catcaaaggt
cactgaaggc
tcagtctgct
ccagcgtctg
cctggcgcag
tatcgatctg
aaaatatgat
tgctgttcct
tggtataaaa
cgatgatgcc
aggagcagtt
agtttcaaaa
aaaagctgca
tacagataat
ttatgcagca

cgctaccact
cgaagttgtt
caaagcacag
aattgatgct
ccgtttcaac
tagccgtatc
tctgcagcag


3.2. Kết quả PCR đa mồi với các chủng Salmonella mẫu
3.2.1. Salmonella typhi
T

M

750
615
439
258
219

Hình 1. Salmonella typhi kháng chloramphenicol
Ba băng đặc hiệu cho S. typhi: H1:d (750 bp); O:9 (615 bp); Vi (439 bp);
O:2 (258 bp) chung với S. paratyphi A; và băng kháng thuốc, Cat (219 bp)

M: ADN mẫu (Marker), thang 100 bp; T: S. typhi

3.2.2. Salmonella paratyphi A
M

A

329
258

Hình 2. S. paratyphi A
Hai băng đặc hiệu cho S. paratyphi A: H1:a (329 bp) và O:2 (258 bp)
M: ADN mẫu (Marker), thang 100 bp; A: S. paratyphi A

25