Thực hành hóa sinh học Nguyễn Văn Mùi (Phần 2)

Chương 7

ĐỊNH LUỢNG AXIT AMIN VÀ PROTEIN
I. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p CHUẨN đ ộ PORMOL
(PHƯƠNG PHÁP SỒRENSEN)
1 . Nguyên

tắc

Axit amm hoà tan trong nưốc có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và
cacboxyl trung hoà lẫn nhau. Nhóm -COO của axit amũi bị cản trỏ bởi các nhóm
amin nên không thể chuẩn độ trực tiếp được. Trong fomanđehit, nhóm amin của axit
amm phản ứng vổi nhóm anđehit cho metylen, kết quả của phản ứng là nhóm amm
mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng
metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ.
o

N H ./

I

I

R — CH

I

HC

R — CH

\

H2O

I
H

coo

N=CH2

COOH

N = CH2

I

R — CH

N = CH,

NaOH

R — CH

I

HoO

COOH

COONa
Sô' nhóm cacboxyl tự do bằng sô' nhóm amm liên kết với íomanđehit, khi chuẩn độ
nhóm cacboxyl thì xác định đưđc nhóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được axit
amũi có trong dung dịch nghiên cứu.
2. Nguyên liệu
Dung dịch axit amin khoảng 0,1% hoặc các nguyên liệu có axit amin cần định
lượng.
3. Hoá ch ất
- Dung dịch NaOH 0,1 N
72


- Dung dịch HCl 0,1N
- Dung dịch fomanđehit tnmg hoà 30%: Lấy 50ml íomanđehit 30% cho thêm
o.lml phenolphtalein trong etanol 1 % và chủih bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện
màu vàng nhạt.
- Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%.
- Dung dịch KOH 0,01N trong etanol 90%.
- Cồn tuyệt đối
- Dung dịch CuCl2 amoniac 0,0025M
- Dung dịch phenolphtaleũi 1% trong etanol 60%.
4. Dụng cụ
Bình nón, biưet, 2 pipet lOml.
5. Tiến h àn h
1. Cho vào bìiứi nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch
phenolphtálẻin ĩ%.
2. Để trung hoà dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu vàng nhạt.
3. Cho thêm 20ml dung dịch íomanđehit 30% đã trung hoà và ỉắc đều bình
nón. Sau 5 phút dung dịch mất màu.

4. Chuẩn độ bằng NaOH 0,ỈN đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trỏ lại (pH =
9,0). Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tưdng tự vối các hoá chất trên nhưng
thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích.
6.

Tính k ế t quả

Iml dung dịch NaOH 0,1N tưdng đưdng l,4mg nitơ. Sô' mg nitđ amin của dung
dịch nghiên cứu được tứih theo công thức:
mgN = (A - B) X 1,4

Trong đó: A - Sô' ml NaOH 0,1N dừng để chuẩn độ bình thí nghiệm,
B - Sô' ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra.
Phương pháp chuẩn độ formol các axit amm trực tiếp và thuận lợi. Nó đưỢc sử
dụng để định lượng axit amũi trong dung dịch nghiên cứu. Đồng thời cũng cầnnhổ
rằng phưđng pháp này không cho kết quả hoàn toàn chửih xác giá trị nitơ amin,vì
nếu trong dimg dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fomanđehit nên ỉàm giảm
kết quả định lượng. Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có tữozin, nó lại làm tăng kết
quả định lượng vì nó có nhóm phenol. Phưdng pháp định lượng bằng chuẩn độ íormol
73


không thể sử dụng vối mẫu có muối amoni, vì formalm sẽ cho hexamm, đồng thời giải
phóng ra axỉt.
4NH^C1 + 6HCH0

> N4(CH2)g + 6 H 2O + 4HC1

Nhóm cacboxyl của các axit amin lưõng tính, các peptit lỏn và protein có thể đưỢc
xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ trong dung dịch nước - etanol không có formalũi. Môi

trưồng nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm atnin, kết quả là nó trơ trong môi
trường nước, axit amm trồ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amữi có thể được chuẩn
độ lại bằng kiềm. Với đặc tính cđ bản này, có thể định lượng axit amin bằng phưdng
pháp micro:
Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tymolphtalem 0,1%
trong etanoỉ 90% và chuẩn độ bằng KOH 0,0 IN trong etanol 90% đến khi xuất hiện
màu xanh. Sau đó cho thêm 10 thể tích cồn tuyệt đô'i vào 1 thể tích dung dịch cần định
ỉượng axit amm. Màu dung dịch biến mất, chuẩn độ lại dung dịch cho đến màu xanh.
Mầu để so sánh vối màu chuẩn độ có thể sử dụng dung dịch amoniac CuClg 0.0025M .

Phương pháp này đặc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzim, biểu
diễn dưối ảnh hưỏng tác động lên các enzim proteolitic protein và peptit.
II. Đ ỊN H L Ư Ợ N G A X IT A M IN B Ằ N G N IN H IĐ R IN

1. N ^ y ê n tắc
Dưới tác dụng của ninhiđrũi, axit amin bị oxi hoá chuyển thành axit amm rồi đến
amoniac và cacbonic. Axit amin bị giảm bốt 1 nguyên tử cacbon, nó trỏ thành dạng
anđehit. Như vậy axit amin có khốỉ ỉượng phân tử nhỏ hơn và amoniac tạo thành sẽ
oxi hoá ninhịcừm tạo nên phức hỢp có màụ xanh tím, cưòng độ màu tưdng ứng vói giá
trị nitd amin của axit atnin. Phản ứng của axỉt amin vổi nứihiđrin là cđ số để định
lượng các hỢp chất theo phưđng pháp khí kế bằng cách tính sô' lượng CO2 hoặc NH3

bay ra, còn phươi^ pháp so màu lại đo cưòng độ màu, nó phụ thuộc nồng độ phức hợp
của ninhiđrin vối NH3.
Phản ứng màu ninhiđrin cũng xảy ra vói axit amin mạch bên của peptit vi
protein cũng như với muối amoni, glucozamin và amoniac. Để định lượng chính xác
axit amin, dxmg địch nghiên cứu phải không có hỢp chất trên.
H
R -C -CO O H +

NH2
axỉt amỉn

74

+ H,0

R - C H + CO., +
JL
NH

ninhiđrin

nữihiđrin khử


o

NH

R -c :

R - CH + H ,0
11

H

NR
o

'1

a

c
c

+

2 NHo

4-

OH

o
o-

o

+ SHgO + NH4

C -N = C
c
o

o

Phức chất mầu
2. Nguyên liệu

Dung dịch chứa axit amm có a - 5|ig nitơ trong Iml.
3. H o á c h ấ t

- Dung dịch ninhiđrin: hoà tan 2g ninhiđrin trong 50ml dung dịch etanol 50%.
- Dung dịch đệr xitrat 0,4M; pH = 5
- Dung dịch etanoỉ 50%
4. Máy móc và dụng cụ
Bình định mức lOml, 1 pipet Iml, 2 pipet 5ml, ống nghiệm lOml, nồi ủ, máy so
màu.
5. Tiến hành
1.

Lấy 0,5ml dung dịch axit amin, cho thêm l,5ml dung dịch đệm xitrat 0,4M;

pH = 5 và 2 ml dung dịch ninhiđrin.

2 . Lắc đều õhg nghiệm và đật vào nồi ủ nhiệt đ\m sôi 30 phút.

3. Cho thêm etanol 50% vào đến lOml. Đo giá trị hấp thụ ỏ 570nm. Chỉnh
máy vể không với ông kiểm tra có đủ các hoá chất nhiíng thay dimg dịch axit amin
bằng nưốc cất cùng thể tích. Giá trị hấp thụ nhận được tương ứng vối độ hấp thụ cùa
dung dịch chuẩn leuxữi đă biết nồng độ (cưòng độ màu trong phản ứng ninhỉđrin
tưđng ứng với cường độ màu của dimg dịch chuẩn leuxữi).
75


4.
Đường chuẩn leuxin: lấy Iml của các dung dịch chuẩn leuxin có từ 1 - 5^g
cho vào các ốhg nghiệm. Làm phản ứng với các hoá chất trên và đo hấp thụ.

Phương pháp ninliiArm rất nhạy và chính xác, nó đưỢc sử dụng nhiều để định
lượng axit amin tách ra bằng phưđng pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột. Nó cũng được
dùng để định lượng axit amũi của các peptit và proteũi thuỷ phân bằng hoá học hoặc

enzim.
*Chú ý: Đinh ỉượng chính xác axit amin bằng phương pháp dùng ninhiđrin phụ
thuộc vào sự loại bỏ chất chứa NH.ị và các hoá chất sử dụng cũng phải không có NH 3 .

III. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN NHỜ TẠO THÀNH PHỨC CHAT VỚI ĐồNG
(Phương pháp Pope và Stevens)
1. Nguyên tắc
Để định lượng axit amin của dung dịch nghiên cứu cần cho thêm vào môi trường
bazđ yếu dung dịch đồng photphat dư trong dung dịch đệm borat. Muôi đồng của axit
amũi hoà tan tốt trong dvuig dịch. Đồng photphat dư được loại bỏ bằng cách lọc, sau đó
cho thêm CH3COOH và KI. Xác định lượng đồng bằng cách chuẩn độ vối dung dịch

Na2S2 0 3 , iôt được tách ra, phản ứng xảy ra như sau:
2Cu^^ + 41"

2CuI + I 2

Ịon r trong môi trường axit khử ion đồng của phức chất liên kết với axit amin và
bị oxi hoá thành Ỉ 2- Từ kết quả của phUdng trình trên ta thấy ỉ ion iôt khử 1 ion đồng
tạo nên sự liên kết của phức chất vối 2 gốc axit amỉn. 1 ion iôt "nốỉ" nhóm amữi của
axit amm. Iml dxuig dịch Na2S20 3 0,01N tưởng ứng vối 0,28mg nitơ amin.
2. Nguyên liệu
Dimg dịch chứa axit amm hoặc dung dịch protein thuỷ phân đã trung hoà chứa
0,5 Ỷ l,Omg nitđ amũi trong Iml.
3. Hoá chất

Dung dịch đồng photphat mổi pha. Một thể tích dung dịch A vói 2 thể tích dung
dịch B, cho thêm 2 thể tích dung dịch c.
Dung dịch A; hoà tan 35,4g CuClg 2 H2O hoặc 27,3g CuClg vào nước và dẫn
đến lOOOml.
Dung dịch B: Hoà tan 64,5g Na2HP0 4 . 1 2 H2 0 cùng 7,2g NaOH vào õOOml
nưốc và dẫn đến lOOOml.
Dung dịch C: Dung dịch đệm borat: 57,21g borat (Na2B4P7.10ĩỈ20) hoà tan
trong lõOOml nưổc, cho thêm lOOml HCl IN và dẫn nưốc đến 2000ml.
76


- D u n g d ịch ty m o lp h ta le m ; 0,25g ty m o lp h ta le in hoà ta n tro n g lOOml d u n g dịch

etanol 50%.
- D u n g d ịch N a 2S 203 0 ,0 1 N (được p h a loãng từ dung dịch gốc 0,1N đ ã được c h ỉn h

bới KIO3).

- Dung dịch NaOH 0,1N.
- D u n g d ịch tin h b ộ t 1% h o à t a n tro n g N aCl b ão hoà.

- CH.5COOH đặc.
- T m h th ể K I.

3. D ụng cụ và máy móc
Bình định mức 25ml, 2 pipet Iml, 1 pipet 5ml, 1 pipet lOml, cô'c thuỷ tinh.

4. Tiến hàn h
1. L ấ y 2 m l d u n g dịch c h ứ a a x it am ữ i hoặc dung dịch p ro te in th u ỷ p h â n đã

trung hoà cho vào bình định mức 25 ml, cho thêm 2 giọt tymolphtaleũi và từng giọt
N aO H I N đ ế n k h i x u ấ t h iệ n .m à u x a n h n h ạ t (pH Ịd io ạ i^ 10).

2. Cho nưóc vào bình đến 25ml và lắc kỹ. Kết tủa (đồng photphat dư) được li
tà m hoặc lọc qua giấy lọc.
3. L ấ y 5 -lO m l dịch li tâ m (hoặc dịch lọc) cho vào cốc, cho th ê m 0 ,5 m l
C H .iCO O H đặc v à 0,2 - 0 ,5 g KI, trộ n đều.

4. Chuẩn đô I 2 giải phóng bằng Na2S.,0 ;, 0,01N. Gần kết thúc chuẩn độ cho
thêm 2-4 giọt tinh bột 1% và tiếp tục chuẩn độ đến khi xuất hiện màu xanh.
Tương tự, làm thí nghiệm kiểm tra với cùng các iioá cKất, nhưng thay dung
dịch c h ứ a a x it a m in b ằ n g nước c ấ t cù n g th ể tích.

5. Tính k ết quả
m gN = (A - B)x 0,28

Trong đó: A - Sô' ml NH2S20 3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm,
B - Sô ml Na2S20 3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,
0,28 - Iml Na 2S2 0 3 0,01N tương ứng 0,25mg nitđ.
*Chú ý: Khi sử dụng phương pháp này phải loại bỏ cẩn thận đồng photphat dư
trong dung dịch nghiên cứu, vì nó sẽ làm tăng kết quả chuẩn độ. ưu điểm của phương

pháp này là có thể định lượng nitd amin của axit amin khi có

1

lượng nhỏ amoniac và

ngay cả 1 lượng lớn ure. Vì vậy có thể sử dụng phưđng pháp này để địiứỉ lưdng axit
amin trong nước tiểu.

77


IV. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ BẢNG PHƯƠNG PHẢP KJELDAHL

ỉ. Nguyên tắc
Tất cả các dạng nitđ có trong cơ thể hay trong các mô đưỢc gọi là nitơ tổng sô. Nitơ
có trong thành phần axit amũi của proteũi là nitơ proteừi. Nitơ không có trong thành
phần protein như của các muối vô cờ, axit nitric, các axit amin tự do, các peptit, ure và
các dẫn xuất của ure, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimiđin... là nitơ phi proteứi
v.v...
Nitd tổng số = Nitd protein + Nitđ phi protein

Tníốc tiên mẫu được vô cđ hoá bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.
Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá xảy ra như sau:
2 H2SO4

->

2 H 2O + 2 S0 2 t

+ O2

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hoá các nguyên tô' khác. Các phân tử chứa
nitđ dưổi tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thuỷ phân thành

axit amin, cacbon và hiđro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitđ được giải
phóng dưới dạng NH3, kết hỢp vối H2SO4 dư tạo thành (NH4)2S04 tan trong dung dịch
2

Các nguyên tố P ,

NH3 + H2 SO4

(NH4 )2 SƠ4

Ca, Mg... chuyển thành dạng oxit: P 2O5 , KgO, CaO, MgO...

Đuổi amoniac ra kbỏị dung dịch bằng NaOH:
(MH4)2S0 4 + 2NaOH = Na2S0 4 + HgO + 2 NH3
NH3 bay ra cùng

nưổc sang bình hứng, bình hứng chứa H3B0.J
2 NH4OH

+ 4 H3BO3 = (NH4)2B4ơ 7 + IHỵO

hoặc H2SO4, ph àn ừ a g xảy ra như sau:
2 NH4OH

♦

+ H2SO4 -> (NH4)2SƠ4 + 2 H2O

2. Tiến hành
a) Vô cơ hoá ngìuyén liệu
1.

Cân Ig mẫu ttaơi hoặc 0 ,1 - 0,3g mẵu khô đã đưdc nghiền nhỏ (dùng một ông

giấy cân cuộn tròn). Choi cẵỈn thận vào đáy bmh Kjeldahl dimg tích 50ml.
2. Cho thêm 5 - lữnsl H2SO4 đặc (d=l,84). Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm
axit cần cho vài giọt mưềc cất không có nitớ để thấm ưốt bột. Nếu mẫu lỏng như nưóc
mắm, xì dầu,... dừng pipelt lấy 2 - 5ml, côn nước quả hộp lấy 10 - 20ml. Khi cho mẫu
vào bình, không đưđc để rmẫu dính bám cổ bình.
78


3. Đậy bằng nút lỏng thụỷ tinh quả hổng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhồ giọt. LÁc
nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đtm nhẹ khoảng 30 - 40 phứt, sau đó nhấc bình ra,
đế nguội.
4.

Cho vài giọt xúc tác axit percloric (hoặc HClOg hoặc H2O2 30%, chỉ cho ồ giai
đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO^ vối tỉ lệ 3:1,
cho một lần ngay từ đầu (lưỢng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng để vô
Ctí hoá), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyển từ màu đen
sang màu cánh dán. Nhắc bình ra khỏi bếp, để nguội.
5. Cho thêm chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric), tiếp tục đốt cho đến
khi dung dịch trong bình không màu. Để nguội.
6.

Chuyển dung dịch sang bình định mức 50 hoặc lOOml, tráng bừửi Kjeỉdahỉ vài
lần bằng nước cất không có nitđ và dẫn đến thể tích định mức bằng nưốc cất không có
nitd.
b) S ử d ụ n g HgBOg ở binh hứng
• Hoá chất:

-H 2S0 4 đặc
- Dung dịch H2SO4 O.lN

- Dung dịch NaOH đặc
- Dung dịch NaOH 40%
- Diưig dịch HCIO3 hoặc H 2O2 30% hoặc K2SO4, CUSO4 (100:10:1), có thể
dùng selen kim loại '0,05g) hoặc hỗn hỢp K2SO4 : CUSO4 (3:1).
- Dung dịch H3BO3 3%.

- Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0,1% trong níỢu etylic và metylen xanh 0,1%
tỉ-ong etylic, tỉ lệ 2 :1 .
- Chỉ thị Tashừo:
Hỗn hỢp metyl đỏ và metylen xanh có giổi hạn biến đểi màu ỏ pH 5,2-5,6 . Môi
trường axit có màu tím đỏ, môi trưòng kiềm có màu xanh lục. Hoà 0,05g metylen xanh
vào 5ml nước, cho vào đấy lOOml etanoỉ và hoà thêm 0,15g metyl đồ. Hoà tan và cho
vào lọ màu đậy kín.
• Tiến hành:

1. Rửa bộ chtíng cất Kjeldahl kỹ bằng nước cất không có nitđ. Lấy 10 - 20ml
(tuỳ theo hàm lượng nitơ có trong mẫu) đă vô cơ boấ cho vào bình phản ứng (c) qua
phễu (e).
2. Cho một vài giọt thuôc thử hỗn hđp vào bình phản ứng nếu dừng xúc tác
bằng axit HCIO3 hoặc H 2O2 .
79


3. Cho vào bình hứng 20ml dung dịch H ịBO , 3%, thêm vài giọt chỉ thị

Tashừo.
4. Ehm sôi nưỏc trong hìnli ctôt (a) đồng thời cho nưốc từ vòi q u a ông làm lạ n h (d;.

5. Cho qua phễu (e) vào bình phản ứng (c) 30ml NaOH 40%.
6. Mồ khoá cho kiềni chay vào bình đến khi dung dịch trong bình phản ứng

đổi màu thi đóng khoá lại.
7. Đun bình đô't. NH;j đuọc bay lên cùng với nước qua ông làm lạnh sang bình
hứng và tác dụng với H.^BOị tạo thành muôi amon tetraborat [(NH4).2B4 0 7 ]. Quá
trình cất được tiến hành 30 - 40 phút, ỉíiểm tra NH;, đả hết chưa bằng cách hạ thấp
bình hứng và thử bằng mẩu giây đo pH vào đầu ông làm lạnh. Khi NH.^ đã đưỢc cát
hoàn toàn, hạ bình hứng xuông, dùng tia nưốc cất nhỏ tráng sạch axit dính đẩu ông
ỉàm lạnh.
8.

Định lưỢng amon tetraborat[(NH4)2B,ị0 7 ] tạo thành bằng dung dịch H2SO 4
0,1N cho đến khi xuâ't hiện màu hồng nhạt, phản ứng xảy ra như sau:

+ H.^SO^ + õHỵO

(NH,,)^SO^ + 4 H3BO;,

• Tính kết quả:
Hàm lưdng nitơ tổng sô' có trong mẫu:

M 0/ _ V X1,42 X100
Nmg% = ------- --------w
Trong đó: V- sô' ml H26 O4 0,1N chuẩn độ,
1,42 - số mg nitơ ứng vối Iml H2SO4 0,1N,
100 - h ệ s ô 'c h u y ể n th à n h %,

w - khôi lượng mẫu tính bằng mg.
c)

S ử dụng H 2 SO 4 ở bình hứng

• Hoá chất
- H2SO4 đặc

- Dung dịch IỈ 2S0 ^ (hoặc HCl) 0,1N (chính xác)
- Dung dịch NaOH 30% - 40%
- Dung dịch NaOH 0,1N.
- Thuốc thử hỗn hdp: metyl đỏ 0,1% trong rượu etylic và metyl xanh 0,1%)
trong rưỢu etylic, tỉ lệ 2:1.
- Chất xúc tác ( như trên)
80


BấpđốtKịeldahllớn

BộcấtKNdahllớn

Hình 7.1-Bộ chưng cất Kjeldahl định luợng nitđ
a - bình đốt
b ■bình rửa
c - bình phản ứng
d - ốhg làm lạnh

e - phễu
f • bình hứng
g - đèn đốt
81


-Thuốc thử Nessler: phát hiện sư có mặt nitđ trong dung dịch. Cách pha chẻ:
+ Cách 1 : lõg Hgl.,; lOg KI hoà vào 15ml nước cất, thêm 80ml dung dịch

NaOH 50%. dẫn thể tích đến 500ml bằng nưốc cất (không có nitđ và
cacbonic).
+ Cách 2 : - 35 g KI hoà tan trong lOOml nưốc cất nóng
- 17g HgClj hoà tan trong 300 ml nưốc cất

- NaOH hoặc KOH 20%
Đổ dung dịch HgCl2 vào dung dịch KI đến khi kết tủa đỏ của Hgl^ tạo
thành không thấy tan nữa thì dừng lại. Sau đó dùng dung dịch kiềm 20%
dẫn đến 1 lít. Lại thêm 5ml dung dịch HgCl2 đến khi có kết tủa đỏ xuất
hiện. Đe dung dịch lắng đến khi hoàn toàn trong. Bảo quản trong lọ màu,

đậy bằng nút cao su.
• Tiến hành:

Quá trình định lượng được tiến hành như trên nhưng ở bình hứng cho một
lượng H2SO4 0,1N (sao cho ngập đầu ống làm lạnh) và vài giọt thuốc thử hỗn hdp.
Theo dõi bình húng, nếu thấy dung dịch biến đổi từ màu vàng sang màu lá mạ thì cho

thêm 5ml HgSO^ 0,lN nữa vào bình hứng, cần làm nhanh để tránh mất nitd.
Đun sôi khoảng 30 phút, quan sát cột nưổc ở đầu ống làm lạnh không chuyển
từ mầu hồng sang xanh là đưỢc. Muôn chắc chắn, lấy nưốc đầu ống làm lạnh thử vói
thuốc thử Nessler, lấy bìmh hứng ra và chuẩn độ axit dư bằng kiềm 0 , 1N.
• Tính kết quả:
Hàm lượng nitd Cỉó trơng mẫu được tính theo công thức:
n,.
(V, - V^) X 1,42 X f X 100
Nmg% = —------ ------ ^--------------w
V ,....

Trong đó: Vj - số ml H2SO^ 0 ,1N cho vào bình hứng,

- sôTml NaOH dùng để chuẩn độ axit dư trong bình hứng,
f - hệ ísố điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f = 1 khi nồng độ

H 2 SO,jị chính xác 0,1N,

w - khiối lượng mẫu dùng để vô cđ hoá mẫu ứng vối thể tích dung
dịch tmẫu lâ'v để định lượng nitd tưdng ứng vối Iml H2SO4,
1,42 - sô mg nitơ.
• Chú ý:

Quá trình vô cơ hoá mẫu trong bình Kjeldahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến
hành trong tủ hốt.
82


' Thời gian đốt mẫu kéo dài 3 - 4 giờ phụ thuộc vào lượng mẫu, nguồn nhiệt và
chất xúc tác. Nếu dùng CUSO4 vối lượng lớn (1 - 2g) thì thòi gian vô cơ hoá mẫu
khoảng 2 - 3,5 giò. Khi dùng H2O2 (4 - 5ml) mất 40 - 50 phút. Dùng selen (0,1 g/lg
mẫu thực vật) thòi gian khoảng 30 - 40 phút. Dừng hỗn hỢp xúc tác K2SO4: CUSO4: Se
(100:10:1) vói tỉ lệ 4 g/lg mẫu, thòi gian khoảng 50 - 60 phút.
d) Báo cáo th i nghiệm
1. Viết phản ứng xảy ra ở bình phản ứng và bình hứng.
2. Xác định hàm lưỢng nitơ tổng sô' ồ một mẫu thí nghiệm.
V. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p L0WRY
1. Nguyên tắc
Có thể tính hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của
protem và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin. Cường độ màu của
dung dịch tỉ lệ thuận vói nồng độ proteũi.
2. H oáchất
- Dung dịch protem chuẩn có 10 - 100 Jig proteừi trong Iml.

- Proteũi được hoà tan trong dung dịch NaCl 0,9% với ỉượng protein trong Iml có
10 , 2 0 , 30, 40, 80, 1 00
protein. Dung dịch chuẩn thường dừng tiiứi thể albumm
huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin).
- Dung dịch A; Dtmg dịch Na2C0 a 2% trong NaOH 0,1N
- Dung dịch Bl va B2:
+ BI - Dung dịch CUSO4 1%
+ B2 - Dung dịch muốỉ Seignett 2% (Kali natri tactarat).
- Diưig dịch C: Hỗn hợp 0,5ml dung dịch Bl, 0,5ml dung dịch B2 và 50ml dvmg
dịch A (dung dịch c chuẩn bị trưổc khi dừng 30 phút).
- Dung dịch D; Dun^ dịch Folin có nồng độ IN.
Cách pha dung dịch Folin: Cho vào bình cầu đáy tròn nút nhám 700ml
nước cất, lOOg natríwonframat (NaW0 4 .2 IỈ 2 0 ) và 25g natri molypđat
(NaMo0 4 .2 IỈ 2 0 ). Thêm 50ml axit photphoric (H3PO 4) 85% và lOOml HCl đậm
đặc. Đun sôi hỗn hđp trong bình cầu đáy tròn dimg tích 2 lít có ông làm lạnh
hồi lưu trong 10 giò. Sau đó cho thêm 150g liti simfat (LÌ2SO4.H2O), õOml
nước cất và 5 giọt brom. Tiêp tục đvin sôi 15 phút không có ông làm lạnh hồi
lưu để đuổi lượng brom thừa. Dung dịch phải có màu vàng. Nếu dimg dịch có
màu xanh thì phải xử lý với brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dimg dịch,
83


thêm nước cất đến

1

lít (bình định mức). Xác định nồng độ thuốc thử Folm

bằng cách chuẩn độ với dung dịch NaOH IN có chỉ thị phenolphtalein. Dung

dịch gốc có nồng độ IN (để chuẩn độ chính xác thường pha loãng dung dịch
gốc 1 0 lần và chuẩn vổi dung dịch NaOH IN).
Bảo quản dimg dịcli Folm trong lọ thuỷ tinh màu, cất giữ ò nơi lạnh. Sau 2 - 3

tháng dimg dịch chuvển màu xanh lại thêm vài giọt brom và đun sôi 15 phút, dung
dịch lại có màu vàng trở lại. Trưổc khi dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nưóc cất
đến nổng độ 0,5N.
3. Dụng cụ
Bĩnh định mức 25ial, pipet 5ml và 0,5ml, ốhg nghiệm.
4. Tiến hành
Lấy Iml dung dịch protein nghiên cứu cho vào ống nghiệm, cho thêm 5ml dung
dịch c. Lắc đều, để ỏ nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục cho thêm 0,5ml dung dịch D,
lắc, để 30 phút và đo trên máy so màu ở bưốc sóng 750nm. Đồng thời làm ôìtig kiểm
tra vổi hoá chất như ông nghiệm chuẩn nhưng thay dung dịch protem bằng nưổc.
Nồng độ proteỉn nghiên cứu được tính theo lượng protein ỏ đồ thị chuẩn.
5. Báo cáo thí nghiệm
1- L4 p đồ thị chuẩn protein.

2- Định ỉượng một mẫu protein dựa vào đồ thị chuẩn protein.
VI. ĐỊNH LƯỢNG PBOTEIN TổNG s ố , ALBUMIN VÀ GLOBULIN TRONG
HUYỂT THANH MẤU BẰNG p h ư ơ n g t h á p BIURÉ

1. Nguyên tắc
Protein của huyết thanh phản ứng vối thuốc thử biure cho màu xanh. Cường tlộ
màu tưdng ứng với nồng độ protein của dimg dịch chuẩn. Khi sử dụng dung dịch
Na2SƠ4 27% sẽ kết tủa globulin. Vì vậy nồng độ globulin là hiệu sô' giữa hàm lượng
protem tổng số và albumỉn.
Thuốc thử biure phản ững vối liên kết peptit (-CO-NH-) trong chuỗi polipeptit.
Phương pháp này cho kết quả khi định lưỢng protein.
2. Hoá chất

- Dung dịch NaCl 0,9%
- Dung dịch Na2S 0 4 27% được điều chỉnh pH đến 6,2 - 6,4 bằng dung dịch NaOH
hoặc H2SO4. Thuốc thử cất giữ trong bóng tốì.
8'


mức

1

Dung dịch biure: Cân l,5g CuS0 4 -5 H^ 0 và 6 g muối Seignet cho vào binh định
lít, cho thêm 300ml dung dịch NaOH 30%, 2g KI và dẫn nước đến vạch ngấn.

Dung dịch giữ trong lọ sẫm màu, đậy bằng nút cao su.

3. Dụng cụ
1
pipet Iml, 2 pipet 2ml, 3 pipet lOml, 12 ốhg nghiệm, phễu lọc, bình định mức
õOml, máy so màu, tủ ấm.
4. Tiến hành
Cho vào ốhg nghiệm 0,5ml huyết thanh và 0,9ml dung dịch Na 2SƠ4 27%, lắc đều,
đặt 30 phút trong tủ ấm 37°c. Lắc đều lấy 2ml dung dịch cho vào ốhg nghiệm ghi chữ
T (protein tổng sôi). Phần còn lại lọc qua phễu lọc (trong tủ ấm), lấy 2ml dịch lọc cho
vào ốhg nghiệm ghi chữ A (albumm). ống nghiệm thứ 3 ghi chữ K (ốhg kiểm tra) cho
2ml dung dịch Na2SƠ4 27%. Tất cả 3 ốhg nghiệm đều cho thêm 8 ml dung dịch biure,
lắc đều, sau 30 phút xác định độ hấp thụ ỏ 530nm so với ốhg kiểm tra. Hàm lượng
protein trong huyết thanh nghiên cứu được xác định so với đường chuẩn hoặc tửứi qua
hệ sô.
5. Dựng dường chuẩn
5ml huyết thanh được định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahỉ dẫn đến

50ml trong bình định mức bằng dung dịch NaCl 0,9%- Cho vào các ốhg nghiệm lần
lượt dung dịch huyết thanh đã pha loãng: 0,4; 0,6; 0 ,8 ; 1,0 và l,5ml. Dẫn thể tích
trong các ống nghiệm đến 2ml bằng dung dịch NaCl 0,9%. Cho thêm vào mỗi ốhg 8 ml
dung dịch biure và xác định độ hấp thụ sau 30 phút phản ứng so vổi ông kiểm tra.
Đường chuẩn phụ thuộc vào độ hấp thụ từ hàm lượng phồn trăm proteữi nhận được
t rong ốhg thí nghiệm chứa l,Oml dung dịch huyết thanh pha loãng (0,1 ml không pha
loăng) tương ứng với nồng độ protein biểu thị bằng % của phương pháp xác định bằng
Kjeldahl. Phương pháp biure không tính đưỢc theo định luật Lambert-Beer (đến nồng
độ protein 1 0 %) mà có thể thay bằng cách tính hệ sô' tương quan, hệ sổ này nằm trong
giá trị % proteũi được chia ra bỏi phưdng pháp xác định bằng Kjeldahl qua giá trị hấp
thụ (A) cho dung dịch chuẩn của thí nghiệm này.
Ví dụ: Nồng độ protein trong huyết thanh được xác (£nh bằng phưdng pháp
Kjeldahl là 7%, giá trị A cho ốhg thí nghiệm Iml dung dịch huyết thaiứi pha loãng (7%
protein) = 0 ,223 . Vậy A cho ốhg thí nghiệm có 0 ,6ml huyết thanh pha loãng (4 ,2 %

protein) = 0,134.
Hệ số = —^
= 31,39 hoặc
= 31,40
0,223
0,134
Vậy % protein = A,,ghiê„ cứu hệ số

85


VII. Đ píH LƯỢNG PROTEIN BẢNG COOMASIE BRILLIANT BLUE G-250
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue
G-250 liên kết vối proteũi trong dimg dịch axit, dạng proton hoá của thuốc nhuộm

Coomassie Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ vối các protein,
tưdng tác vối cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử
protein. Trong môi tníòng của các gốc mang điện tích dưdng, sự proton hoá không xảy
ra và có màu xanh xuất hiện.

Dạng không proton hoá của Coomasie Blue G-250 (C47H 4gN3 0 7 S2Na, khối lượng
phân tử 854).
2. PhươAg pháp H arris và Bashford
a) Hoá chất
1. Hoà tan lOOmg (50mg) Serva Blue G trong 50ml (25ml) etanol 100%. Pha
loãng dung dịch đến ỗOOmỉ với nước cất (Serva Bỉue G dễ tan trong etanoỉ, nhiững
thuốc nhuộm khác có thể phải ỉọc trước khỉ dừng).
Nồng độ thuốc nhuộm trong dung dịch gốc mới pha được điều chỉnh vối etanol
10% (v/v) để c6 OD550 « 1,18 trong hỗn hỢp (a) + (b) ỏ sau, điểu này đảm bảo sự thông
nhất giữa các ỉần pha thuốc nhuộm.
2. Axit photphoric 17% (axit photphoric 85% được pha ỉoăng 1 : 5). Axit
percloric 0,3M có thể thay thế axit photphoric 17% lứiiíng tránh dùng ỏ phương pháp
này vì những đặc tính oxi hoá của nó.
Dimg dịch (1) và (2) đưỢc pha trộn theo tỷ lệ 1:1 tạo thành thuốc thử màu
dùng trong ngày (dving dịch thuốc nhuộm có sẵn của hãng hoá chất Biorad và Pierce
Chemicals). Dung dịch (1) và (2) bền vững trong vài tháng ỏ nhiệt độ phòng.

86


h) Tiến hành
Phưđng pháp này chỉ có thể dùng cho protein tan trong nưốc.
Chuẩn bị 0,2ml mẫu (2-20jig protein) trong nưổc (hoặc đệm). Thêm 2,3ml thuốc
thứ màu (dung dịch thuốc nhuộm axit). Trộn đều và đọc ngay ỏ OD595. Màu bền vững
trong khoảng 30 phút, sau đó kết tủa của phức hđp proteữi vối thuốc nhuộm có thể

xảy ra. 5 fig protem có OD595 » 0 , 1-

Các cuvet hoặc các ổng nghiệm phản ứng thưòng có màu xám do phức chất thuốc
nhuộm - protein dính vào thành, vì vậy cần phải ĩika màu thuốc nhuộm sau khi thí
nghiệm bằng HCl đặc hoặc metanol (CH3OH).

Phưđng pháp phân tích này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry,
nhanh và đơn giản hđn nhiều, đồng thời làm giảm ảnh hưỏng của đệm, muôii, các
chất khử... Tuy nhiên những chất kiềm mạnh có thể gây sai lệch do làm tăng mật
độ quang.

c) Phương pháp cải tiến
Đốì vớỉ prótein không tan, vói sự có mặt các chất tẩy rửa anion (sodium dodecyl
sunphat - SDS,C24H3904 Na), phưdng pháp này không thực hiện được. Tuy nhiên, mẫu
có thể được hoà tan trong Triton X - 100 (0,2%), chất này không gây ảnh hưỏng.
Đốỉ với các dimg dịch protein rất loãng, thể tích mẫu trong thí nghiệm phân tích
này có thể tăng lên đến 50% hoặc nhiều hđn nữa so vối dung dịch thuốc nhuộm gốc.
Trong trường hỢp này, dung dịch thuốc nhuộm gôS: phải tăng nồng độ sao cho nồng độ
cuối cùng trong phân tích là 0,01% thuốc nhuộm, 0,8M (5% v/v) etanol, 1 ,6 M (9% v/v
axit photphoric).

*
Chú ý: Mẫu không được pha đệm đậm đặc hoặc phải hạn chế quá trinh proton
hoá. Màu xanh sẽ xuất hiện khi không có protem.
d) Đ ịnh lượng proteỉn qua đường chuẩn
- Q u y tr in h vi p h â n tích {l-20ụg p ro tein ):

Chuẩn bị một sôTdung dịch protem chuẩn có nồng độ từ l-20jig/mL Tiến hành vẽ
đưòng chuẩn như sau: cho 0 ,8 ml dung dịch protem chuẩn có nồng độ khác nhau được
pha loảng tưđng ứng vào các ông nghiệm khô và sạch, ống nghiệm đối chứng thay

bằng 0,8ml dung dịch đệm. Cho thêm 0,2ml thuốc nhuộm vào các ống nghiệm. Trộn
đều (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngưỢc vài lần. Sau khoảng 5 phút đến 1 giò, đọc OD595 so
vối ống đốỉ chứng. Vẽ đưồng chuẩn với OD595 của các nồng độ proteừi chuẩn khác

nhau. Tính hàm lượng protem của mẫu qua đưòng chuẩn. Hiệu chỉnh OD595 vối
mẫu trắng.
87


Protein (ng)

Hình 7.2- Điiờng chuấn protein (1•20^g)
(Sử dụng proteùi chuẩn của hãng Bio-Rad)
- Quy trình phân tích chuẩn (20~140ịtg protein):

Chuẩn bị một số^ dimg dịch proteũi chuẩn có nồng độ từ 20 - 140ng. Đường chuẩn
cho mỗi lần nghiên cứu được tiến hành như sau;
Cho 0,1 ml dung dịch proteũi đã được pha ỉoãng tưđng ứng vào các ốhg nghiệm
sạch, khô. Cho o.lnal dtmg dịch đệm vào ông I^hiệm đốì chứng. Cho thêm 5ml thuốc
nhuộm pha loãng. Trộn đểu (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngược ốhg nghiệm vài lần. Sau 5
phút hoặc 1 giờ đo ở OD595 so với đối chứng. Vẽ đường chuẩn ỏ ODsgg của các nồng độ
khác nhau của chất chuẩn. Đọc thôi^ số protein nghiên cứu từ đường chuẩn. Hiệu
chỉnh OD595 với mẫu trắng.
3.Phương pháp Sedmak và Gronberg - quỵ trình chuẩn
í.o,

Protein (|Ag)

Hình 7.3 - Đudng chuẩn protein (20-140^g)
(Sử dụng protein chuẩn của hãng Bio-Rad)

88


- Dung dịch thuốc thử (1) Coomassie BriUiant Blue G-250 (CBBG - 250) 0,06%,
cân 60mg CBBG - 250 pha trong lOOml axit percloric 3% (w/v; 0,3M) hay axit clohiđric
2,2% (w/v; 0,6N). Lọc qua giấy lọc Whatman N®1 . Dung dịch được bảo quản lâu dài ở
nhiệt độ phòng.
- Dung dịch mẫu (2): protein đệm được pha loãng trong nưôc không có nitd.
Thí nghiệm mẫu: lấy 0,5ml dung dịch thuốc thử (1), thêm 0,5ml dung dịch mẫu
(2). Trộn đều và đọc sau 2 phút ỏ bưổc sóng 620nm.
Thí nghiệm đối chứng: dùng dung dịch NaCl 0,15M thay cho dung dịch mẫu.
4.Phương pháp Bradford
Thuốc nhuộm: dung dịch Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250) 0,01%:
lOOmg CBB G-250, 50ml etanol 95% (4,7%; w/v), lOOml H3PO4 85% (8,5%), dẫn nước
đến 1 lít.
- Q u y tr ìn h p h â n tích:

1. Dung dịch protein chuẩn: 10 - lOOng proteũi/ml dung dịch NaC10,15M.
2 . Ống

thí nghiệm: 0 ,lm l dung dịch protein, thêm, 5ml duụg dịch thụôc ạhụộm
protein, trộn đểu.
3. Ống đối chứng: o.lml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuôc
nhuộm protein, trộn đểu.
4. Đọc quang phổ ồ bước sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giò (cuvet 3cm).
- Quy trình vi phân tích:
1.

Dung dịch protem chuẩn: 1,0 - 10,0^g/ml dung dịch NaCl 0,15M.

2 . Ống

thí nghiệm:
protein trộn đều.

0,1 mỉ

dung dịch protein, thêm Iml dung dịch thuốc nhuộm

3. Ống đối chứng: o.lml dung dịch NaCl 0,15M, thêm Iml dung dịch thuôc
nhuộm protein, trộn đểu.
4. Đọc quang phổ ỏ bưốc sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giờ (cuvet Icm)
Rửa chất màu: ốhg nghiệm và cuvet đưỢc loại bỏ chất màu bằng axeton, sau
đó rửa hoặc ngâm trong dung dịch HCl 0,1M.
VIII. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p q u a n g PHỔ
1. Nguyên tắc
- Phát hiện và đo protein: phưdng pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protem trong
dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protem từửi sạch thì nồng độ tuyệt đôi
của nó được tính theo giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ
89


sắc ỉ^) thì nồng độ của protein tổ ĩ^ số được tùih tưởng đốỉ từ độ hấp thụ. Phương
pháp này không dừng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp (dưối 0,05 0 ,lmg/ml) hoặc khi c6 mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ,
đệm, axit nucỉeic và một sô' chất béo), hoặc khi protein ỏ trong dịch huyền phù chứ
không phải trong diuig dịch (ví dụ trong màng hoặc các phức hdp có khối lượng phân
tử lốn). So với phương pháp so màu thì phưđng pháp này đđn giản hđn, nhạy hơn, mẫu
dừng lại thường ổn địiủi họá phẩn lổn proteũi.
Sự hấp thụ tm cực tím: Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ỏ bước sóng
280nm do các axit amin tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin. Đồng thời

chúng cũng hấp thụ ỏ bước sóng thấp hđn (215-230nm) bâí chuỗi polipeptit. Độ hấp
thụ ỏ 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ sô' tắt đo được (nghĩa ỉà độ hấp thụ
cùa dung dịch protein 1% vối đường sóng truyền qua Icm) cho mỗi protein (bảng 7.1)
cho phép từứạ nồng độ của protein tinh sạch. Độ hấp thụ ở bước sóng thấp hdn có quan
hệ trực tiếp với khốỉ ỉượng của poỉỉpeptit và thường được coi là nhạy hơn ỏ 280nm. Tuy
nhiên, rất nhiễu loại đệm và phân tử khác cũng hấp thụ ở những bưóc sóng thấp hdn
(đệm photphat và tris có thể dừng được, nhxừỉg chất bảo qiiản natri azit (NaN ị) hấp
thụ rất mạnh). £)ộ hấp thụ ỏ 215 hoặc 230nm phừ hỢp cho việc peptit không có
tr 3T?tophan hoặc tjnrpzin.
Báng 7.1 - HẬ sấ tắt của các loại proteln liốn quan hoá miễn dỊch.
Các giá tit trung btoih đấi với
{nghU tà sự hấp thụ cửa 10mg/ml dung dfch ở 280nm)
của các loại protoin khác nhau

IgG

13,6

Chuỗi Y

13,7

Concanavalin A

120

IgM

1 1 ,8

Chuỗi ^

13,9

Lectin Lens
calinaris

12,5

IgÁ

13,2

Chuẫi a

12,3

BSA

6,7

IgD

17,0

Chuỗi nhẹ

12,3

IgE

15,3

Chuỗi J

2. Nguyên liệu và thiết bị
• Dung dịch protem để đo.
• Đệm hoà tan protein.
- Máy quang phổ u v có cuvet thạch anh đường sáng truyền qua Icm.
3. Tiến hành
1. Li tâm mẫu (nếu thấy cần thiết) để loại bỏ các phân tử hoặc phức hỢp khác
có troi^ thể huyền phù.
2. Đặt bước sóng 280nm ỏ máy quang phổ và điều chỉnh độ hấp thụ về không
với cuvet chứa đệm.
90


3. Đọc độ hấp thụ của mẫu hoặc trong cừng một cuvet hoặc cuvet khác cùng
cặp. Nếu giá trị thu được > 2,0 thì pha ỉoãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng
tr u y ề n ngắn hơn (2mm) cho đến khi sôTđọc nằm trong khoảng 0,1 - 1,5.
4. Lặp lại bước 2 và 3 ở 360nm.
5. Tính tỷ sôTđộ hấp thụ 260: 280nm.
số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu tỷ sô" cao
h ơ n cho biết protein không sạch, có lẫn các chất khác đặc biệt với axit nucleic.
_ độhấpthụở280nm
Nong độ mẫu =
hệ sô tảt ở 280nm

/1

lOmg/1

Vói một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà không biết hệ
sò' tắt

thì tính như sau:

Nồng độ protein = 1,55 Xđộ hấp thụ ỏ 280nm - 0,77 Xđộ hấp thụ ỏ 26Qnm

91


Chương

8

Đ ỊN H L Ư Ợ N G A X IT N U C L E IC

Phưđng pháp hoá học định lượng axit nucleic dựa vào sự định lượng thành phần
cấu tạo của axit nucleic như axit photphoric. riboza, đeoxyriboza và các bazơ nitơ.
Nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp dựa vào sự phân tích hỢp chất photpho của
axit nucleic. Phương pháp thông dụng để phân tích hợp chất photpho cùa các mô và tê
bào động vật là của Schimidt và Thannhauser (1945), Schimidt (1945). cả hai phương
pháp này hiện nay vẫn thông dụng. Còn để định lượng axit nucleic trong nguyên liệu
thực vật dựa vào phương pháp Ogur và Rosen (1970).
Các phương pháp này dựa vào khả năng tách chiết các hỢp chát axit hoà tan và
không hoà tan. Các hợp chất hoà tan chứa axit photphoric được tính theo các phân tứ
nhỏ mà nó liên kết, ví dụ; nucleotit, este của hexoza và triozophotphat, axetyl
photphat... Các hợp chất không hoà tan chứa axit photphoric như photpholipit, axit
nucleic, photphoprotein...

I. PHƯƠNG PHÁP SCHIMIDT VÀ THANNHAUSER

li Nguyên tắc
Tiến hành tách ARN khỏi ADN và phần lốn protem cua mô sau khi thuy phán
mẫu trong NaOH IN. Trong điều kiện này ARN phàn giải thành các nucleotit, ADN
còn lại không bị thuỷ phân. Cả hai loại axit nucleic (ARN và ADN) được xác định bằng
hàm lượng photpho.
2. Hoá chất
- Dung dịch CCI3COOH 5-10%
- Dung dịch NaOH IN hoặc KOH IN
- Etanoỉ 80%
- Hỗn hỢp etanol - cloroform (3:1)
- Hỗn hđp etanol - ete (1 :1 )
- Dung dịch HCl 6 N
92


3. Tiến hàn h
Quá trình xác đmh ADN theo các bước được giới thiệu ở bảng 9.1. Theo phương
pháp Schimidt và Thannhauser, ARN tách khỏi ADN và phần lốn protein mô được
thuỷ phân bằng NaOH IN ỏ 37°c trong một đêm. Trong điều kiện này ARN thuỷ
phân thành các nucleotit, ngược lại ADN tồn tại ỏ dạng không hoà tan. Axit hoá dung
dịch thuỷ phân kiềm (III) bằng HCl 6 N và CCI3COOH cho phép tách kết tủa ADN và
protein (VI). ARN tồn tại ỏ dạng các nucleotit hoà tan (IV). Xác định các loại axit
nucleic theo hàm lưỢng photpho ở phần IV và VI theo phưdng pháp xác định photpho
của Horecker và cộng sự (1940) có sửa đổi từ phương pháp Fiski và Subbarow (1925).
Nếu giá trị của photpho vô cơ rất nhỏ, giá trị nguồn photpho từ photphoprotein ỏ
phần IV có thể được dừng để tính cho hàm lượng ARN. Để xác định giá trị chúih xác
của ARN có thể xác đỊnh đồng thời photpho vô cơ được tách ra ỏ phần IV. Hàm lưỢng

photpho của ARN được tửứi từ hiệu giá trị photpho ở phần IV và V. Điều quan trọng
là ở các mô giàu photpho, axit không hoà tan có nguồn gôic không phải axit nucleic, ví
dụ mô gan, mô não (cả chất trắng cũng như chất xám). Một phần hđp chất photpho vô
cd được tách khỏi khi sử dụng phưđng pháp Delory (1938).
Phương pháp Schmidt và Thannhauser đã được cải tiến để có độ chùih xác cao
hơn, ví dụ khí phấn tích ẤDN c6 cho thêm 1% dung dịch albumm để làm kết tủa dễ
dàng. Phương pháp quang phổ kế xác định axit nucỉeic cũng thường đưỢc sử dụng
phưđng pháp Thannhauser và Tsanev (1960). Phương pháp Schmidt và Thaimhauser
có thể xác định được số lượng nucleotit khi đưỢc tách bằng sắc ký điện di. Phương
pháp xác định axit nucleic theo Schmidt và Thannhauser giới thiệu ỏ bảng 9.1.
Bổng 9.1- Các buớc tiến hành để xác định ADN bằng
phU0ng pháp Schmldt và Thannhauser

Các giai
đoạn

Xử lý

Các họTp ch ất photpho có
tro n g th à n h phẩn của các
giai đoạn

Mô tươi Để phân tích sử dụng các mô tươi
nghiền kỹ hoặc ưổp ỉạnh ỏ - 10"c
I

Chiết nhanh 3 lần vối CCI3COOH 5- Các hỢp chất axit hoà tan
10 % lạnh

II

Chiết mô còn lại ở phần I bằng etanol
80%, hỗn hđp etanol - cloroform nóng
(3:1) hoặc hỗn hợp etanol - ete (1:1)

III

Thủy phân mô còn lại ỏ phần II bằng Các nucleotit được tạo thành từ
NaOH IN hoặc KOH IN ỏ 37“c qua ARN, AND cùng photpho
(không
phải
ỉà
từ
đêm (Iml NaOH / lOOmg mô tươi)
photphoprotein)

Photpholipit

93


Các hỢp chẫt photpho có
trong thàn h phần của các
giai đoạn

Các giai
đoạn

Xử lý

IV

Lấy dịch li tâm sau khi cho thêm HCl
6 N vào phần II (để trung hoà NaOH
hoặc KOH) và tiếp tục cho thêm
CCI3COOH đến nồng độ cuối cùng là
5-10%. Kết tủa ADN được tách bằng li
tâm ở 0“c. Rửa tiếp hai lần bằng
CCI3COOH 5%

V

Tách các hợp chất photpho vô cơ từ Photpho không phải của
phần rv và xác định chúng bằng nucleotit, chủ yếu photpho
được giải phóng khi thuỷ phân
phướng pháp Delory
bằng
kiềm
từ
các
photphoprotein

VI

Kết q\iả nhận đưỢc từ phần III cho ADN và protein
thêm một ít HCl 6 N để trung hoà và
cho thêm CCI3COOH đến nồng độ 510 %

VII

Chế phẩm nhận được khi xử lý phần AND
VI với CCI3COOH 5% ỏ 90°c trong 15
phút

Nucleotit của ARN và photpho
vô cơ có nguồn gổc không phải
của nucleotit (chủ yếu là từ
photphoproteũi)

II. PHƯƠNG PHÁP SCHNEIDER
1.

Nguyên tắ c

Phưdng pháp Schneider tách chiết ARN và ADN đồng thòi bằng dung dịch
CCI3COOH hoặc HCIO4 nống (90°C) Ịoại bỏ một lượ^g đáng kể protein và chuyển vào
với thành phần axit không hoà tan. Vì vậy, dịch chiết của cả hai loại nucleic thủy
phân thành các nucleotit hoặc các bazđ tự do, nhò đó có thể xác định đồng thời chúng
bằng phương pháp chuyên biệt đối với riboza và đeoxyriboza.
2. Hoá ch ấ t
Như ỏ phần hoá chất của phưđng pháp Schmidt và Thannhauser.
3. Tiến h àn h
Quá trình xác định được mô tả ỏ bảng 9.2.
94


Bảng 9.2 - Các giai đoạn tách chiết các hợp chất photpho theo phU0ng pháp Schneider
Các hd]p chất photpho có
trong các giai đoạn

Các giai
đoạn

Tiến hỉmh

Mô tươi

Như ở bảng 9.1

I

Như ỏ bảng 9.1

Hợp chất axit hoà tan

II

Như ồ bảng 9.1

Photpholipit

III

Phần mô còn lại sau chiết rút của phần I ARN, ADN, photphoprotein
và II

IV

Chế phẩm nhận đưỢc ỏ giai đoạn III xử ARN, ADN và
lý VỚI CCI3COOH 5% hoặc HCIO4 6 % ỏ photphoprotem

90“c trong 15 phút. Kết tủa còn lại rửa
hai lần bằng axỉt

một

phần

Xác định ARN và ADN theo phương pháp Schneider thuận lợi hđn phưđng pháp
Schmidt và Thannhauser đối vối nhiều mô động vật khác nhau (ruột, lá lách, tuyến
ức, bạch cầu và hồng cầu lưổi). Ngược lại, trong trường hỢp phân tích mô não và thận
ỉại nhận được kết quả kbác Iihau, vì có thể xác định cả lượng photphoproteũi cũng như
những phức châ^t protem từ mosũi photphat. Trong những trường hỢp như thế, để có
kết quả chính xác hđn cần sử dụng cả hai phương pháp và xác định bổ simg sự hấp
thụ tia tử ngoại.
III. PHƯƠNG PHÁP OGUR VÀ ROSEN
1. Nguyên tắc
Các phưdng pháp trên không thực hiện được cho nguyên liệu thực vật vì có những
hdp chất đưỢc tách ra như pentosan, poliuronit đã cản trở việc xác định axit nucleic.
Trong bảng 9.3 giới thiệu cách tách chiết rút theo phưdng pháp Ogxir và Rosen.
Phương pháp này cho phép xác định ARN và ADN (số’lưđng ljig) trong đầu rễ cây và
trong phấn hoa. Sự tách chiết các mô bằng etanol và hỗn hợp etanoỉ - ete (phần I và II)
đã tách các chất hoà tan khỏi sự liên kết của chúng và cho màu đỏ thẫm vổi
điphenylamũi. Một phần axit không hoà tan (IV) được tách chiết bằng HCIO4 0,1N ỏ
4”c, ARN được tách khỏi hỗn hđp và được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ trong
quang phổ kế. Tiếp theo sử dụng dung dịch HCIO4 nóng tách ADN và photpho của
protein trong phần mô còn lại và định lượng giá trị ADN ỏ bước sóng 270nm hoặc xác
định giá trị của đeoxyriboza hoặc photpho.
Dùng phưdng pháp này sẽ cho kết quả không tốt khi phân tích các loại mô khác
nhau, ví dụ khi chiết rút ARN của nấm men sẽ đồng thời làm mất một phần ADN.
Cần chú ý rằng việc nghiên cứu nguyên liệu vi khuẩn bằng phương pháp này phụ

95


thuộc vào sự kéo dài thòi gian tách chiết ARN (ngay cả đến 30 giò). Phương pháp Ogur
và Rosen cũng được sử dụng để xác định axit nucleic của một số mô động vật.
2. Hoá chất
- Etanol 70%
- Dung dịch HCIO4 0,1%
- Dimg dịch HCIO4 0,2N và IN
- Hỗn hỢp etan ol: ete (3:1)

3. Tiến hành
Quá tiình xác đỉnh theo bảng 9.3.
Bổng 9.3 - Các hợp chất photpho ò các giai đoạn theo phuong pháp Ogur và Rosen
Các giai
đoạn

Tiến hành

Môtưdi

Mô tươi có tìiể giữ trong etanol 70-90% ỏ
0 “c trưốc khi đước chiết rút

96

Các họi]p chất photpho có
trong thành phần của các
giai đoạn

I

Chiết rút bằng etanol 70%, phần mô còn Các chất hoà tan trong etanol
lại đưỢc rửa bằng etanol 70% có HCIO4
0,lN tiếnhànhỏ4“C

II

Chiẽt rút hai lần phần mô còn lại bằng Các chất hoà tam trong hỗn hợp
hỗn hợp etanol 96% và ete (3:1)
etanol - ete

m

Nhanh chóng chiết rút (lạnh) hai lần Các chất axit hoà tan
phần mô còn lại (II) bằng dung dịch
HCIO4 0,1N

IV

Phần mô còn lại sau khi chiết rút ở phần ADN, ARN, photphoprotein
in

V

Chiết rút phần IV bằng dung dịch ARN
HCIO4 0,1N ỏ 4°c trong 18 giò. Kết tủa
sau khi chiết rút, rửa hai lần bằng
HCIO4 0,1N. Tập trung các phần dịch li
tâm

VI

Chiết rút hai lần phần còn lại (V) bằng ADN,
photpho
dimg dịch HC10,ị 0,5N ở 10°c 20 phút
photphoprotein

của