Báo cáo đồ án Phát triển sản xuất enzyme từ bã mía

MỤC LỤC

SẢN XUẤT ENZYME CELLULASE TỪ NẤM TRICHODEMA REESEI NUÔI
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ MÍA VÀ CÁM MÌ VỚI NĂNG SUẤT 2 TẤN/ THÁNG
Lời Mở Đầu
Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực
phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám gạo, agar…Các phế thải này có
thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm
hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất
phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất
thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme
cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và
môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có
ĐỒ ÁN KTQTSH

1


trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và
trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa
trình phân giải này.
Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí
thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm
như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một
lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm, nghành hóa được
phẩm . Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một
số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ
của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể
được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng
tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống.
Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm

Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả
nhất mà giá thành lại rẻ.
Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của Th.Đỗ Thị Hoàng Tuyến chúng
tôi đã thực hiện đồ án này:
“Sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichidema reesei nuôi trên môi trường
bã mía và cám mì . Với công suất 20 tấn/tháng “ .

ĐỒ ÁN KTQTSH

2


CHƯƠNG 1: LẬP LUẬN KINH TẾ
Enzyme Cellulase là một sản phẩm mang lại nhiều lợi ích to lớn . Trong khi đó
trong nước ta chưa có nhà máy nào sản xuất loại sản phẩm này nuôi trên môi trường
bã mía và cám gạo. Đây là một lợi thế lớn để chúng tôi bắt tay vào việc xây dựng và
sản xuất
Sự cần thiết phải đầu tư
Enzyme cellulase được sử dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi... Nhưng
lượng enzyme chiết từ tự nhiên không đủ để sử dụng. Hơn nữa sau khi sử dụng mía làm
nguyên liệu sản xuất đường thì phần bã mía sẽ bị thãi ra môi trường nếu không được xử lý
sẽ làm ô nhiễm môi trường, và phần cám mì cũng chỉ bán lại cho sản xuất thức ăn chăn
nuôi với giá thành khá rẻ. Vì vậy đầu tư cho xây dựng một nhà máy sản xuất chế phẩm
ĐỒ ÁN KTQTSH

3


enzyme cellulase là cần thiết vì sẽ vừa cung cấp chế phẩm enzyme cho công nghiệp, vừa
xử lý được lượng chất của bã mía và tận dụng tốt nguồn cám mì .

1.1 Đặc điểm tự nhiên .

Nhà máy sẽ được đặt ở khu công nghiệp Biên Hòa 1 Đường số 1 – KCN Biên
Hòa 1 – phường An Bình – Biên Hòa - Đồng Nai. Gần các khu công nghiệp lớn
là điều kiện thuận lợi cho phát triển nhà máy.
Đồng Nai là tỉnh nằm trong khu vực miền Đông Nam Bộ của Việt Nam, vùng
đất nối liền giữa Nam Bộ, cực nam Trung Bộ và nam Tây Nguyên. Tỉnh Đồng Nai
nằm ở cực bắc miền Đông Nam Bộ.
Khí hậu Đồng Nai là khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, có hai mùa tương
phản nhau (mùa khô và mùa mưa). Mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 hoặc tháng 4 năm
sau (khoảng 5 – 6 tháng), mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 (khoảng 6 – 7 tháng).
Khoảng kết thúc mùa mưa dao động từ đầu tháng 10 đến tháng 12.
Nhiệt độ không khí trung bình hằng năm từ 25,7 – 26,70C. Mức độ chênh nhau giữa
các năm không lớn. Chênh lệch nhiệt độ cao nhất giữa tháng nóng nhất và lạnh nhất là
4,20C.
Nhiệt độ trung bình mùa khô từ 25,4 – 26,70C, chênh lệch giữa tháng cao nhất và tháng
thấp nhất là 4,80C. Nhiệt độ trung bình mùa mưa từ 26 – 26,80C. So với mùa khô, mức
dao động không lớn, khoảng 0,80C. Độ ẩm trung bình 80 – 82%
1.2 Vùng nguyên liệu

Nằm gần các nhà máy sản xuất đường Biên Hòa, cám mì có thể nhập từ Ấn
Độ, Trung Quốc, Indonesia, Sri Lanka phần lớn là dạng viên và ít hơn là dạng bột. Đây
là nơi cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào nhất cho sản xuất .
1.3 Hợp tác hóa

Nhà máy đặt tại khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai nên các điều kiện về
hợp tác hóa giữa các nhà máy và các nhà máy khác rất thuận lợi và sử dụng chung các
ĐỒ ÁN KTQTSH

4

công trình công cộng như điện, nước, hệ thống thoát nước, giao thông … vvv. Nhờ đó
sẽ giảm thiểu vốn đầu tư ban đầu .
Nguồn cung cấp điện hơi và nhiên liệu .
Khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai là khu công nghiệp lớn nên các vấn đề
về điện, hơi nhiên liệu được đầu tư rất đáng kể. Nhà máy sẽ sử dụng nguồn điện, hơi có
sẵn tại khu công nghiệp .
Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lí nước .
Nguồn cung cấp nước cho nhà máy như nước của công ty cung cấp nước
thành phố, hoặc cũng có thể sử dụng nguồn nước sông Đồng Nai, hoặc từ giếng khoan
… Ở đây ta chọn nhà máy nước Thiện Tân cung cấp 25.000 m3/ngày.
Nước từ nhà máy đưa về đều được lắng, lọc, làm mền và xử lí ion trước khi sản
xuất.
Công suất nhà máy xử lý nước thải: 4000m3/ ngày (nước thải được dẫn qua xử
lý tại KCN Biên Hòa II).
1.4 Năng suất của nhà máy

Nhà máy được thiết kế theo năng suất đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng enzyme
của các doanh nghiệp trong khu vực.
−

Năng suất enzyme được sản xuất ra trong ngày là 20 tấn/ngày.
1.5 Giao thông vận tải :

Cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 30 km.
−

Cách ga Sài gòn 30 km.

−

Cảng Đồng Nai 2 km, Tân cảng 25 km, cảng Sài Gòn 30 km, cảng Phú Mỹ 44 km.

−

Cách Sân bay Quốc tế Tân Sơn Nhất: 30 km.

ĐỒ ÁN KTQTSH

5


Do đó thuận lợi cho việc vận chuyển nguyên liệu sản phẩm. Kênh vận chuyển
đa dạng với đường sắt, đường bộ, đường thủy, đường hàng không là điều kiện rất thuận
lợi về giao thông .
1.6 Nhân công và thị trường tiêu thụ :

Khu công nghiệp Biên Hòa 1 có nguồn nhân công dồi dào từ các tỉnh thành đỗ
về. Từ đó có thể thuê nhân công với giá rẻ. Thị trường tiêu thụ được chọn là thị trường
cho cả nước.
Nguồn tiêu thụ sản phẩm
Nguồn tiêu thụ cho sản phẩm ở đây chủ yếu hướng vào các công ty chế biến
dược phẩm, các công ty chế biến thức ăn gia súc, các công ty phân bón …
Kết luận : Tất cả các điều kiện trên là cơ sở thuận lợi, có tính khả thi để xây
dựng nhà máy sản xuất enzyme cellulose tại khu công nghiệp Biên Hòa 1.

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về enzyme cellulase.
−

Định nghĩa: Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành
Enzyme cellulase
cellobiose và cuối cùng là glucose. Thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân
liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose.

−

Phân loại: Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase,

Endo-β-1,4-glucanase
và β-glucosidase hoạt động
phối hợp để thủy phân cellulose thành
glucose.
Exo-β-1,4-glucanase
β -glucosidase
EC 3.2.1.4

ĐỒ ÁN KTQTSH

1,4- β-D-glucan-4-glucanohydrolase
EC 3.2.1.74

6

1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase
EC.3.2.1.91


Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại

oligosaccharide có chiều dài khác nhau.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở
đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose để giải phóng ra glucose
(glucanohydrolase) hoặc cellobiose

(cellobiohydrolase).
2.1.1 Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase.

ĐỒ ÁN KTQTSH

7


−

Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin
và α-Dglucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các
cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.

−

Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo
thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.

−

Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành
glucose.

2.1.2 Ứng dụng của enzyme cellulase.
2.1.2.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm
Cellulase là thành phần cơ bản của tế bào
thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau
quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu
của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp. Nhưng
người và động vật không có khả năng phân giải
cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa,
nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản
trở tiêu hóa. Chế phẩm cellulase thường dùng
để:
+ Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.
+ Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng
độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc
biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên.
+ Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt,
khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…
ĐỒ ÁN KTQTSH

8


+ Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có
cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của
protease và đường hóa.
+ Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất
lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là
việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng
làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công

nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được
chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.
2.1.2.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu
nghiền bột, tẩy trắng có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng
cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để
tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột
giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả
năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước
khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme
hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ
và hiệu quả khử lignin.
2.1.2.3 Trong công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền và
không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra
các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng
cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi
chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean
thay cho việc sử dụng đá bọt. Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải
jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo
ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt. Ngoài ra , người ta có thể
ĐỒ ÁN KTQTSH

9


tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm lượng cellulase sử dụng
trong giai đoạn giặt.
2.1.2.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng sự

tiêu hóa hấp thụ thức ăn cho động vật - đặc biệt động vật còn non, do đó sẽ giảm chi
phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn.
2.1.2.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần
chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy
thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường
tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi
rượu tăng lên 1,5%.
2.1.2.5 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải hữu
cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp. Trong các chất thải hữu cơ có nguồn
gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50%. Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường
là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên. Nếu để các chất hữu cơ phân
hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng ở
điều kiện khí hậu nhiệt đới); tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulase thì thời
gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng. Điều này rất có ý nghĩa trong
việc
bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thời thúc đẩy quá
qua trình chuyển hóa trong tự nhiên.
Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra
các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và
sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy
ĐỒ ÁN KTQTSH

10


thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này
chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định

tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các
cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase
đem lại hiệu quả cao.
2.1.3 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam và trên thế giới
2.1.3.1 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam [13]
Ở Việt Nam chưa có một chế phẩm enzyme cellulase nào được sản xuất chủ động
từ những nguồn nguyên liệu trong nước. Việc sản xuất chỉ mới dừng lại ở việc nghiên
cứu nên nhu cầu enzyme chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài.
Năm 1999, Nguyễn Đức Lượng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
cellulase từ Astinomyces griseus.
Năm 1999, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất
chế phẩm Micromix 3 để bổ sung vào bể ủ rác thải.
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
và đặc điểm cellulase từ chủng Aspergillus niger.
2.1.3.2 Tình hình sản xuất enzyme cellulase trên thế giới
Ở Nhật Bản, theo Yamada (1977), có khoảng 48 tấn cellulase được sản xuất từ Tr.
Viride và Asp. Niger.
Ở Mỹ, phòng thí nghiệm của quân đội Mỹ và trường đại học Rusgers đầu tiên sử
dụng chủng T.viride hoang dại để sản xuất cellulase sau đó gây đột biến và chọn lọc
được biến chủng QM 9414 có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao.
Ở Pháp, hãng Lyven sản xuất cellulase từ Tr. Reesei và Asp. Niger sử dụng trong
công nghệ thực phẩm.
Ở Canada, hãng Logene sản xuất cellulase sử dụng trong thức ăn gia súc, công
nghiệp giấy, sản xuất ethanol.
ĐỒ ÁN KTQTSH

11


Ở Nhật Bản, hãng Nagada, Amano… hằng năm đã sản xuất đến 8000 tấn enzyme

các loại để dùng trong nông nghiệp.
2.2 Giới thiệu về Trichoderma reesei.

2.2.1. Lịch sử nghiên cứu của Trichoderma reesei.
Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được
biết là Trichodermaviride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà
phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học
khác. Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện
tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương.
Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM
6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này.
Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM
6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người
đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick
với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế
phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma
reesei này và các thể đột biến trên chủng đó.
Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và
Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của
Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần
đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không
tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng
nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một
phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng
trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh
giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế
giới.
ĐỒ ÁN KTQTSH

12


Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm
Trichoderma reesei.
Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu đỏ trong khi chất
chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu xanh dương. (Ảnh:
Mari Valkonen, VTT Finland)
2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma reersei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì.
Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ
chất bã mía kết hợp với cám mì. Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm
ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma. reesei VTT-D80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn.
2.2.3. Hình thái của Trichoderma reesei.
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ
khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không
màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình
elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng
xanh, lục xỉn đến lục đậm.
ĐỒ ÁN KTQTSH

13


Hình 2.2 Hình thái Trichoderma reesei
2.2.4. Đặc Điểm
Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một
số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Nấm
Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số
giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào

trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc
với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi
được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt
rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn
hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năng
này.
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh
và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt
nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn
công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát
triển của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh
trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển
bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký
ĐỒ ÁN KTQTSH

14


sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các
điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập
chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh.
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ
chế sinh sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận
nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát
sinh học. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ
yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa
trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng. Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài.

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei
2.2.5. Ứng dụng

2.2.5.1. Lương thực và ngành dệt
Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả
cao. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme
khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng
trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích
tương tự.
2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học

ĐỒ ÁN KTQTSH

15


Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng
ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản
xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử
dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho
cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây.
2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng
Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm
qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích
thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường.
Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong
thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng
có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu
này giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.
Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm
Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây
không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ.
2.2.5.4. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá
các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có
nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong
chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được
thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển.
2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ
Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nông
dân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất. Hệ vi sinh vật suy giảm
đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển
và phát tán rất nhanh trong mùa mưa.
ĐỒ ÁN KTQTSH

16


Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần được
quan tâm thúc đẩy. Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh
việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu
hiệu. Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng
Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có
trong đất.
Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một
giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trường
của vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài.
Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây
thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã
được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnh
Lâm Đồng những năm qua.
2.3 Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-Oglucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ
gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase
hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ
có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.

ĐỒ ÁN KTQTSH

17


Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase
2.3.1. Tính chất hóa lý của enzyme cellulase
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh
nhất ở nhiệt độ, pH nhất định.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi

tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc
enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ
thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị
biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới
00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt
độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở
550C.
 Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi

trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để
enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây

cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,05,0.
ĐỒ ÁN KTQTSH

18


 Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự

hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể
gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme.


Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến
hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản
chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme
là khác nhau. Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone
đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt
tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và
triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó
SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%.

2.3.2. Các nguồn thu nhận enzyme
Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật
và vi sinh vật. Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển
mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật
nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi
cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như
thu enzym từ nguồn thực vật và động vật.
Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và
nuôi cấy bề sâu. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay

phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới
hóa và tự động hóa.
2.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất
enzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng.
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh,
bột đậu tương,… Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc

ĐỒ ÁN KTQTSH

19


mầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng. Môi trường lỏng ít dùng để nuôi cấy nấm
mốc theo phương pháp này.
- Ưu điểm của phương pháp này:
+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ không phức tạp.
+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so
với nuôi cấy chìm.
+ Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản.
+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành
công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém.
+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý.
- Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:
+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn.
+ Tốn nhiều diện tích cho quá trình nuôi cấy.
2.3.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật cellulase
2.3.4.1 Nguồn Cacbon
Trong môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất
cảm ứng và nguồn cacbon. Nấm sợ có khả năng đồng hóa rất nhiều cacbon khác nhau. Nguồn

cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản
ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner
Doudorff . Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase thường là giấy lọc
,bông,bột cellulose,cám , lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm,than bùn... Các chủng
Trichoderma nuôi trên môi trường có nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất.
Ngày nay, bã mía được dùng như một chất cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase.
2.3.4.2 Nguồn Nitơ

ĐỒ ÁN KTQTSH

20


Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là muối
nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông (Hyphomycetates) nguồn nitơ tốt nhất lại là
(NH4)2HPO4. Nói chung các muối amon ít tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này,
thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng môi trường trong các muối này làm
cho môi trường acid hóa. Điều này không những ức chế trong quá trình sinh tổng hợp
enzyme mà còn có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành
cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase.
Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và cao nấm
men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật, nhưng với cao ngô khả
năng sinh tổng hợp C1 – và C2 – cellulase cao hơn so với cao nấm men.
2.3.4.3 Nguồn khoáng chất
Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu,…) có ảnh hưởng rõ rệt đến khả
năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành
enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11 – 22 mg/l, sắt 2 – 10 mg/l,
Mn: 3,4 – 27,2 mg/l.
2.3.4.4 Chất kích thích sinh trưởng

Biotin và tiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổng
hợp enzyme này.
2.3.5 Môi trường sinh tổng hợp enzyme
Môi trường nuôi nấm mốc để sinh tổng hợp enzyme cellulase bằng phương pháp bề mặt
với nguyên liệu chủ yếu là bã mía kết hợp cám mì, các chất khoáng cần thiết và một số chất
khác. Ngoài ra trong môi trường còn sử dụng trấu để tăng độ xốp của môi trường.
Tỷ lệ thành phần môi trường tính theo lượng chất khô tuyệt đối như sau:
Bã mía

ĐỒ ÁN KTQTSH

: 62,72%

21


Cám mì

: 26,28%

Trấu

: 10%

MgSO4

: 0,05%

KH2SO4

: 0,2%

NH4NO3

: 0,15%

2.3.6 Một số lưu ý trong sinh tổng hợp enzyme cellulase
- Nhiều nhà nghiên cứu cho biết cellulose là nguồn cơ chất thích hợp nhất đối với
sự tổng hợp cellulase. Rõ ràng đây là sự tổng hợp mang tính chất cảm ứng mà cellulose
là “chất cảm ứng”. Do đó nồng độ của nó trong môi trường nuôi sẽ có ảnh hưởng lớn
đến năng suất của quá trình nuôi cấy.
- Một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cellulase như glucose, succinat,
citrat, các sản phẩm trung gian của chu trình kreb…
- Cao nấm men, cao bắp, pepton có thể là chất tăng sinh tổng hợp cellulase ở một số
chủng vi sinh vật. Một số acid amin như: aspartic, valin…tăng cường tổng hợp cellulase.
- Nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự tổng hợp cellulase như: Fe, Mn, Zn, Co,
….pH thích hợp cho tổng hợp cho đa số nấm tích tụ cellulase là 4,6. Nhiệt độ thích hợp
÷
cho tổng hợp cellulase là 28 30oC. Đa số cellulose chịu nhiệt độ cao, enzyme chịu

được 90

÷

1000C trong vài phút như cellulose của Tricoderma viride, khi nâng lên

1000C/5 phút hoạt tính vẫn giữ được 96%.
2.4 Tổng quan về bã mía.

Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase.

Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/ năm. Ở Việt Nam,Bã
mía phần lớn dùng để đốt lò hơi,làm phân bón hữu cơ,bột giấy, trồng nấm ăn... Tuy
nhiên, không sử dụng hết và đã gây ôi nhiễm cho môi trường xung quanh. Bã mía có

ĐỒ ÁN KTQTSH

22


hàm lượng cellulase rất cao hơn 40% ( theo A.G.Keller,1964 là 46%) ngoài ra còn
chứa:
 Bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép. Trong bã mía chứa trung bình 49%

là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 45-55% cellulose) 2,5% là chất hoà tan (đường).
 Hemicellulose: 30%
 Hàm lượng lignin trong bã mía khá lớn với chiếm khoảng 20% khối lượng nguyên

liệu. Lignin vốn là một thành phần khó phân hủy thường gây ảnh hưởng đến sự
phát triển của vi sinh vật.
2.5 Tổng quan về cám mì.

Thành phần chính của cám mì

Chất khoáng có trong cám mì
ĐỒ ÁN KTQTSH

23


Amino axit cám mì

Cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6:4) do nó có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng
cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi, có tính chất vật lý
rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng
cần thiết.

ĐỒ ÁN KTQTSH

24


Chương 3: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN
CÔNG NGHỆ
3.1 Chọn dây chuyền công nghệ
Trong công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay có hai phương pháp: phương pháp
nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu.
So sánh hai phương pháp ta thấy phương pháp nuôi cấy bề mặt có những ưu điểm sau:
- Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ không phức tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so
với nuôi cấy chìm.
- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành
công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý.
- Trong kĩ thuật nuôi cấy bề mặt có hai loại môi trường nuôi cấy, đó là môi trường bán
rắn và môi trường lỏng. Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt dung dịch
lỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí. Khi đó các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành những
ván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng. Enzyme sẽ được tổng hợp trong tế bào và thoát khỏi tế
bào vào trong dung dịch nuôi cấy. Do đó việc thu nhận enzyme thô trong dịch nuôi cấy
cũng rất đơn giản. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực của
enzyme thu nhận được của phương pháp này không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bán

rắn. Một mặt phương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ sử dụng
môi trường nuôi cấy không cao. Vì vậy phương pháp này ít được dùng.

ĐỒ ÁN KTQTSH

25