Phân lập và nuôi cấy Bacillus subtilis sản xuất protease

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CNSH & MT
------------------------------

1959

BÁO CÁO TH CÔNG
NGHỆ VI SINH VẬT
Đề tài : PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY BACILLUS

SUBTILIS SẢN XUẤT PROTEASE
GVHD

: Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

SVTH

: Nhóm 6
1.
2.
3.
4.

Lớp

Nguyễn Thị Thanh Tuyền
Huỳnh Thị Hậu
Nguyễn Mạnh Tƣờng
Đặng Thị Kim Hƣờng

: 54CNSH

Nha Trang, tháng 05 năm 2015


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
MỤC LỤC
DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ..........................................................................3
LỜI NÓI ĐẦU ....................................................................................................4
1.

Dụng cụ, hóa chất, môi trường tổng hợp phân lập ..........................................5
1.1.

Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................5

1.2.

Hóa chất ...............................................................................................5

1.3.

Môi trường ...........................................................................................5

2.

Nguồn phân lập ............................................................................................6

3.

Quy trình phân lập .......................................................................................6
3.1.

Cách lấy mẫu ........................................................................................6

3.2.

Phân lập ...............................................................................................6

3.2.1.
3.3.

Giữ giống ........................................................................................... 10

3.3.1.
4.

5.

Nhuộm Gram ..................................................................................9
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa ........................................................... 11

Quy trình sản xuất protease......................................................................... 14
4.1.

Lên men ............................................................................................. 14

4.2.

Thu enzyme protease .......................................................................... 14

4.3.

Tinh sạch enzyme ............................................................................... 14

4.4.

Thử hoạt tính protease với casein......................................................... 15

Thảo luận................................................................................................... 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 17

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 2 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
Sơ đồ 1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất. ...............................................7
Hình 1. Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis..........................................................8
Hình 2. Khuẩn lạc B. subtilis cấy trang. ................................................................8
Hình 3. Cấy tia khuẩn lạc B. subtilis. ....................................................................9
Hình 4. ết quả nhuộm Gram. ........................................................................... 10
Hình 5. Ống giống. ............................................................................................ 10
Hình 6. ết quả test catalase. ............................................................................. 11
Hình 7. ết quả test Casein. ............................................................................... 12
Hình 8. ết quả test Simmons Citrate (-). ........................................................... 13
Hình 9. ết quả test MR – VP. Kết quả (+)......................................................... 14
Hình 10. ết quả kiểm tra hoạt tính enzyme. ...................................................... 16

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 3 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
LỜI NÓI ĐẦU

Với mục tiêu tạo ra 100 ml protease. Hiểu rõ hơn quy trình sản xuất
protease từ Bacillus subtilis. Với các kỹ thuật cơ bản cùng với điều kiện cơ sở vật
chất phòng thí nghiệm trường Đại Học Nha Trang, nhóm đã phân lập và nuôi cấy
thành công chủng Bacillus subtilis phục vụ sản xuất protease.
- Protease là nhóm enzym được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực như:
nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm ...
- Nghiên cứu về protease vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ nhưng có rất
nhiều triển vọng ở nước ta.
- Có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, từ
nội tạng động vật, từ vi sinh vật. Trong đó protease từ vi sinh vật nhất là từ
Bacillus subtilis có nhiều triển vọng vì Bacillus subtilis có khả năng sản xuất
protease có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn.
- Sơ lược về Bacillus subtilis. Giới : Bacteria, Nghành: Firmicutes, Lớp:
Bacilli, Bộ: Bacillales, Họ: Bacillaceae, Chi: Bacillus.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 4 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

ẢN XUẤT PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS PHÂN
LẬP TỪ NGUỒN ĐẤT VEN BIỂN ỨNG DỤNG PHÂN
GIẢI PROTEIN VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN –
CHITOSAN.

S

1. Dụng cụ, hóa chất, môi trƣờng tổng hợp phân lập
1.1.

Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc
(vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím, …
 Dụng cụ
Đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo pH,
bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang,…
Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều đƣợc xử lý
sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C/15ph.
1.2.

Hóa chất

 Hóa chất cơ bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, acid acetic,…
 Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh hóa: NaOH 40%, α naphtol 10%, acid sulfanilic,…
 Thuốc thử owac’s, Methyl-Red,…
 Thuốc dùng cho phương pháp nhuộm Gram.
1.3.

Môi trƣờng

Sử dụng các môi trường nuôi cấy tổng hợp sau:
 Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya

Agar) gồm 3g TSB, 100 ml nước cất, 1,5 g agar.
Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 5 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
 Môi trường khảo sát các đặc điểm sinh hóa: TSB (Trypticase Soya
Broth), Clark Clubs, Simon Citrate agar, môi trường lòng đỏ trứng, môi trường
Nitrate, môi trường lên men đường Maltose,…
 Môi trường tăng sinh Nutrien Broth
Thành phần: Cao thịt 3g, Pepton 5g Nacl 5g, Agar 18g, 1000 ml nước cất
2x.
 Môi trường tăng sinh Nutrien Agar
Thành phần: Trypton 10g, NaCl 5g, Meat extract 5g, nước cất 2x
2. Nguồn phân lập
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất
trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,
vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng
như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
3. Quy trình phân lập
3.1.

Cách lấy mẫu

Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất mặt ở dưới. Cân 1g mẫu
đất cho vào bình tam giác có chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều,
được nồng độ pha loãng 10-1. Đem đi gia nhiệt ở nhiệt độ 650C trong 15 phút để
loại bớt vi khuẩn không sinh bào tử.
Lấy 5 mẫu đất mỗi mẫu 1g đất cho vào 5 ống nghiệm, trong đó có 2 mẫu
đất vườn (DV1, DV2) và ba mẫu đất biển (DB1, DB2, DB3).

3.2.

Phân lập

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ
tự từ 1 đến 4 cho mỗi mẫu đất.
Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có
nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được
nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng.
Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng
micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi
Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 6 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa
TSA này vào tủ ấm ủ ở 370C/24h.
Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi
ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis khuẩn lạc nhăn,có vòng trong suốt xung
quanh, tâm có màu nâu đen càng để lâu màu nâu đen càng rõ, dùng que cấy vòng
cấy ria phân lập trên môi trường TSA sau đó bắt và cấy giữ giống lại trên môi
trường TSA nghiêng.

Sơ đồ 1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 7 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 1. Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis.
Kết quả: mẫu DV1, DB1 có khuẩn lạc của B.subtilis mọc.

Hình 2. Khuẩn lạc B. subtilis cấy trang.
Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 8 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 3. Cấy ria khuẩn lạc B. subtilis.
3.2.1. Nhuộm Gram
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để
quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần.
Các chỉ tiêu quan sát: Sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi
khuẩn, có hay không có bào tử.
Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn nào phù
hợp với những đặc điểm sau của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : Là trực khuẩn,
hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả
năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế
bào) thì tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 9 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 4. Kết quả nhuộm Gram.
3.3. Giữ giống
Chuẩn bị môi trường TSA nghiêng trong các ống nghiệm, cấy giữ giống
nuôi ở 37 C trong 24h và đem đi bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C.

0

Hình 5. Ống giống.
Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 10 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
3.3.1. Kiểm tra đặc điểm sinh hóa
 Test catalase
Nhỏ vài giọt H2O2 vào sinh khối vi khuẩn đã phân lập trên đĩa peptri thấy
xuất hiện sủi bọt.

Hình 6. Kết quả test catalase.


Test Casein

Cách tiến hành:


Chuẩn bị môi trường: Cân 5g Casein, 1,5g agar, trong 100ml nước

cất.

Hấp môi trường và đổ thạch vào đĩa petri, để môi trường đông lại.

Dùng tăm bông lấy vi khuẩn từ mẫu DV1, DB1đã phân lập trước đó
cấy vào đĩa petri.

Ủ ở 370C trong vòng 3 ngày.


Quan sát thấy có vòng trong suốt xung quanh đường cấy là kết quả
dương tính.
Kết quả: Cả hai mẫu DB1 và DV1 vi khuẩn đều có khả năng phân giải
casein hình thành vòng phân giải tuy nhiên hoạt tính của chủng DV1 mạnh hơn so
với chủng DB1 nên sử dụng DV1 để sản xuất protease.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 11 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 7. Kết quả test Casein.
 Test simmons citrate

Chuẩn bị môi trường: Cân 4,5g Simmons Citrate Agar (SCA) và
200ml nước cất vào trong bình tam giác, hấp khử trùng.

Môi trường SCA và chỉ thị bromothynol blue, pH < 6 màu vàng, pH
trung tính màu xanh lục, pH > 7.6 màu xanh dương.

Cấy ria vi khuẩn lên môi trường SCA

Ủ 35oC trong 24 – 48 h

Kết quả:
o
( - ): hông có khuẩn lạc môi trường xanh lục
o
(+): Có khuẩn lạc mọc môi trường màu xanh dương.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 12 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 8. Kết quả test Simmons Citrate (-).
 Test MR – VP

Chuẩn bị môi trường: cân 1,7g MR –VP trong 100ml nước cất trộn
đều cho vào ống nghiệm hấp khử trùng.

Cấy vào mỗi ống các chủng vi khuẩn DV1, ủ ở 37oC trong vòng
24h.

Kiểm tra bằng thuốc thử:
o
Test MR: Cho 2 đến 3 giọt methyl đỏ vào ống nghiệm thấy có xuất
hiện màu đỏ là dương tính.
o
Test VP: Sử dụng Napton và OH 40% cho vào ống nghiệm nuôi
cấy thấy có xuất hiện màu đỏ thẫm ở trên là dương tính.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 13 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 9. Kết quả test MR – VP. Kết quả (+).


Qua kết quả của các test khẳng định đó là chủng vi khuẩn B.

subtilis.
4. Quy trình sản xuất protease
4.1. Lên men
Cho vào 2 bình tam giác mỗi bình 1,5g TSB, 0,25g casein và 50 ml nước
cất, đem đi hấp khủ trùng.
Cấy chủng vi khuẩn thu từ DV1 vào hai bình tam giác trên, nuôi lắc ở
nhiệt độ phòng trong 24h.
4.2.

Thu enzyme protease

Sau 24h nuôi cấy, thu dịch chứa enzyme bằng cách ly tâm với tốc độ
3500 rpm trong 45 phút.
Thu dịch bỏ cặn chú ý thao tác nhẹ nhàng tránh xáo trộn cặn làm sinh
khối bị lẫn vào enzyme.
4.3. Tinh sạch enzyme
Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 14 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
Sử dụng aceton để kết tủa với tỷ lệ 1 : 4. Trong 10ml dịch enzyme cho
vào 40ml aceton trong vòng 60 phút trong điều kiện lạnh 40C.
Sau đó đem đi ly tâm 3500 rpm trong vòng 15 phút thu cặn loại bỏ dịch.
Hòa cặn tỷ lệ 2 : 3 với đệm phosphat (pH = 7): 19,5ml NaH2PO4 0,2M
và 30,5ml Na2HPO4 0,2M.
4.4. Thử hoạt tính protease với casein


Chuẩn bị môi trường test: Cân 0,14g casein vào 1,5g agar trong
50ml nước cất, hấp khử trùng môi trường, đổ lên đĩa petri, để nguội.

Dùng đầu tuýp micropipet 1000µl tạo các giếng tròn trên đĩa thạch.

Cho 10µl enzyme vào trong mỗi giếng.

Ủ ở 370C trong 24h.

Quan sát thấy có vòng phân giải xung quanh giếng, nếu vòng phân
giải càng lớn hoạt tính protease càng mạnh.
Kết quả: có hình thành vòng phân giải nhưng hoạt tình không mạnh.
Nguyên nhân: có thể do lượng enzyme thu được quá thấp vì thời gian kết
tủa ngắn, enzyme chưa tủa hoàn toàn, đem ra môi trường enzyme mất hoạt tính.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 15 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Hình 10. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme.
5. Thảo luận

hó khăn:

Trong quá trình kết tủa thu enzyme do thời gian kết tủa quá ngắn,
hiệu quả kết tủa không cao. hi ly tâm không thu được cặn và dịch chiết vẫn còn
chứa protease chưa kết tủa.

Tiến hành thử hoạt tính của cả dịch và enzyme kết tủa.

 Đề xuất

Cần chú ý thao tác vô trùng cẩn thận, trong box cấy. Trước khi sử
dụng phải bật đèn UV để khử trùng.

Tất cả các mẫu không được bỏ đi khi chưa chắc chắn kết quả.

Dụng cụ, môi trường cần phải hấp khử trùng trước khi sử dụng.

Thời gian kết tủa phải đủ 60 phút tốc độ ly tâm cao để thu được tủa
protease.

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 16 of 17


GVHD. Th.S. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phước (1996), Công nghệ vi sinh
vật. Tập 2: Vi sinh vật công nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, trường Đại Học Bách hoa.
Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB giáo dục, Hà Nội.
TS. Phạm Quang Chinh, PGS.TS. Biền Văn Minh, Cách xác đinh
hoạt độ protease,
/>[17/04/2015].
Bùi Thị Phi (2007), hóa luận tốt nghiệp, Luanvan.co,
/>[16/04/2015].

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 17 of 17