thí nghiệm hóa sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh- Sinh học phân tử
------

TÓM TẮT THỰC HÀNH
THÍ NGHIỆM HÓA SINH

1


Hà nội, 2016

2


Lịch Thí nghiệm
Kỳ II-Năm học 2015-2016
Tuần 29 (22/2-27/2/2016)
Bài 1: Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Ken-đan
Tuần 30(29/2-5/3)
Bài 2: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Lowry
Tuần 31(7/3-12/3)
Bài 3. Xác định hàm lượng đường khử tổng (theo phương pháp Rodzevich)
Tuần 32 (14/3-19/3)
Bài 4. Xác định hàm lượng đường không khử (saccarose bằng thủy phân, xác định đường khử theo
phương pháp Rodzevich)
Tuần 33: Nghỉ
Tuần 34 (28/3-2/4)
Bài 5: Phân tích thành phần đường/oligosaccharit bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
Tuần 35 (4/4-9/4)
Bài 6: Xác định hàm lượng vitamin C bằng 2,6 diclophenolindophenol (2,6 DCIP)

Tuần 36 (11/4-16/4)
Bài 7: Xác định hoạt độ enzym glucoamylase
Bài 8: Xác định hoạt độ enzym protease theo phương pháp Anson cải tiến
Tuần 37 (18/4-23/4)
Bài 9. Xác định các chỉ số hóa lý của chất béo (chỉ số axit, xà phòng và peroxyt)
Tuần 38 (25/4-30/4)
Ôn thi
Tuần 39 (18/5-23/5)
Thi kết thúc học phần
Lịch thí nghiệm:
Thời gian
Mã lớp
GV phụ
trách

Thứ 2
13h3017h30
650276
650277
Cô Kim
Anh/ Thầy
Cương

Thứ 3
13h3017h30
650278
650279

Thứ 4
13h3017h30

650280
650281

Thầy
Cương /
Cô Kim
Anh

Cô Kim
Anh/
Thầy
Cương

Thứ 5
13h3017h30
650282
650283
Thầy
Hòa/thầy
Phong

Thứ 6
13h30-17h30

Thứ 7
7h30-11h30

650284
650285

650286
650287

Thầy
Phong/Thày
Hòa

Thầy Hòa/Thày
Phong

Địa điểm: C10-Phòng 108A và 108B
Tài liệu:

- Thí nghiệm Hoá sinh công nghiệp - Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Nguyễn Thị
Xuân Sâm. Trường Đại học Bách khoa HN 1997.
- Tài liệu Hướng dẫn thực hành, Bộ môn Hoá sinh- ĐHBK HN 2015

Yêu cầu:
o Trước khi đến làm thí nghiệm sinh viên tìm hiểu về nguyên tắc của phương pháp, các
bước tiến hành thí nghiệm, thiết lập công thức tính toán kết quả thí nghiệm.
o Có mặt đúng giờ, tham gia đầy đủ các bài thí nghiệm.
o Tuân thủ đúng các nguyên tắc an toàn phòng thí nghiệm.
o Làm thí nghiệm theo nhóm và báo cáo thí nghiệm theo yêu cầu
3


Bài 1. Xác định hàm lượng nitơ tổng số
(theo phương pháp Ken-đan)
Yêu cầu chuẩn bị: đọc kỹ tài liệu phần đốt đạm và cất đạm
Mẫu thí nghiệm: các mẫu chứa nitơ, protein..., được PTN chuẩn bị

Giai đoạn vô cơ hoá: xem tài liệu Thí nghiệm Hoá sinh Công nghiệp
Giai đoạn cất đạm: thực hiện trên bộ cất đạm lượng nhỏ
1. Phần chuẩn bị
-

Kiểm tra mức nước trong bình tạo hơi nước, bình nước sinh hàn.
Cho nước chạy qua sinh hàn
Kiểm tra các khoá của bộ cất
Đun sôi nước trong bình tạo hơi nước

2. Cất đạm
Mẫu thí nghiệm
Chuẩn bị bình hấp thụ: Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):
20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
2-3 giọt chỉ thị Taxiro
Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung dịch )
Cho vào bầu cất (lần lượt)
5 ml mẫu đạm thí nghiệm (dịch vô cơ hoá) (dùng pipet)
2 ml H2O (để tráng phễu) (dùng pipet)
5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
đóng khoá bầu cất
Tiến hành cất. Sau khi thấy dung dịch trong bình hấp thụ chuyển từ màu tím hồng xanh màu
xanh đợi khoảng 5 phút. Hạ bình hấp thụ, dùng giấy quì tím hứng một giọt nước ngưng chảy ra
từ ống sinh hàn. Nếu thấy giấy đổi màu, đặt bình hấp thụ vào vị trí cũ. Trái lại, lấy bình hấp thụ
ra khỏi bộ cất (tia nước, tráng đầu cuối ống sinh hàn bằng một ít nước cất).
Mẫu kiểm chứng
Chuẩn bị bình hấp thụ: Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):
20 ml H3BO3 3%
2-3 giọt chỉ thị Taxiro
Lắp bình vào bộ cất đạm (đầu cuối ống sinh hàn ngập trong dung dịch !)

Cho vào bầu cất:
5 ml H2O (thay cho dịch vô cơ hoá)
2 ml H2O (để tráng phễu)
5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
đóng khoá bầu cất
Tiến hành cất khoảng 3-5 phút và dùng giấy quì tím thử điểm kết thúc quá trình cất kiểm tra
tương tự như mẫu thí nghiệm.
3. Rửa bộ cất đạm: theo hướng dẫn trực tiếp của phòng thí nghiệm.
4


4. Định phân
Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo ra trong bình hấp thụ bằng H2SO4 0,1N. Điểm tương
đương của phản ứng được xác định khi dung dịch chuyển từ màu xanh qua màu tím hồng.
Ghi lượng H2SO4 0,1N dùng định phân cho mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng.
5. Yêu cầu tính toán
- tính tổng hàm lượng nitơ của dịch cất đạm (%) biết rằng 1 ml H2SO4 0,1N tiêu tốn cho
định phân tương ứng với 1,4 mg nitơ có trong mẫu cất;
- giả thiết mẫu thí nghiệm là dịch vô cơ hoá protein kết tủa từ 5 g mẫu và được định mức
lên 100 ml. Hãy tính hàm lượng protein (%) trong mẫu đầu.

5


Bài 2. Xác định hàm lượng protein hòa tan
(theo phương pháp Lowry)
1. Mẫu thí nghiệm: mẫu thực phẩm chứa protein được PTN chuẩn bị
2. Chuẩn bị dịch protein phân tích
- chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml
- cân chính xác 0,3 g mẫu, chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc

vào để làm ẩm
- nghiền mẫu
- chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml. tráng sạch cối chày bằng dung
dịch NaOH 0,1N còn lại
- đặt bình mẫu vào nồi cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút
- lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà mẫu tới pH 7 bằng HCl 5%, dùng giấy pH làm chỉ thị.
- chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Lắc đều.
- lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.
3. Làm phản ứng màu
Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch
Mẫu thí nghiệm
Lấy vào ống nghiệm 1: 0,3 ml dịch lọc protein (dùng pipet)
3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha)
(dùng pipet)
Trộn đều. Để yên phản ứng 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều. Để phản ứng 30
phút.
Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm )
Lấy vào ống nghiệm 2: 0,3 ml nước cất (dùng pipet)
3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha)
(dùng pipet)
Trộn đều. Để yên phản ứng 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều. Để phản ứng 30
phút.
Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch phản ứng
Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN
Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở 750 nm, so sánh
với mẫu kiểm chứng (có thể đo riêng hoặc dùng mẫu kiểm chứng để chỉnh máy). Ghi
kết quả. Sử dụng đường chuẩn protein để xác định hàm lượng protein của dung dịch
nghiên cứu.

4. Yêu cầu tính toán:
- tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm theo % (w/w)

6


Hướng dẫn xây dựng đồ thị đường chuẩn protein
1. Dung dịch Albumin huyết thành bò (BSA) gốc: 0,5mg/ml
2. Làm phản ứng màu:
Chuẩn bị 1 dãy 6 ống nghiệm sạch, khô. Lấy vào các ống lần lượt các dung dịch với lượng
tương ứng như trong bảng sau.
Bảng chuẩn bị dung dịch
(xây dựng đồ thị chuẩn cho phương pháp Lowry)
Ống nghiệm
1
2
3
4
5
6
BSA gốc
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,5mg/ml (ml)
Nước cất (ml)
0,5

0,4
0,3
0,2
0,1
0
Dung dịch C ml)
5
5
5
5
5
5
Trộn đều để yên phản ứng 10 phút
Dung dịch Folin
0.5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
(ml)
3. Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch phản ứng
Trộn đều hỗn hợp phản ứng bằng vortex, để yên phản ứng 30 phút
Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch phản ứng tại bước sóng 750nm với mẫu đối sánh
là mẫu trong ống nghiệm số 1.
4. Dựng đồ thị đường chuẩn theo số liệu đo được
0.5
y = 0.8674x + 0.0045
R2 = 0.9994

0.45
0.4
OD 750nm

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Nồng độ protein (mg/ml)

Đồ thị đường chuẩn protein (BSA)

7


Bài 3. Xác định hàm lượng đường khử tổng số
(theo phương pháp Rodzevich)
Mẫu thí nghiệm: mẫu chứa đường khử (hoa quả, đường glucose..).
1. Chuẩn bị dung dịch đường phân tích
- Cân chính xác 5 g mẫu cho vào cối nghiền nhỏ với một lượng nhỏ nước cất.
- Chuyển mẫu vào bình tam giác 100 ml. Tráng rửa cối, chày (khoảng 30 ml).
- Trung hoà mẫu đến pH7 bằng NaOH 5% với chỉ thị phenolphtalein.
- Đặt bình mẫu vào bình ổn nhiệt ở 70-80oC trong 15 phút để chiết đường.
- Làm nguội, kết tủa protein trong dịch mẫu bằng axetat chì 10%. Loại chì dư bằng
NaH2PO4 bão hoà.
- Chuyển hỗn dịch vào bình định mức 100 ml, định mức tới 100 ml bằng nước cất.
- Lắc đều, lọc và thu dịch lọc: dịch đường phân tích.
2. Xác định đường khử
Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 1 (bình 50ml):
3 ml nước cất
1 ml Felin 1
1 ml Felin 2
Trộn đều mẫu. Đun sôi 2 phút, tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên. Làm
nguội.
1 ml H2SO425%, trộn đều mẫu.
1 ml KI 30%, trộn đều mẫu.
Để phản ứng trong 20 phút.
Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (xuất hiện màu trắng sữa
toàn bình)
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 2 (bình 50ml):
1 ml dịch đường phân tích
1 ml Felin 1

1 ml Felin 2
2 ml nước
Trộn đều mẫu. Đun sôi 2 phút, tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên. Làm
nguội.
1 ml H2SO425%, trộn đều mẫu.
1 ml KI 30%, trộn đều mẫu.
Để phản ứng trong 20 phút.
Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (xuất hiện màu trắng sữa
toàn bình)
3. Yêu cầu tính toán: Tính hàm lượng đường khử tổng số (%),
Biết rằng cứ 1 ml Na2S2O3 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ tương đương với 3,3 mg đường khử có
trong mẫu phân tích.

8


Bài 4. Xác định hàm lượng saccarose (đường không khử)
(theo phương pháp thủy phân với axit và định lượng đường khử bằng phương pháp DNS)
Mẫu thí nghiệm: nước ngọt chứa saccarose
1. Chuẩn bị dịch đường khử trước thuỷ phân
Dùng pipet cho 1 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức bằng
nước cất tới vạch mức. Trộn đều, được dịch đường khử trước thuỷ phân.
2. Chuẩn bị dịch đường khử sau thuỷ phân saccarose
Cho 1 ml mẫu vào bình 100 ml (dùng pipet), thêm 19 ml nước cất (dùng ống đong) và 10
ml HCl 5% (dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách thuỷ 30 phút để thuỷ phân
saccarose. Làm nguội và trung hoà mẫu bằng NaOH 5% với giấy chỉ thị pH. Chuyển toàn
bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch mức. Trộn đều,
được dịch đường khử sau thuỷ phân.
3. Xác định đường khử theo phương pháp Rodzevich (xem bài 3)
4. Tính toán:

Tính hàm lượng saccarose trong mẫu ban đầu theo %

9


Bài 5. Phân tích thành phần đường/oligosaccharit
bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
(Thin Layer Chromatography-TLC)
- Mẫu phân tích: Hỗn hợp đường (môn- và oligosaccharit) (PTN chuẩn bị)
- Hệ dung môi: hỗn hợp n-propanol: nitromethan: nước = 7:1:2 (v/v/v)
- Bản sắc ký: Sắc ký bản mỏng loại Silicagel 20x20cm
- Chuẩn bị bản sắc ký: Cắt bản sắc ký theo kích thước ở hình dưới, lưu ý đi găng tay và giữ
sạch bản mỏng
.

Đường chấm mẫu
mẫ umẫ ummẫ u
- Chấm mẫu
Đánh dấu vị trí và tên mẫu
Thao tác mang mẫu lên bản sắc ký được thực hiện như sau:
- Lấy mẫu bằng ống mao quản thuỷ tinh. Lưu ý không để lẫn ống/mẫu
- Chấm mẫu vào vị trí chấm mẫu, đường kính vết loang không vượt quá 5 mm.
- Chạy sắc kí
- Đặt bản sắc kí đã chấm mẫu vào bình sắc ký có chứa dung môi hữu cơ đã bão hoà hơi dung
môi, mép dưới bản sắc kí được nhúng vào dung môi (sao cho không ngâm ngập mẫu trong
dung môi), mặt chấm mẫu hướng xuống phía dưới
- Quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của tờ sắc kí 1cm
- Lấy bản sắc kí ra, đánh dấu vị trí của vệt dung môi
- Sấy khô bản sắc kí
- Phát hiện mẫu

- phun đều dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối lên bản sắc ký (hoặc nhúng nhanh bản
sắc ký vào khay đựng dung dịch hiện màu trên)
- sấy khô bản sắc ký ở 1100C trong 5 phút (hoặc hơ bản mỏng trên bếp điện), xuất hiện dần
các vết màu.
- Ghi kết quả
- xác định hệ số Rf của các vị trí mẫu đường/oligosaccharit
- xác định tên và vị trí của các đường/oligosaccharit có trong mẫu phân tích dựa trên mẫu
chuẩn
Ghi chú:
Nguyên tắc chung của phương pháp TLC được trình bày trong chương Lipit trong Sách Thí
nghiệm Hoá sinh công nghiệp

10


Bài 6. Xác định hàm lượng vitamin C
(phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 DCIP)
Mẫu thí nghiệm: các loại rau, hoa quả.
1. Chuẩn bị dịch chiết vitamin C phân tích
Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit HCl 1%. Chuyển mẫu vào
bình định mức cỡ 100 ml. Định mức tới vạch bằng HCl 1%. Lắc đều, lọc và thu dịch lọc
vitamin C phân tích.
(Lượng mẫu được lấy sao cho nồng độ vitamin C nằm trong khoảng 0,5 mg/ml)
2. Chuẩn độ
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 1 (cỡ 50 ml):
10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà (dùng pipet)
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP phân tích cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
(a ml)
Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 2 (cỡ 50ml):

10 ml HCl 1% (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP phân tích cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
(b ml)
3. Xác định hệ số f
Bình tam giác 3 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong H2SO4 2% (dùng pipet)
2,5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP phân tích cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút,
(a1 ml)
Bình tam giác 4 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết (pha trong H2SO4 1%)
Vài hạt tinh thể KI
5 giọt hồ tinh bột
Chuẩn độ bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, (b1 ml).
4. Yêu cầu tính toán
- tính hệ số f hoặc xác định nồng độ 2,6 DCIP dùng trong phân tích. Hệ số f được tính : f = b1 /
a1
- Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm theo mg%
Biết 1 ml 2,6 DCIP 0,001 N tiêu tốn tương ứng với 0,088 mg vitamin C có trong mẫu phân tích.

11


Bài 7. Xác định hoạt độ protease
(Theo phương pháp Anson cải tiến)
Nguồn enzym: chế phẩm Alcalase 2,4L của Novozyme , pH tối ưu 7
Cơ chất: dung dịch casein 1%.
Đặt dung dịch cơ chất và enzym vào bình ổn nhiệt 300C 10 phút trước khi làm thí nghiệm.
1. Phản ứng enzym với cơ chất (Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)

Mẫu thí nghiệm
Mẫu kiểm chứng
ống 1
ống 2
2 ml dung dịch cơ chất casein 1% pha trong
2 ml dịch enzym pha trong đệm pH 7
đệm pH 7 (dùng pipet)
để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
2 ml dịch enzym pha trong đệm pH 7 (dùng
Bổ sung 4 ml TCA 0,3M, trộn đều
pipet)
2 ml dung dịch cơ chất casein 1% pha
Trộn đều, để phản ứng trong đúng 10 phút ở
trong đệm pH 7
30oC (trong bình ổn nhiệt)
Trộn đều, để yên hỗn hợp trong 20
Dừng phản ứng enzym bằng 4 ml TCA 0,3M
phút
(dùng pipet)
Lọc, thu dịch lọc kiểm chứng
Trộn đều và để yên hỗn hợp trong 20 phút
Lọc, thu dịch lọc thí nghiệm

2. Xác định lượng axit amin giải phóng ra trong phản ứng
(Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)
Mẫu sau thuỷ phân
Mẫu đối chứng
ống 3 0,3 ml dịch lọc thí nghiệm (dùng pipet) ống 4 0,3 ml dịch lọc kiểm chứng
1,5 ml Na2CO3 0,5M (dùng pipet)
1,5 ml Na2CO3 0,5M

Trộn đều, để 10 phút
Trộn đều, để 10 phút
Thêm 0.3 ml dung dịch Folin (dùng
Thêm 0.3 ml dung dịch Folin.
pipet)
Để phản ứng 20 phút.
Để phản ứng 20 phút.
Đo DO (=750 nm) đối ngược với mẫu đối chứng
3. Yêu cầu tính toán
- Tra đồ thị đường chuẩn giữa hàm lượng tyrosin và mật độ quang.
- Thành lập công thức và tính hoạt độ proteaza của chế phẩm enzym (U/ml ).
Định nghĩa: 1 đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 phút ở 30oC
thủy phân casein thành một lượng sản phẩm không bị kết tủa bởi axit tricloaxetic tương đương
với 1 mol tyrosin

12


XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN
1. Pha dãy nồng độ dung dịch tyrosin chuẩn
Pha dung dịch tyrosin gốc 1 µmol/ml (cân 1,81 mg pha trong 10 ml nước cất)
Pha dung dịch tyrosin 0,5 µmol/ml (lấy 5 ml dung dịch tyrosin gốc + 5 ml TCA 0.3M)
Pha dãy nồng độ theo bảng sau:
Ống
1
2
3
4
5
6

Tyrosine
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,5µmol/ml
(ml)
Nước cất
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
(ml)
Trộn đều
Nồng độ
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
tyrosine đem
làm phản ứng
màu (µmol/ml)
2. Làm phản ứng màu
Dung dịch

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Tyrosine (ml)
Dung dịch
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Na2CO3 (ml)
Dung dịch Folin
0.5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
(ml)
Trộn đều, Để phản ứng 20 phút. Đo OD 750 nm
3. Dựng đường chuẩn

13


Bài 8. Xác định hoạt độ glucoamylase

(Theo phương pháp DNS)

Nguồn enzym: chế phẩm Glucoamylase (AMG) của Novozyme
Cơ chất: dung dịch hồ tinh bột 1%
Đặt dung dịch cơ chất và enzym vào bình ổn nhiệt 300C 10 phút trước khi làm thí nghiệm.
Tiến hành (Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)
Các bước tiến
hành

Ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm)

Bước 1: phản - 0,25ml dịch enzym phân tích (đã ở
ứng xúc tác
30oC)
thủy phân tinh - 0.25 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
bột
(đã ở 30oC)
- Trộn đều và để phản ứng đúng 10
phút ở 30oC
Bước 2. Vô - Dừng phản ứng enzym bằng 1,5 hoạt enzyme,
ml DNS
dừng phản ứng - Trộn đều
Bước 3: Định - Đun sôi cách thuỷ dung dịch lượng
sản
phản ứng 5 phút (khi nồi cách
phẩm
tạo
thủy sôi mới cho mẫu vào)
thành
- Làm nguội nhanh. Thêm 10 ml

nước cất (dùng pipet). Trộn đều
mẫu
- Đo mật độ quang (=540 nm) đối
ngược với mẫu kiểm chứng

Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm chứng)

0.25ml dịch enzym phân tích
Dừng phản ứng enzym bằng 1.5
ml DNS
Trộn đều
0.25 ml dung dịch hồ tinh bột
1%, Trộn đều
Đun sôi cách thuỷ dung dịch
phản ứng 5 phút (khi nồi cách
thủy sôi mới cho mẫu vào)
Làm nguội nhanh. Thêm 10 ml
nước cất (dùng pipet). Trộn đều
mẫu

Yêu cầu xác định hoạt độ glucoamylase (HĐGA) theo số đơn vị hoạt độ trên 1 ml chế phẩm
enzym kỹ thuật (U/ml).
Định nghĩa:
- 1 đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30oC
thủy phân tinh bột tan giải phóng được 1 mg glucose.

14


Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp DNS

1. Dung dịch glucose gốc: 2mg/ml
2. Tiến hành:
Chuẩn bị 1 dãy 6 ống nghiệm sạch, khô. Bổ sung lần lượt các dung dịch theo thứ tự trong
bảng sau
Ống
Dung dịch glucose
gốc 2mg/ml (ml)
Nước cất (ml)
Dung dịch DNS (ml)

1
0
0,5
1.5

2
0,1

3
0,2

4
0,3

5
0,4

6
0,5

0,4
0,3
0,2
0,1
0
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
Đun sôi 5 phút, làm nguội nhanh trong nước lạnh

Thêm 10ml nước cất
Trộn đều dung dịch phản ứng bằng vortex
Đo độ hấp phụ ánh sáng của dung dịch tại bước sóng 540nm với mẫu đối sánh là mẫu
trong ống nghiệm số 1.
Đường chuẩn DNS ( 1/2015)
y = 0.7739x - 0.0061
R2 = 0.9997

1.8
1.6

OD 540nm

1.4
1.2
1
0.8
0.6

0.4
0.2
0
0

0.5

1

1.5

2

2.5

Nồng độ đường (mg/ml)

15


Bài 9. Xác định các chỉ số hoá lý của dầu thực vật
(Theo sách Thí nghiệm Hoá sinh Công nghiệp)

16