Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển nannochloropsis oculata (DROOP) HIBBERD sử dụng làm thực phẩm chức năng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM ĐỨC THUẬN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NUÔI VI TẢO BIỂN Nannochloropsis oculata (DROOP)
HIBBERD SỬ DỤNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành : Thực vật học
Mã số : 62.42.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2016


Cơng trình được hồn thành tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: PGS. TS. Vương Trọng Hào
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Đình San
Phản biện 3: PS. TS. Nguyễn Trung Thành

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ cấp nhà nước tại
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Số 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Vào hồi giờ

phút, ngày

tháng

Có thể tìm thấy luận án tại:
- Thư viện Cơng nghệ sinh học
- Thư viện Quốc Gia

năm 2016


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Theo xu thế thị trường hiện nay việc sử dụng thảo dược và các nguyên liệu
có nguồn gốc thiên nhiên để chăm sóc sức khỏe con người là rất quan trọng và
mang lại nhiều lợi ích to lớn. Trong đó vi tảo là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho
động vật nuôi, nuôi trồng thủy sản, nguồn nguyên liệu cho phân bón, sản xuất
nhiên liệu sinh học, bảo vệ môi trường và đặc biệt được dùng làm thực phẩm chức
năng tăng cường dinh dưỡng cho người đang được đánh giá là một trong những
ứng dụng quan trọng và có triển vọng lớn.
Hàng năm trên thế giới sản suất khoảng 6000 tấn vi tảo khô và đã cho doanh
thu 1,25 tỷ USD (Gross và Pulz, 2004). Các sản phẩm này được thương mại dưới
dạng nguyên liệu hoặc dạng thành phẩm như sản phẩm của hãng Green Sun (Mỹ).
Thành phần dinh dưỡng của các thương phẩm vi tảo do công ty Green Growth
(Mỹ) bào chế đã được ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính, đặc biệt ung thư
(www.greengrowthnutri.com). Trong số các loài vi tảo biển (VTB) đang được tập
trung nghiên cứu và khai thác hiện nay, sinh khối VTB Nannochloropsis oculata
giàu axit béo eicosapentaenoic (C20:5 ω-3) - một axit béo khơng bão hịa đa nối đôi thiết

yếu cho người và động vật nuôi, hiện được sử dụng rộng rãi làm thức ăn sống cho các

đối tượng nuôi trồng thủy sản ở các giai đoạn ấu trùng khác nhau, làm thực phẩm
chức năng, làm nhiên liệu sinh học…và đã đạt được nhiều thành tựu khả quan.
Tuy nhiên ở Việt Nam, mặc dù có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về VTB
N. oculata có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các kết quả
nghiên cứu nhìn chung chưa mang tính hệ thống và chủng giống chủ yếu là nhập
ngoại; chưa nuôi trồng trên qui mơ lớn. Việc làm sáng tỏ tính an tồn của sinh
khối tảo nuôi được; sử dụng sinh khối tảo giàu dịnh dưỡng làm viên thực phẩm
chức năng bổ sung cho sức khỏe của người; nghiên cứu về tác dụng sinh học dược học của sinh khối tảo ở Việt Nam là hồn tồn chưa có.
Vì vậy, nhằm nâng cao chất lượng và giá trị của sản phẩm thực phẩm chức
năng từ VTB nói chung và từ vi tảo N. oculata được phân lập từ vùng biển của Việt
Nam, tối ưu hóa điều kiện ni tảo này ở các hệ thống ni hở (HTNH) và hệ thống
ni kín (HTNK) tự thiết kế để đủ sinh khối để sản xuất viên nang thực phẩm chức
năng có tác dụng bảo vệ sức khỏe, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển Nannochloropsis oculata
(Droop) Hibberd sử dụng làm thực phẩm chức năng”
2. Mục tiêu của đề tài
1. Tuyển chọn, sàng lọc, định tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm sinh
học của các loài VTB thuộc chi Nannochloropsis;


2. Chọn được 1 chủng/lồi VTB thuộc chi Nannochloropsis có khả năng
nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng trong các HTNK 20, 50, 100 L và đủ tiêu chuẩn
làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Tuyển chọn, sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh
dưỡng của các chủng VTB N. oculata ở điều kiện nhân nuôi trong HTNH.
2. Nghiên cứu sinh trưởng của chủng N. oculata QN1 trong HTNK kín 20,
50 và 100 L và xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối chủng

tảo này.
3. Đánh giá tác động sinh học – dược lý, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sinh
khối tảo N. oculata QN1 và bào chế, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên thực phẩm
chức năng thành phẩm.
4. Những đóng góp mới của luận án
1. Sàng lọc thành công và dựa trên các đặc điểm hình thái và giải mã đoạn
gen 18S rRNA đã xác định được tên chủng N. oculata QN1;
2. Xây dựng thành cơng quy trình ni sinh khối chủng N. oculata QN1 ở
hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm chỉ dùng
máy nén khí và nâng bình chứa lên cao) có dung tích 50, 100 L đạt mật độ tế bào
245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 x 106 TB/mL sau 15 ngày ni cấy.
3. Đã nghiên cứu được độc tính cấp và bán trường diễn, dược lý của sinh
khối VTB N. oculata QN1 đạt tiêu chuẩn sản xuất thực phẩm chức năng. Đã xây
dựng được bộ tiêu chuấn cơ sở cho nguyên liệu tảo dạng lỏng, nguyên liệu tảo
dạng bột khô của chủng QN1, và tiêu chuẩn cơ sở của viên nang thực phẩm chức
năng có chứa sinh khối chủng QN1 được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp
phép.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
1. Kết quả nghiên cứu thu được trong Luận án này là cơ sở khoa học để
nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học của chủng N. oculata QN1 phân lập được từ
vùng biển Quảng Ninh và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đồn giống VTB có nguồn
gốc của Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép làm chủ quy trình nhân
ni chủng QN1 trong điều kiện phịng thí nghiệm, khả năng sử dụng hệ thống
ni kín tự thiết kế 20, 50 và 100 L để cung cấp sinh khối làm nguyên liệu sản
xuất viên thực phẩm chức năng đạt tiêu chuẩn cơ sở, có tác dụng dược lý - sinh


học tốt.
2. Các kết quả của Luận án có ý nghĩa thực tiễn đối với các cơ sở sản xuất
sinh khối tảo làm chủ được quy trình ni, thu sinh khối và bảo quản sinh khối tảo

đạt chất lượng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 147 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 27
trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết quả và thảo luận 90 trang,
kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục các cơng trình đã cơng bố 1 trang, tài liệu
tham khảo 12 trang với 130 tài liệu tham khảo. Trong luận án có 43 Bảng và 74 Hình.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thủy vực.
Chúng được coi là nguồn thực phẩm quan trọng cho con người và động vật, cung
cấp protein, lipit, các axit béo khơng bão hịa đa nối đôi (PUFAs - Polyunsaturated
fatty acids) như EPA (axit eicosapentaenoic, C20:5 ω-3), DHA (axit
docosahexaenoic, C22:6 ω − 3); là nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học,
cung cấp các chất có hoạt tính sinh học được dùng làm thuốc, mỹ phẩm và dược
phẩm, nguồn phân bón sinh học. Gần đây, sinh khối tảo được sử dụng làm nguyên
liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.
VTB N. oculata có kích thước nhỏ, dao động từ 2-4 μm, khơng có roi, màu
xanh, phân bố khá rộng ở nước ngọt, lợ và mặn (Hu và Gao, 2003). N. oculata rất
giàu các axit béo bão hịa và khơng bão hịa đa nối đơi, trong đó chủ yếu là EPA
với hàm lượng dao động trong khoảng 20-29,9 % so với axit béo tổng số, tùy theo
điều kiện nuôi cấy và pha sinh trưởng của tế bào (Pal và cs., 2011; Chen và cs.,
2013). EPA đã được chứng minh có vai trị quan trọng trong việc tăng cường sức
đề kháng và phòng tránh bệnh cho người và động vật. EPA giúp chống suy nhược
cơ thể (Babcock và cs., 2000), ngăn chặn tình trạng máu nhiễm mỡ, chống các
bệnh về tim mạch, xơ vữa động mạch, làm giảm viêm nhiễm (Nordoy, 1991; Gill
và Valivety, 1997). EPA là thành phần quan trọng trong nhiều loại thực phẩm và
thuốc hỗ trợ phát triển trí não ở trẻ em và chống bệnh suy giảm trí nhớ ở người
già. Theo Senzaki và cs., (1998); Bonaa và cs., (1992), EPA giúp kháng ung bướu
và được xem như là yếu tố hỗ trợ phịng ngừa và điều trị ung thư. Chính vì vậy,
nhu cầu sử dụng sinh khối VTB N. oculata sạch, đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sử
dụng trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng.

Hiện nay, nhu cầu sử dụng sinh khối tảo N. oculata sạch, đáp ứng tiêu chuẩn
làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng ngày càng cao. Vì
vậy, các giải pháp như ni tảo trong các hệ thống ni kín đã được triển khai,
nhằm mục đích nâng cao hiệu quả ni trồng và chất lượng sinh khối tảo. Trên thế
giới, nuôi tảo N. oculata trong các hệ thống ni kín đã được tiến hành khá phổ
biến (Briassoulis và cs., 2010; Feng và cs., 2011). Tuy nhiên, ở Việt Nam việc
nuôi tảo N. oculata trong các hệ thống ni kín cũng đã được triển khai nhưng với
mục đích chủ yếu là cung cấp giống nhân nuôi ban đầu cho hệ thống nuôi hở, làm
thức ăn sống cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (Đặng Tố Vân Cầm và cs.,


2013; Ngơ Thị Hồi Thu, 2015). Các nghiên cứu sử dụng hệ thống ni kín để
ni VTB cung cấp ngun liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng hầu như khơng
có và chưa có tính hệ thống.
Chính vì vậy, nhằm nâng cao chất lượng và giá trị của sản phẩm chức năng từ
VTB nói chung và từ vi tảo N. oculata để phục vụ cho sức khỏe cộng động thì
hướng nghiên cứu phân lập N. oculata từ vùng biển Việt Nam, tìm điều kiện nhân
ni tảo này trong các hệ thống ni hở và kín tự thiết kế để sản xuất viên nang
thực phẩm chức năng là rất cần thiết. Ngoài ra, sinh khối tảo cần phải được kiểm
tra theo các quy định về an toàn thực phẩm và kiểm nghiệm các chỉ tiêu quan
trọng ảnh hưởng đến sức khỏe con người; cần phải tiến hành nghiên cứu tác dụng
dược lý- sinh học của sinh khối tảo nêu trên đến sức khỏe con người thông qua
đánh giá tác động của sinh khối tảo lên hành vi của động vật thực nghiệm cũng
như đánh giá chất lượng của viên nang tảo thành phẩm dùng làm thực phẩm chức
năng.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Các chủng giống Nannochloropsis spp. QN1, NT1, NT2, NT3, NT4 và NT5
được phân lập ở Quảng Ninh, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa năm 2009 thuộc bộ sưu
tập VTB của Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH

và CN Việt Nam cung cấp. Các mẫu này được lưu giữ và ni cấy ổn định trong
điều kiện phịng thí nghiệm, lưu giữ trên môi trường lỏng, thạch và cung cấp giống
thuần để thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án;
Chuột nhắt trắng giống Swiss 18 – 20 g/con do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung
Ương cung cấp. Hai giống thỏ trắng (đực và cái) cân nặng từ 2,0 đến 2,5 kg/con
do Bộ phận chăn nuôi G1 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp để
nghiên cứu, đánh giá độc tính của sinh khối tảo trên mơ hình động vật thực
nghiệm.
Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh 10 – 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 –
30 g/con, do Ban chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp để tiến hành thử
nghiệm đánh giá tính an tồn dược lý của sinh khối vi tảo.
Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 18S rRNA với kích thước khoảng 1100 bp
do Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện CNSH thiết kế được sử dụng với Primer F: 5’TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’ (24nu) và Primer R: 5’GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu).
2.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là thơng dụng trong phịng thí nghiệm,
đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu do Việt Nam, Trung Quốc và Mỹ cung
cấp.


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học (Light
Microcope) và kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope –SEM); cố
định mẫu bằng glutaradehyde trước khi chụp ảnh dưới kính JEOL, JSM-6400 (Nhật
Bản).
2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử: đọc và so sánh trình tự nucleotide
đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. QN1 tiềm năng được tiến
hành theo Sambrook và Rusell, (2001). Các chương trình phần mềm chuyên dụng
như DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 và BLAST được sử dụng
cho phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng
Nannochloropsis sp. QN1 trong nghiên cứu.

2.3.3. Khảo sát điều kiện nhân nuôi N. oculata QN1 ở quy mơ phịng thí
nghiệm: nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng (với ba môi trường
Walne, F/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 5 – 60 ‰), nhiệt độ (15 – 40 C),
ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11), mật độ tế bào (MĐTB) ban đầu (7, 11,
13 và 15 triệu TB/mL), tỉ lệ CO2 (với nồng độ 1, 2, 5, 10 và 15 % v/v) lên sinh
trưởng và phát triển của chủng QN1.
2.3.4. Khảo sát điều kiện nhân nuôi chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100
L: nghiên cứu ảnh hưởng của 3 môi trường dinh dưỡng (F/2, Erd và Walne), nồng
độ muối (từ 20- 40 ‰), nhiệt độ (25-28 0C và 35 0C), ánh sáng trắng với CĐAS là
100 mol/m2s, pH (từ 5 đến 9), tỉ lệ CO2 (2 và 5 % v/v) với MĐTB ban đầu (1025 triệu TB/mL) lên sinh trưởng của chủng QN1 trong HTNK nói trên.
2.3.5. Xác định sinh trưởng của chủng QN1: bằng đo mật độ quang ở bước
sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức),
xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard và Sieracki, 2005) sinh khối khô
(sấy ở 105 C), hàm lượng chlorophyll a và carotenoit, xác định kích thước tế bào
bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5.
2.3.6. Phân tích thành phần và hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit
tổng số và các axít béo trong sinh khối chủng QN1
- Xác định hàm lượng lipit trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh
và Dyer, (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
- Thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối của QN1: được xác
định bằng máy sắc kí khí HP-6890 theo mơ tả của Đặng Diễm Hồng và cs.,
(2007).
- Phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của chủng QN1: được
tiến hành theo Horwitz, (2000).


2.3.7. Nghiên cứu quy trình thu hoạch sinh khối chủng QN1: sử dụng kỹ
thuật làm lắng (sử dụng các chất trợ lắng như Al2 (SO4)3.18H2O; phèn nhôm kali
sulfate dạng muối kép: KAl (SO4)2.12H2O và FeCl3; kỹ thuật ly tâm và sinh khối
tảo sau khi thu hoạch sẽ được kiểm tra đánh giá đánh giá hàm lượng lipit và EPA,

protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit và kim loại nặng.
2.3.8. Nghiên cứu quy trình chế biến bảo quản sinh khối chủng QN1: sinh
khối tảo sau khi thu hoạch bằng chất tạo kết bông sẽ được sấy khô theo các
phương pháp khác nhau (sấy phun, sấy đông khô, sấy bằng tủ sấy nhiệt, phơi khô).
Đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp sấy qua độ ẩm và sự biến đổi của các
thành phần dinh dưỡng của tảo trong quá trình chế biến và bảo quản.
Sinh khối tảo khơ có mức hàm ẩm khác nhau được bảo quản trong các túi
nilon dán kín ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Đánh giá độ ổn định của vi tảo
trong q trình bảo quản thơng qua theo dõi sự biến đổi của các thành phần dinh
dưỡng trong tảo như lipit, protein, cacbohydrat, hàm lượng EPA…
2.3.9. Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sinh khối vi
tảo N. oculata QN1: tiến hành thử độc tính của sinh khối tảo khơ N. oculata QN1
theo Quy chế đánh giá tính an tồn và hiệu lực thuốc cổ truyền của Bộ Y tế (Bộ Y
tế, 1996). Các thử nghiệm được tiến hành gồm thử độc tính cấp trên chuột nhắt
trắng và độc tính bán trường diễn trên thỏ theo các hướng dẫn hiện hành (Đỗ
Trung Đàm, 1996; WHO, 2000; OECD, 2001; OEDC, 2008).
2.3.10. Nghiên cứu tác động dược lý của sinh khối tảo N. oculata QN1 lên
động vật thực nghiệm: thông qua các bài tập môi trường mở; bài tập mê lộ chữ Y;
bài tập nhận thức đồ vật.
2.3.11. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sinh khối tảo QN1 làm
nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng:
+ Với các chỉ tiêu đã có phương pháp kiểm tra được quy định trong các tiêu
chuẩn ngành, dược điển các nước: áp dụng kiểm tra mẫu thử.
+ Với các chỉ tiêu chưa có sẵn phương pháp: dựa trên các tính chất của hoạt
chất cần kiểm tra và các phương tiện phân tích sẵn có để đề xuất phương pháp
kiểm tra. Phương pháp đề xuất được hiệu lực hóa bằng các phép thử độ đặc hiệu
(định tính) hoặc độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (định
lượng).
2.3.12. Nghiên cứu cơng thức bào chế, xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm và
sản xuất thử nghiệm viên nang chứa thành phẩm vi tảo N. oculata QN1:

+ Dựa trên công dụng, tác dụng của các dược liệu để đưa ra công thức viên
và dạng bào chế.


+ Dựa trên tính chất hóa lý của các thành phần hoạt chất và tá dược để lựa
chọn phương pháp bào chế và công thức bào chế phù hợp. Đánh giá sự phù hợp
của các lựa chọn thông qua khả năng tạo hạt, làm viên và độ ổn định của chế phẩm
trong quá trình bào chế.
+ Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và hiệu lực hóa phương pháp kiểm tra
chất lượng như đã mô tả trong mục “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở”, áp
dụng với thành phẩm là viên nang vi tảo.
2.3.12. Xử lý số liệu
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel. So sánh thống kê
được thực hiện qua phân tích one-way ANOVA với giá trị P<0,01 và so sánh các
giá trị trung bình với hàm t-test được dùng với độ tin cậy p<0,05.
Xử lý số liệu độc tính cấp của sinh khối tảo trên động vật thực nghiệm theo
phương pháp thống kê sinh y học, dùng phép kiểm định t-student và test “trước sau”(Avant - Après) để so sánh các chỉ số. Số liệu được biểu diễn dưới dạng: Giá
trị trung bình ± Es (sai số chuẩn) với độ tin cậy P 95 %.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn, sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh
dƣỡng của các chủng VTB N. oculata ở điều kiện nhân nuôi trong HTNH
3.1.1. Đặc điểm của các chủng vi tảo biển Nannochloropsis spp. nghiên cứu
Các chủng Nannochoropsis spp. phân lập ở vùng biển Quảng Ninh, Nha
Trang, tỉnh Khánh Hịa năm 2009 có tế bào ở dạng đơn bào, hình cầu, màu xanh,
khơng có roi và có kích thước 1,5 -3,6 ±0,5µm (Hình 3.1 và 3.2).

Hình 3.1. Hình thái tế bào của 6 chủng Nannochloropsis spp. phân lập ở vùng
biển Nha Trang và Quảng Ninh dƣới kính hiển vi quang học
Dựa trên các đặc điểm hình thái (quan sát dưới kính hiển vi quang học và
kính hiển vi điện tử quét), chúng tôi đã định tên sơ bộ được 6 chủng

Nannochloropsis spp. ở các vùng biển Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hịa
thuộc về lồi Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981.

Hình 3.2. Hình thái tế bào của 6 mẫu Nannochloropsis spp. dƣới kính hiển vi
điện tử quét (SEM)
3.1.2. Lựa chọn chủng VTB Nannochloropsis spp. phù hợp cho sản xuất thực
phẩm chức năng
Chủng Nannochloropsis spp. tiềm năng được sử dụng làm nguyên liệu để
sản xuất thực phẩm chức năng cần phải có một số đặc điểm như khả năng sinh
trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng, đặc biệt là hàm lượng EPA cao và có khả năng
ni trồng trên quy mơ lớn. Trong số 6 chủng VTB được sử dụng nghiên cứu, dựa
trên khả năng sinh trưởng của các chủng đã phân lập được trong môi trường lỏng
(đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc
trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit và hydratcacbon), chúng
tôi đã chọn được Nannochloropsis sp. QN1 phân lập từ vùng biển Quảng Ninh
làm đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Định tên khoa học chủng Nannochloropsis sp. QN1 bằng kỹ thuật đọc
và so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA
Kết quả tách dòng và đọc trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng
Nannochloropsis sp. QN1 được trình bày ở Hình 3.3.

Hình 3.3. Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. QN1


A: DNA tổng số của chủng QN1 (giếng 1); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA của chủng
QN1 (giếng 2); C: Sản phẩm PCR tinh sạch của chủng QN1 (giếng 3); D: PCR checking chủng
QN1 (giếng 4, 5 và 6) Giếng M: Thang DNA chuẩn 1 kb Plus Ladder.

Kết quả cho thấy độ tương đồng của các loài thuộc chi Nannochloropsis dao
động từ 83,0 % đến 99,9 %. Chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân lập ở Quảng
Ninh có độ tương đồng cao nhất với loài N. oculata (AF045045) đạt 99,9 %, tiếp
theo là N. granulate MBIC10054 (AB052272), N. limnetica (AF251496) và N.
oceanica MBIC10440 (AB052277) đạt 99,5 % và thấp nhất là loài N. gaditana
(AF133819) đạt 98,3 %. Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh
chủng loại (Hình 3.4), chúng tơi có thể kết luận chủng Nannochloropsis sp. QN1
phân lập được từ vùng biển Quảng Ninh thuộc về lồi N. oculata vì chúng có độ
tương đồng đạt 99,9 % với loài N. oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số
(AF045045). Trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 đã được đăng ký trên
GenBank với mã số được cấp là KU 342 038.

Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân
lập từ vùng biển Quảng Ninh
3.1.4. Sinh trƣởng của chủng N. oculata QN1 trong điều kiện phịng thí
nghiệm
Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng N. oculata QN1 là
môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30 ‰, nhiệt độ 25-30C, CĐAS 100
μmol/m2/s, pH 7, sục khí CO2 có nồng độ 2% (v/v) với tốc độ 0,25 L/phút, mật độ
tế bào ban đầu để nhân nuôi đạt 11 triệu TB/mL.
3.2. Nghiên cứu sinh trƣởng của chủng N. oculata QN1 trong HTNK kín 20,
50 và 100 L và xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối
chủng tảo này
Điều kiện sinh trưởng thích hợp của chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100
L là: môi trường dinh dưỡng Walne; nồng độ muối 30 ‰; nhiệt độ 25-28 ºC; ánh
sáng trắng với cường độ 100 µmol/m2/s; pH 7; sục khơng khí có bổ sung CO2 ở


nồng độ 2 % (v/v) với tốc độ sục khí 0,25 L/phút; mật độ tế bào ban đầu tối ưu
cho nhân ni trong hệ thống ni kín là 15-20 triệu TB/mL.

So sánh với HTNH, sau 25 ngày ni cấy thì MĐTB của tảo N. oculata
QN1 ở HTNK 20 L đạt 201,1 x triệu TB/mL, tăng 21,2 % so với HTNH 197,00 x
triệu TB/mL. Còn ở các HTNK 50 và 100 L, MĐTB đạt giá trị trung bình cao nhất
là 245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 triệu TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy, tương ứng.
Sinh khối tảo trong HTNK huyền phù, không bị tạp nhiễm, thời gian vận hành
được kéo dài giúp làm giảm chi phí ni cấy, năng suất sinh khối ln ổn định, tiết
kiệm diện tích cũng như cơng sức ni cấy.
Đã đưa ra được sơ đồ quy trình ni trồng loài N. oculata QN1 làm nguyên
liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.
3.2.3. Nghiên cứu quy trình thu hoạch chế biến và bảo quản sinh khối tảo N.
oculata QN1
3.2.3.1. Quy trình thu hoạch
Điều kiện thu hoạch sinh khối tảo từ các hệ thống nuôi khác nhau: chế độ ly
tâm 6000 v/p trong 10 phút với hiệu quả lắng đạt 95 % và 3000 v/p trong 10 phút
với hiệu quả lắng đạt 100 % với dịch nuôi tảo không được và được xử lý chất kết
bông (KAl (SO4)2.12H2O 0,4 g/L). Hàm lượng, thành phần lipit và axit béo trong
sinh khối tảo thu hoạch được từ hai phương pháp ly tâm là tương đương nhau,
trong đó hàm lượng lipit tổng số đạt 16,21±1,88 đến 16,72±0,88 % sinh khối khô,
hàm lượng EPA đạt 24,73±2,17 đến 26,03±2,12 % so với tổng số axit béo.
Đã xây dựng được quy trình thu hoạch sinh khối tảo N. oculata QN1, cung
cấp nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng (Hình 3.5).
Tính ổn định của vi tảo N. oculata QN1 trong quá trình thu hoạch đã được
xác định. Hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit
trong sinh khối tảo thu hoạch được bằng phương pháp ly tâm và sử dụng chất kết
bơng (có rửa sinh khối bằng 2 lần HCl 0,1N và 3 lần bằng nước cất) đạt lần lượt là
15,62±1,23 % và 15,15±1,36 % SKK; 2,3±0,1 và 2,28±0,1 % SKK; 18,21±1,21 và
18,12±1,32 % SKK; 34,7±2,13 và 30,2±2,45% SKK; 1,65±0,05 và 1,61±0,04%
SKK; 0,29±0,04 và 0,27±0,03 % SKK. Sinh khối tảo N. oculata QN1 cũng rất
giàu các khoáng đa và vi lượng, hàm lượng các kim loại nặng như Cd, Pd, As và
Hg đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thực phẩm theo tiêu chuẩn

Việt Nam, (2002). Ngoài ra, các quan sát cảm quan cũng cho thấy màu sắc của
sinh khối tảo thu hoạch được theo hai phương pháp ly tâm trực tiếp dịch nuôi tảo
hoặc kết bông và ly tâm sau khi rửa 2 lần bằng HCl 0,1 N và 3 lần rửa bằng nước
cất đều có màu xanh đặc trưng và khơng có sự khác biệt.


- MĐTB 80-100 x triệu TB/mL ở bình
tam giác
- 160-245 x triệu TB/mL ở HTNK
- 40-60 x triệu TB/mL ở HTNH

Dịch nuôi cấy
N. oculata QN1

(1)
KAl (SO4)2.12H2O
0,04%

Cô đặc các tế bào tảo bằng chất kết bơng
hoặc lọc qua lưới lọc (kích thước lỗ >10
µm và < 5 µm)
Nước, KAl (SO4)2.12H2O

(2)
Dịch tảo cơ đặc (5-10% thể tích dịch
ban đầu), sục ozon (2-3 phút)

(3)
Ly tâm 3000 v/p, 10 phút hoặc ly
tâm vắt 1500 v/p, 20 phút

Ly tâm loại nước và rửa lại
bằng HCl 0,1N và nước cất
3-5 lần (tỷ lệ 1:5, w/v)

(4)

Nước, KAl (SO4)2.12H2O

Sấy khơ

Tảo khơ

3.2.3.2. Nghiên cứu quy trình chế biến và bảo quản vi tảo N. oculata QN1
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thu hoạch vi tảo biển N. oculata QN1
Sinh khối tảo N. oculata QN1 có thể sấy bằng sấy phun là phương pháp có
thể thu sinh khối chủng QN1 có chất lượng tốt, chi phí phù hợp và có thể áp dụng
cho việc sản xuất sinh khối tảo ở quy mơ bán cơng nghiệp và cơng nghiệp. Ngồi
ra, có thể sử dụng sấy phun với điều kiện thích hợp là hàm lượng chất khô trong
dịch tảo trước sấy khoảng 20 %, nhiệt độ khơng khí đầu vào là 200 °C, áp lực khí
nén là 4,00 bar và tốc độ bơm nhập liệu là 20 mL/phút với hiệu suất thu hồi đạt
trên 65 %, độ ẩm sản phẩm dao động khoảng 3,5 %.
Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối tảo N. oculata QN1 thu hoạch
được ở các điều kiện khác nhau bao gồm nhiệt độ phòng, 4 – 10 °C và -20 °C
trong thời gian từ 1 tuần đến 1 năm đã được tiến hành. Kết quả về điều kiện bảo
quản được đánh giá thông qua sự thay đổi về hàm lượng lipit, protein,
cacbohydrate, chlorophyll a trong sinh khối tảo tươi của chủng QN1.
Điều kiện bảo quản sinh khối tảo tươi N. oculata QN1 phù hợp nhất ở -20
°C với thời gian bảo quản lên tới 1 năm. Sự thay đổi về thành phần và hàm lượng
axit béo của N. oculata QN1 sau thời gian bảo quản 1 năm được trình bày ở Bảng

Bảng 3.1: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo của N. oculata QN1
sau thời gian bảo quản 1 năm ở -200C
Thành phần
axit béo (%
so với tổng
số axit béo)

Tên

SK
tƣơi
trƣớc
bảo
quản

SK có
độ ẩm
100%

SK có
độ ẩm
6080%

SK có
độ ẩm
2040%

SK có

độ ẩm
0-5%

C14:0

Tetradecanoic acid

0,62

0,58

0,53

0,60

0,61

C16:0

Hexadecanoic acid

20,15

20,10

20,19

20,12

20,16

C16:1n-7

9- Hexadecanoic acid

3,52

3,30

3,57

3,24

3,46

C18:1n-9

9- Octadecenoic acid

8,46

8,00

6,71

7,21

7,12

C18:2n-6

9,12- Octadecenoic
acid

9,18

8,30

9,03

9,25

9,13

17,82

17,70

17,01

16,35

17,21

C18:3n-3

9,12,15Octadecatrienoic
acid

C20:0

Eicosanoic acid

5,26

5,90

5,98

5,68

6,08

C20:4n-6

5, 8, 11, 4Eicosatetraenoic acid

0,83

0,60

0,74

0,85

0,79

C20:5n-3
(EPA)

5, 8, 11, 14, 17Eicosapentaenoic
acid

26,03

24,70

25,20

23,21

24,22

Loại khác
8,13
10,82
11,04
13,49 11,22
Hàm lượng, thành phần các axit béo trong sinh khối tảo N. oculata QN1 với
độ ẩm khác nhau sau thời gian bảo quản 1 năm ở -20 0C là không thay đổi nhiều
so với thời điểm ban đầu. Các axit béo chính chứa trong sinh khối tảo bao gồm
EPA, axit  -linolenic, axit palmitic, axit oleic, axit linoleic. Trong đó, hàm lượng
EPA trong sinh khối tảo có độ ẩm khác nhau dao động từ 23,21 – 26,03 % SKK
sau 1 năm bảo quản ở -20 0C.
Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong q trình chế biến
Tính ổn định của sinh khối tảo N. oculata QN1 sau q trình sấy khơ theo
các phương pháp khác nhau (phơi nắng, sấy khô bằng tủ sấy nhiệt, sấy phun và
sấy đông khô) đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy hàm lượng, thành phần các
axit béo trong sinh khối tảo N. oculata QN1 khi được sấy đông khô là không thay
đổi nhiều so với thời điểm ban đầu. Hàm lượng EPA giữ ổn định ở mức 35,03 –

35,08 % so với tổng số axit béo (TFA). Hàm lượng EPA trong sinh khối tảo được
sấy khô trong lò sấy và sấy phun giảm xuống còn 26,98 % và 28,68 % so với TFA,


tương ứng. Trong khi đó, q trình sấy khơ sinh khối tảo bằng cách phơi nắng làm
giảm đáng kể hàm lượng EPA (giảm từ 35,03 xuống 19,9 % so với TFA) (Bảng
3.2).
Bảng 3.2: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo trong sinh khối
N. oculata QN1 sau quá trình sấy khô khác nhau
Thành
phần axit
Sấy
Sấy
Trƣớc
Phơi
Sấy
béo (% so
Tên khoa học
trong tủ
đông
sấy
nắng
phun
với tổng số
sấy
khô
axit béo)
C12:0

Dodecanoic acid

0,61

6,58

0,96

2,60

0,61

C14:0

Tetradecanoic acid

5,31

15,10

8,19

10,12

5,16

C16:0

Hexadecanoic acid

13,56

13,98

13,17

14,24 13,46

C16:1(n-7)

9- Hexadecanoic acid

20,16

23,00

16,71

18,21 18,12

C18:1(n-9)

9- Octadecenoic acid

4,54

2,30

3,03

3,25

4,13

C18:2(n-6)

9.12- Octadecenoic
acid

4,16

2,70

3,01

3,35

4,21

C20:5(n-3)

5.8.11.14.17Eicosapentaenoic acid

35,03

19,90

26,98

28,68 35,08

Loại khác

16,63

16,44

27,95

19,55 19,23

Hàm lượng protein, carbonhydrate, chlorophyll a, carotenoit trong sinh khối
tảo thu được bằng phương pháp sấy đơng khơ hầu như khơng có sự thay đổi về
chất lượng. Tuy nhiên, phương pháp sấy nhiệt và sấy phun cũng cho sinh khối tảo
có chất lượng tốt với chi phí hợp lý và có thể áp dụng để sấy một lượng lớn sinh
khối tảo.
Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong q trình bảo quản
Nghiên cứu xác định tính ổn định của sinh khối vi tảo thu được (bằng cách
sấy nhiệt, sấy phun và sấy đông khô) sau thời gian bảo quản ở -20°C từ 0 ngày đến
1 năm đã được tiến hành. Hàm lượng lipit, EPA, protein, carbonhydrate, và
chlorophyll a trong sinh khối tảo được bảo quản ở -20°C thì chất lượng sinh khối
tảo khô vẫn được đảm bảo sau thời gian 1 năm. Ngoài ra, ở tất cả các điều kiện
bảo quản, mức độ giảm hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate và


chlorophyll a trong sinh khối tảo được sấy đông khô cũng thấp hơn so với sinh
khối tảo được sấy nhiệt và sấy phun.
3.3. Đánh giá tác động sinh học của sinh khối tảo N. oculata QN1 sử
dụng làm thực phẩm chức năng
3.3.1. Đánh giá tác động sinh học của sinh khối tảo N. oculata QN1 sử
dụng làm thực phẩm chức năng

3.3.1.1. Đánh giá độc tính cấp
*Ảnh hưởng của mẫu thử đến trạng thái, hoạt động của chuột thử
nghiệm
Các nhóm chuột thử nghiệm được cho uống mẫu thử dựa theo liều đã tính
(0; 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT chuột). Sau khi uống, chuột được phân chia vào
lồng, nuôi theo nhóm. Kết quả quan sát trạng thái và các biểu hiện bất thường của
chuột được tóm tắt trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả theo dõi các biểu hiện bất thƣờng sau khi uống của chuột
Các biểu hiện ngộ
Liều
Tình trạng tiêu thụ
độc (hoảng loạn, thở
Số chuột
Nhóm (g/kg KLCT
thức ăn, nƣớc
gấp, mệt mỏi, tím
chết
uống, bài tiết
chuột)
tái… chết)
1
2
3
4
5

0
Khơng có
15,0
Khơng có

20,0
Khơng có
25,0
Khơng có
30,0
Khơng có
Ghi chú: KLCT – khối lượng cơ thể

Khơng có
Khơng có
Khơng có
Khơng có
Khơng có

Bình thường
Bình thường
Bình thường
Bình thường
Bình thường

Kết quả nghiên cứu thu được trên Bảng 3.3 đã cho thấy chuột ở nhóm chứng
và bốn nhóm thử đều khơng có bất kỳ biểu hiện bất thường nào. Tất cả các chuột
đều khỏe mạnh, hoạt động bình thường. Khơng có chuột bị chết trong thời gian
theo dõi 7 ngày.
Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp đã cho thấy chuột uống sinh khối vi tảo
N. oculata QN1 ở các liều nghiên cứu là 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT khơng có
con nào bị chết, chuột vẫn di chuyển và ăn uống bình thường. Như vậy, sinh khối
vi tảo N. oculata QN1 không gây độc tính cấp do khơng xác định được giá trị
LD50. Hay nói cách khác, sinh khối vi tảo an tồn và khơng gây chết động vật thí
nghiệm trong thử nghiệm gây độc cấp tính.

Theo phân loại độc tính của Hệ thống phân loại hóa chất và hợp chất tồn


cầu GHS (Globally Harmonised System for Classification of Chemical substances
and Mixtures) dựa trên giá trị LD50, những chất có giá trị độc tính cấp LD50 trong
khoảng > 5000 mg/kg KLCT, được coi là chất không độc. Như vậy, sản phẩm N.
oculata là chế phẩm không độc (non-toxic).
*Ảnh hưởng của mẫu thử đến khối lượng cơ thể chuột
Ngoài các biểu hiện của chuột, chúng tôi cũng theo dõi sự thay đổi về
KLCT chuột thí nghiệm. Sau 7 ngày thử nghiệm, khối lượng trung bình của cơ thể
chuột lần lượt là (25,5 ± 1,0), (25,8 ± 0,9), (26,1 ± 0,8), (25,3 ± 0,8) và (26,0 ±
0,9) g tương ứng với các nồng độ thử nghiệm bột tảo khô là 0; 15; 20; 25 và 30
g/kg KLCT. Kết quả thu được này cho thấy bột tảo khô không ảnh hưởng đến
KLCT của chuột (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của sinh khối VTB N. oculata QN1 lên KLCT của chuột
thử nghiệm
Kết quả cân nặng (gam)
Liều
(g/kg
chuột)

Trƣớc thí
nghiệm (gam)

Sau thí
nghiệm
(gam)

Tỷ lệ
tăng (%)

1

Đối
chứng

19,4 ± 0,4

25,5 ± 1,0

31,4

2

15,0

19,5 ± 0,5

25,8 ± 0,9

32,3

3

20,0

19,6 ± 0,4

26,1 ± 0,8

33,2

4

25,0

19,5 ± 0,6

25,3 ± 0,8

29,7

5

30,0

19,7 ± 0,5

26.0 ± 0,9

32,0

Nhóm

Giá trị P
Ptrước-sau <<
0,05*
Ptrước-sau << 0,05
Ptrước (C-T)= 0,46
Psau (C-T)= 0,46

Ptrước-sau << 0,05
Ptrước (C-T)= 0,31
Psau (C-T)= 0,22
Ptrước-sau << 0,05
Ptrước (C-T)= 0,67
Psau (C-T)= 0,58
Ptrước-sau << 0,05
Ptrước (C-T)= 0,25
Psau (C-T)= 0,34

Ghi chú:
- Dấu ký hiệu << 0,05 biểu thị giá trị tính được của P nhỏ hơn rất nhiều so với 0,05.
- Ptrước-sau: Khi so sánh KLCT của chuột tại thời điểm trước và sau uống 7 ngày trong mỗi nhóm.
- Ptrước (C-T): Khi so sánh KLCT của chuột giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm trước uống.
- Psau (C-T): Khi so sánh KLCT của chuột giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm sau uống 7


ngày.

Ngồi ra, chúng tơi cũng cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sinh
khối tảo đến KLCT của chuột thử nghiệm theo giống (đực/cái) dựa trên tỷ lệ tăng
KLCT trung bình của chuột sau thử nghiệm so với trước khi cho chúng uống mẫu
thử giữa 2 giống chuột tại từng liều nghiên cứu (Bảng 3.5).
Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ tăng KLCT của 2 phân nhóm chuột
đực và cái trong từng nhóm thử và nhóm đối chứng khác biệt khơng có ý nghĩa
thống kê sinh học (P>0,05). Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy sinh khối vi
tảo N. oculata QN1 không ảnh hưởng đặc biệt lên mức tăng KLCT của giống
chuột (đực/cái).
Ngoài ra, mức độ tăng KLCT của 2 phân nhóm chuột đực và cái trong từng
nhóm thử và nhóm đối chứng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê sinh học

(P>0,05). Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy sinh khối vi tảo N. oculata
QN1 không ảnh hưởng đặc biệt lên mức tăng KLCT của giống chuột (đực/cái).
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của sinh khối N. oculata QN1 đến mức tăng KLCT của
chuột thử nghiệm theo giống (đực/cái)
Liều (gam/kg KLCT

Tỷ lệ tăng (%)

Pnhóm

Nhóm

chuột)

Chuột đực

Chuột cái

1

0,0

32,0±0,8

29,7±1,0

0,41 (>0,05)

2

15,0

31,8±0,7

32,5±0,8

0,47 (>0,05)

3

20,0

30,7±0,8

33,1±0,7

0,45 (>0,05)

4

25,0

29,6±0,7

28,9±0,8

0,27 (>0,05)

5

30,0

31,3±1.1

32,4±1,1

0,66 (>0,05)

31,1±0,9

31,3±1,7

TB
Ptổng

0,81 (> 0,05)

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.4 và 3.5 đã cho thấy chuột nhắt
trắng được uống với mức liều từ 15,0 – 30,0 g sinh khối vi tảo N. oculata QN1/kg
khối lượng cơ thể của chuột đã không ảnh hưởng đến thể trạng, hoạt động của
chuột. Chuột thử nghiệm khỏe mạnh, tăng cân. Như vậy, trong đều kiện thí
nghiệm của chúng tôi đã không phát hiện thấy giá trị LD50 và sinh khối vi tảo N.
oculata được cho chuột uống đến liều 30 g/kg KLCT chuột là hồn tồn an tồn,
khơng gây chết động vật thí nghiệm trong thử nghiệm gây độc cấp tính. Theo phân


loại độc tính của Hệ thống phân loại hóa chất và hợp chất toàn cầu GHS (Globally
Harmonised System for Classification of Chemical substances and Mixtures),
những chất có LD50 >5g/kg khối lượng cơ thể được coi là chất không độc. Điều
này cho thấy bột tảo khô N. oculata QN1 với liều uống đến 30g/kg khối lượng cơ

thể chuột là sản phẩm khơng độc.
3.3.1.2. Kết quả đánh giá độc tính bán trƣờng diễn
*Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến tình trạng chung và khối
lượng cơ thể của thỏ
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy sinh khối chủng
QN1 ở cả 2 mức liều nghiên cứu 1,2 và 3,0 g/kg KLCT của thỏ/ngày không gây
ảnh hưởng tới thể trạng của thỏ thí nghiệm sau khi uống liên tục trong 28 ngày.
Bảng 3.6. Kết quả theo dõi khối lƣợng cơ thể của thỏ trƣớc và sau khi uống
sinh khối N. oculata QN1
Kết quả cân nặng (kg)
Nhóm (n=7)

P

Trƣớc
Sau 1
Sau 2
Sau 3
Sau 4
TN (m0) tuần (m1) tuần (m2) tuần(m3) tuần (m4)

Đối chứng (C) 2,09±0,11 2,13±0,16 2,16±0,16 2,16±0,14 2,24±0,15
% so với trước
thử nghiệm
Thử nghiệm 1 –

Ptrước-sau=0,044

1,91%

3,34%

3,34%

7,18%

2,10±0,13 2,16±0,14 2,19±0,15 2,23±0,14 2,27±0,15 Ptrước-sau=0,026

1,2 g/kg thỏ (T1)
% so với trước
thử nghiệm
Thử nghiệm 2 –

Ptrước (T1-C)=0,408

2,86%

4,29%

6,19%

8,09%

2,12±0,12 2,13±0,10 2,18±0,13 2,20±0,13 2,28±0,13 Ptrước-sau=0,045

3,0 g/kg thỏ (T2)
% so với trước
thử nghiệm

Psau (T1-C)=0,606

Ptrước (T2-C)=0,644

0,47%

2,83%

3,77%

7,55%

Psau (T2-C)=0,501

Ghi chú:
Ptrước-sau: So sánh KLCT của thỏ tại thời điểm trước và sau uống 28 ngày trong mỗi nhóm.
Ptrước (C-T): Khi so sánh KLCT của thỏ giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm trước uống.
Psau (C-T): Khi so sánh KLCT của thỏ giữa nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm tại thời điểm sau
uống 28 ngày.

*Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng tạo máu của
thỏ


Kết quả phân tích các chỉ số huyết học của thỏ thử nghiệm tại 3 thời điểm
sau khi được uống sinh khối vi tảo N. oculata QN1 ở nhóm đối chứng và nhóm
thử T1 và T2 được trình bày ở Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy
khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học ở các thông số về huyết học
trước (t0) và sau 14 (t1) và 28 (t2) ngày thử nghiệm ở cả 2 nhóm uống chế phẩm T1
và T2. Nếu so sánh ở cùng thời điểm xét nghiệm (t1 và t2) giữa nhóm đối chứng và
2 nhóm thử nghiệm, kết quả thu được cho thấy khơng có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê sinh học của các chỉ số huyết học của thỏ (PC-T1, PC-T2 thời điểm t1, t2 >
0,05).
Bảng 3.7. Kết quả phân tích các chỉ số huyết học của thỏ thử nghiệm tại 3
thời điểm t0, t1, và t2
Chỉ tiêu

n

Hồng cầu
(x 1012/ Lit)

7

Bạch cầu
(x 109/ Lit)

Thời
điểm

Nhóm đối
chứng

Nhóm thử
T1

t0

6,1 ± 0,3

6,0 ± 0,6

5,9± 0,4

t1

5,9 ± 0,6

6,2 ± 0,3

6,0± 0,8

t2

5,8 ± 0,5

5,9± 0,7

6,1 ± 0,7

Ptrước-sau

>0,05

> 0,05

> 0,05

t0

9,1 ± 1,3

8,6 ± 1,4

9,0 ± 0,9

t1

8.7 ± 1,4

9,0 ± 1,5

9,4 ± 1,1

t2

9,2 ± 1,4

9,1 ± 2,3

9,5 ± 1,1

Ptrước-sau

>0,05

> 0,05

> 0,05

PCT1

Nhóm thử
T2

7

t0

391,7 ± 76,9 439,4 ± 88,7

444,9 ± 73,9

>0,05

>0,05

Tiểu cầu
(x 109/ Lit)

t1

430,1± 68,6

427,0 ± 54,3

468 ± 78,1

t2

426,1± 55,2

432,4± 63,2

453,5 ± 77,5

Ptrước-sau

>0,05

> 0,05

> 0,05

t0

36,3 ± 2,5

37,7 ± 1,5

37,3 ± 2,1

t1

34,9± 2,4

35,3 ± 3,5

35,6 ± 3,7

t2

35,1± 2,8

36,5 ± 2,7

34,6± 3,1

Ptrước-sau

>0,05

> 0,05

> 0,05

t0

11,3 ± 0,9

10,6 ± 1,4

11,2 ± 0,4

t1

10,9 ± 0,8

11,0 ± 0,3

10,3± 0,8

7

Hematocrit
7

(%)

Hemoglobi
n

PC-T2

7


(g/dL)

t2

10,4 ± 0,8

10,0 ± 1,1

10,7 ± 0,6

Ptrước-sau

>0,05

> 0,05

> 0,05

Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo;
t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại
cùng thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2
g/kg KLCT; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg KLCT

Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra trên Bảng 3.7 đã cho thấy ngay ở mức
liều cao 3,0 g sinh khối vi tảo N. oculata QN1/kg khối lượng cơ thể của thỏ cũng
không gây ảnh hưởng đến chức năng tạo máu của thỏ.
*Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng gan thỏ thí
nghiệm
Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 lên chức năng gan thỏ được
trình bày ở Bảng 3.8. Kết quả trước thí nghiệm thu được cho thấy, các chỉ số sinh
hóa của thỏ ở nhóm thử (T1 và T2) và nhóm đối chứng khơng có sự khác biệt
nhau có ý nghĩa thống kê sinh học (PC-T1, PC-T2, thời điểm t0 > 0,05). Sau 14 và 28
ngày thí nghiệm cũng khơng nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học
giữa nhóm đối chứng và 2 nhóm thử T1 và T2 về các chỉ số sinh hóa này (PC-T1,
PC-T2 , thời điểm t1, t2 > 0,05). Ngồi ra, chúng tơi cũng khơng thấy có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê sinh học khi so sánh các thơng số này trong mỗi nhóm thử ở
thời điểm xét nghiệm so với trước khi uống (P > 0,05).
Bảng 3.8. Kết quả phân tích một số chỉ số sinh hóa liên quan đến chức năng
gan của thỏ tại 3 thời điểm t0, t1, và t2
Chỉ tiêu

SGOT

n

7

(U/ Lit)

SGPT

7

(IU/ Lit)

Bilirubin
toàn phần

7

Thời
điểm

Nhóm đối
chứng

Nhóm
T1

t0

20,9 ± 3,4

22,1 ± 3,1

20,3 ± 2,0

t1

22,7 ± 5,6

20,9 ± 4,2

19,4 ± 6,5

t2

22,0 ± 4,6

23,7 ± 2,8

21,6 ± 1,7

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

t0

38,3 ± 4,8

40,0 ± 4,3

t1

40,4 ± 4,0

42,6 ± 3,6

43,7 ± 5,1

t2

39,9 ± 2,4

41,1 ± 3,9

40,1 ± 4,4

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

t0

16,9 ± 1,3

17,2 ± 1,6

17,9 ± 0,8

t1

17,6 ± 1,9

18,4 ± 1,7

19,2 ± 1,2

PC-T1

Nhóm T2 PC-T2

40,7 ± 2,0
> 0,05

>
0,05


(μmol/Lit)

Protein toàn

t2

18,6 ± 1,8

17,9 ± 1,6

19,1 ± 0,9

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

t0

60,7 ± 3,1

59,7 ± 4,3

60,7 ± 2,2

t1

59,0 ± 2,0

61,3 ± 3,8

62,7 ± 4,4

t2

60,4 ± 2,1

60,1 ± 1,6

59,9 ± 1,2

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

7

phần (g/L)

Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo;
t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại
cùng thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2
g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng cơ thể

Như vậy, có thể khẳng định mức liều 3,0 g sinh khối vi tảo N. oculata
QN1/kg khối lượng cơ thể của thỏ/ngày trong nghiên cứu này đã không ảnh hưởng
đến chức năng gan của thỏ được thử nghiệm.
Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng thận của thỏ
thử nghiệm

Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata đến chức năng thận của thỏ thử
nghiệm được trình bày ở Bảng 3.9. Kết quả trình bày ở Bảng 3.9 đã cho thấy hầu
như khơng có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về các chỉ số creatinin và urea
huyết giữa nhóm đối chứng và 2 nhóm uống sinh khối tảo ở nhóm thử T1 và T2 ở
tất cả các thời điểm nghiên cứu và giữa các nhóm thử (P> 0,05).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số chỉ số sinh hóa liên quan đến chức năng
thận của thỏ tại 3 thời điểm t0, t1 và t2
Chỉ tiêu

Creatinin
(μmol/Lit)

Urea
(mmol/Lit)

Nhóm đối
chứng

Nhóm
T1

t0

102,4 ± 9,9

95,6 ± 7,3

96,4 ± 11,7

t1

98,1 ± 8,9

97,3 ± 8,6

100,7 ± 11,3

t2

97,1 ± 10,5

94,9 ± 8,2

97,7 ± 13,6

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

t0

6,2 ± 0,9

5,9 ± 0,7

6,1 ± 0,5

t1

6,0 ± 1,1

6,1 ± 0,6

t2

6,4 ± 1,4

6,0 ± 1,0

6,1 ± 0,8

Ptrước-sau

> 0,05

> 0,05

> 0,05

n

7

7

PC-T1

> 0,05

Nhóm T2

6,2± 1,3

PC-T2

> 0,05

Ghi chú: T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng cơ


thể; t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm
sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại cùng thời
điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm

Như vậy, với mức liều uống 3,0 g sinh khối tảo/kg khối lượng cơ thể của
thỏ/ngày đã không gây ảnh hưởng đến chức năng thận của thỏ được sử dụng trong
thí nghiệm của chúng tơi.
Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 tới sự thay đổi mô bệnh học
gan, thận của thỏ thí nghiệm
Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 lên sự thay đổi mơ bệnh
học gan, thận của thỏ thí nghiệm được xác định nhờ giải phẫu mô bệnh và quan sát
tổng quát đại thể và vi thể tổ chức mơ dưới kính hiển vi. Sau khi kết thúc thời gian
cho thỏ uống sinh khối vi tảo với 2 mức liều 1,2 và 3,0 g/kg KLCT thỏ/ngày (kéo
dài liên tục trong 28 ngày), lấy ngẫu nhiên mẫu gan và thận của 3 thỏ trên mỗi
nhóm để làm tiêu bản, và quan sát đại và vi thể tại Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnhTrường Đại học Y Hà Nội. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.6.
Như vậy, sinh khối vi tảo biển N. oculata QN1 h ng g độc tính cấp d

thử ở mức liều cao tối đa so với thể tích dạ dà chuột 3 g g hối lượng cơ thể
chuột) trên chuột thực nghiệm. Chúng tôi không phát hiện thấy giá trị LD50 ở tất
cả các liều 15, 20, 25 và 30 g/kg khối lượng cơ thể chuột đã nghiên cứu. Điều này
cho thấy bột tảo khô N. oculata QN1 với liều uống đến 30 g/kg khối lượng cơ thể
chuột là sản phẩm h ng độc.
Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn của sinh khối vi tảo N. oculata
QN1 ở mức liều uống 1,2 và 3,0 g/kg khối lượng cơ thể thỏ/ngày trong 28 ngày
liên tục đã cho thấy sinh khối tảo đã h ng ảnh hưởng đến thể trạng; hoạt động
của thỏ được thử nghiệm; không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu; chức năng và
mô học của gan và thận của thỏ thử nghiệm so với l đối chứng. Sinh khối vi tảo
N. oculata QN1 là hoàn toàn an toàn khi sử dụng cho động vật.


Lơ đối chứng (C1)

Lơ thí nghiệm 1 (T1)

Gan thỏ C1.1: Nhu mô gan
Gan thỏ T1.1: Các tế bào
xung huyết nhẹ. Nhuộm HE gan thối hóa nhẹ. HE x 400.
x 100

Thận thỏ C1.1: Nhu mô
thận xung huyết nhẹ.
Nhuộm HE x 100

Thận thỏ T1.1: Cầu thận
sung huyết nhẹ. HE x 100

Lơ thí nghiệm 2 (T2)

Gan thỏ T2.1: Tế bào gan
thối hóa nhẹ. Nhuộm HE
x 400.

Thận thỏ T2.1: Các ống
thận sung huyết nhẹ. HE x
100

Ghi chú : Lơ thử nghiệm T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống
3,0g/kg khối lượng cơ thể
Hình 3.6. Ảnh sinh thiết tế bào gan, thận của lô thỏ đối chứng và các lơ thỏ thí nghiệm

3.3.1.3. Nghiên cứu đánh giá hành vi của chuột thực nghiệm khi sử dụng sinh khối
tảo N. oculata QN1
Kết quả nghiên cứu trong môi trường mở
Kết quả về các chỉ số của chuột trong bài tập môi trường mở được thể hiện ở
Hình 3.7, 3.8 và 3.9.

Hình 3.7: Qng đƣờng chuột
vận động trong mơi trƣờng mở

Hình 3.8: Tốc độ trung bình chuột
vận động trong mơi trƣờng mở

Hình 3.9: Quãng đƣờng chuột
vận động trong môi trƣờng mở


Chúng tôi nhận thấy các chỉ số về quãng đường vận động, tốc độ vận động

trung bình và thời gian ở vùng trung tâm của chuột ở cả 3 nhóm khơng có sự khác
biệt. Điều đó chứng tỏ uống dung dịch vi tảo N. oculata QN1 (liều 4,8 g và 12
g/kg KLCT chuột) không ảnh hưởng đến chức năng vận động và khả năng khám
phá của chuột.

Nghiên cứu trong bài tập nhận thức đồ vật
Kết quả về thời gian và tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống nhau trong
ngày thứ 2 của bài tập được thể hiện ở Hình 3.10 và 3.11.
(giây
)

(lần)

Hình 3.10: Thời gian chuột phám phá
hai đồ vật giống nhau

Hình 3.11. Tần suất chuột phám phá
hai đồ vật giống nhau

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.10 và 3.11 đã cho thấy thời
gian và tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống hệt nhau trong ngày tập thứ hai
của bài tập là không có sự khác biệt giữa vật A và vật B trong từng nhóm. Đồng
thời khi so sánh về thời gian và tần suất khám phá hai đồ vật trên cả 3 nhóm
(nhóm chứng, nhóm 4,8 g/kg và 12 g/kg) cũng khơng thấy có sự khác biệt. Kết
quả này cho thấy chuột uống dung dịch NaCl 0,9% và vi tảo ở hai liều khác nhau
(4,8 g/kg và 12 g/kg) có kết quả tương tự nhau ở ngày tập thứ 2 của bài tập.

Hình 3.12. Thời gian chuột phám phá
đồ vật cũ (vật A) và đồ vật mới (vật B)

Hình 3.13. Tần suất chuột phám phá
đồ vật cũ (vật A) và đồ vật mới (vật B)