Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bốn loài địa y thu hái ở miền nam việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



DƯƠNG THÚC HUY

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA BỐN LOÀI ĐỊA Y
THU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62 44 27 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh 2016


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Tp Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng
2. GS.TS. Joel Boustie

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Hùng
Phản biện 2: PGS.TS. Phạm Đình Hùng
Phản biện 3: PGS.TS. Trần Công Luận

Phản biện độc lập 1: TS. Nguyễn Trọng Tuân
Phản biện độc lập 2: TS. Lê Hoàng Duy

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp trường họp
tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh vào hồi ......
giờ ....... ngày ........ tháng........ năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại:
-

Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên-HCM.

-

Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM.


I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Địa y là loài thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh giữa nấm (mycobiont) và
một bộ phận quang hợp (photobiont và phycobiont) thường là tảo và thỉnh thoảng là vi
khuẩn lam (cyanobacterium). Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi như
trên đất đá, thân cây, lá cây, trong những điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến vùng
khắc nghiệt.
Ngay từ thời cổ đại, địa y đã được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, làm thực phẩm, mỹ
phẩm, xà phòng, nước hoa, …Nhiều hợp chất trong địa y đã được cô lập và một vài hợp
chất trong số đó được xác định có tính kháng khuẩn, kháng vi rút, kháng ung thư, giảm đau,
hạ sốt, …
Chi Parmotrema, họ Parmeliaceae, là loài địa y phiến, rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới.
Trên thế giới có khoảng 220 loài thuộc chi này và có nhiều loài đã được khảo sát về mặt hóa

dược, cho kết quả rất khả quan. Ngoài ra chi Roccella được nghiên cứu khá ít trên thế giới
về mặt hóa thực vật.
Với những lý do trên chúng tôi đã chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và thử
nghiệm một số hoạt tính sinh học của bốn loài địa y thu hái ở miền Nam Việt Nam”
2. Đối tƣợng nghiên cứu
Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow được thu hái tại núi
Tà Cú, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận. Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale được
thu hái tại chùa Hang, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận. Địa y Parmotrema
planatilobatum (Hale) Hale và Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale được thu hái tại
thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Thu mẫu, xử lý, bảo quản và định danh đối tượng nghiên cứu.
Ngâm, chiết các mẫu địa y để thu được các cao tương ứng.
Sắc ký cột silica gel trên các cao để cô lập các hợp chất tinh sạch.
Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp quang phổ.
Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết, một số hợp chất cô lập.

1


Hình 1.1: Địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale (trái)
và Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (phải)

Hình 1.2: Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow)
Krog & Swincow

Hình 1.3: Địa y2 Roccella sinensis (Nyl.) Hale


4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Các phương pháp chiết với các dung môi hữu cơ thông dụng để thu các cao.
Các phương pháp sắc ký, kết tinh,... để cô lập các hợp chất tinh khiết.
Các phương pháp quang phổ NMR và MS để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
tinh khiết cô lập được từ loài địa y lựa chọn khảo sát.
Các phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn, đóng góp mới của luận án
Luận án đã cô lập và xác định được 49 hợp chất trong đó có 15 hợp chất mới lần đầu
tiên cô lập được trong tự nhiên cùng với 14 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong chi
Parmotrema và Roccella.
Đã thử hoạt tính gây độc trên bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung
(HeLa), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư gan (HepG2). Kết quả cho thấy hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol

(13),

hopan-6α,16α,22-triol

(15),

parmosidone

C

(34),

parmoether B (32), montagnetol F (48) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế
bào ung thư và được xác định giá trị IC50. Kết quả IC50 cho thấy chỉ có hợp chất 32 cho hoạt
tính trung bình đối với NCI-H460, MCF-7 và HepG2.
6. Bố cục luận án
Luận án gồm 117 trang trong đó có 19 bảng và 43 hình.
Luận án bao gồm các phần sau:

Chương 1: Tổng quan (23 trang).
Chương 2: Thực nghiệm (14 trang).
Chương 3: Kết quả và thảo luận (61 trang).
Chương 4: Kết luận và kiến nghị (8 trang).
Danh mục các công trình liên quan luận án (1 trang).
Tài liệu tham khảo, đã sử dụng 75 tài liệu liên quan (7 trang).
Các phụ lục phổ (261 phổ, trình bày trong 147 trang)

3


Địa y Parmotrema sancti-angelii (950,0 g bột)
Bột không tan
P (30,0 g)

Rửa bằng aceton nóng

Cao thô (145,1 g)
Cao aceton (110,4 g)
A

20%

10%
H0 (6,1 g)

CC/H:A

H1 (2,1 g)

30%
C (15,4 g)

EA1 (4,5 g)

H0.2-0.4 (1,9 g)

H1.1 (1,1 g)

C 100%

C 100%

EA2 (5,0 g)

CC/A

CC/A

H0.1 (3,3 g)

70-100%

60%

40%

H1.2+4 (0,5 g) H1.5
(197,3 mg)

EA1.1 (1,9 g)

EA3
(20,0 g)

EA1.2 (2,1 g)

CC/A

pTLC/C

H0.1.1-0.1.3
(1,5 g)

H0.1.4 (1,0 g)

H1.1.1 (200,2 mg)
CC/A

H0.1.4.1
(695,8 mg)
CC
H:A 9:1

2 (495,8 mg)
12 (6,8 mg)
18 (3,9 mg)

H0.1.4.2
(119,5 mg)

17 (19,8 mg)

H1.1.2 (498,4 mg)

EA1.1.1
(998,9
g)
Washing by
aceton
16 (4,9 mg) CC/A
11 (99,2 mg)

pTLC
C:M 100:4

1 (197,9 mg)
3 (98,8 mg)
4 (395,7 mg)
8 (19,7 mg)
10 (4,9 mg)

13 (5,2 mg)
14 (10,1 mg)
15 (19,8 mg)

Hệ dung môi A Hexan: ethyl acetat: acid acetic 9:1:0.5
Hệ dung môi B Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.02
Hệ dung môi C Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.4

Lichen
Parmotrema
(350
g dry
thallus)
Sơ đồ 1. Sơ
đồ phân
lập cácplantạiilobtạium
hợp chất từ địa
y P.
sancti-angelii

4

EA1.1.2
(219,5 mg)
CC/B

9 (14,7 mg)
19 (3,8 mg)

Hỗn hợp 5+6+7
CC/A

5 (295,8 mg)
6 (198,8 mg)
7 (49,5 mg)


Địa y Parmotrema planatilobatum (350 g bột)

Tủa P (2,0 g)
Cao methanol thô (63,0 g)
Chiết pha rắn, giải ly với petroleum ether - ethyl acetat
0%

20-50%

Cao P.E (1,5 g)

Cao EA1 (22,1 g)

EA1.2-1.3 (6,3 g)

EA1.1 (7,9 g)

Cao EA2 (12,1g)

Cao M (10,2 g)

CC/C:M 9:1:0.5

EA1.1.2 (2,0 g)

C18-Rp CC/ M:W 2:3

20 (5,9 mg)
21 (14,7 mg)
22 (5,8 mg)
23 (7,9 mg)

Methanol

EA1.4 (1,5 g)

CC/ C:M 9:1

EA1.1.1 (3,5 g)

60-100%

EA1.4.1 (495,7 mg)
CC/C:M 9:1

24 (295,7 mg)
26 (795,6 mg)
EA: ethyl acetat
Ac: aceton
C: chloroform
M: methanol
W: nước

EA1.4.2 (197,8 mg)
C18-Rp CC/ M:W 2:3
pTLC C:EA:Ac 9:1:1

25 (5,0 mg)

C18-Rp Sắc ký cột pha đảo C18

Sơ đồ 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ địa y từ P. planatilobatum

5


Địa y Parmotrema tsavoense (1350 g bột)

Rửa bằng aceton

Cao methanol (249,8 g)

Tủa (79,7 g)

29 (19,8 g)
30 (29,9 mg)

CC/H:A 9:1-0:10

A 10%

20%

30%

P1 (9,9 g)

P2 (2,8 g)

P3 (3,3 g)

50%

P4 (3,1 g)

P5 (16,1 g)

P3.1 (0,1 g)
CC/A

11 (19,7 mg)

P3.2 (0,8 g)
CC/F

31 (6,9 mg)
36 (3,1 mg)

P3.3 (1,1g) P5.1(1,1g)
CC/G

P5.2-5.4
(10,7g)

CC/A

100%

P6 (9,9 g)

Phần còn lại
A:M 9:1-0:10

Sephadex LH-20

P6.1
(3,0 g)

P6.2
(2,5 g)

P6.3 P7
(3,8 g) (5,1 g)

CC/D
pTLC/D

27 (10,9 mg)

37 (6,1 mg)
38 (4,2 mg)
P5.1.1 (0,2 g)

P5.1.2 (0,2 g)

CC/A

33 (7,9 mg)
32 (5,9 mg)
Ghi chú:
EA: ethyl acetat
Ac: aceton

C: chloroform
M: methanol
W: nước

60%

CC/A

CC/A

CC/A

1 (98,9 mg)
2 (295,7 mg)
3 (199,1 mg)
4 (99,8 mg)

40%

CC/B
pTLC/C

28 (4,8 mg)
34 (5,9 mg)
35 (9,8 mg)

Hệ dung môi A
Hệ dung môi B
Hệ dung môi C
Hệ dung môi D

Hệ dung môi E
Hệ dung môi F
Hệ dung môi G

H:EA:AcOH
C:EA:AcOH
C:EA:AcOH
C:M
C:M
C:EA
H:C:EA

Sơ đồ 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ địa y từ Parmotrema tsavoense
6

9:1:0.02
85:15:0.02
75:25:0.02
88:12
70:30
5:0.04
1:1:1

M
(80,1 g)


Địa y Roccella sinensis (1.700 g bột)

Cao methanol thô (450 g)

CC/H:A 9:1-0:10

EA (0%)

(10%)

H (10,2 g)

(20%)

EA1 (21,1 g)

EA2 (66,1 g)

CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02

EA1.1 (2,8 g)
CC/A

EA1.1.1
EA1.1.2
(298,8 mg) (1.2 g)
(lấy 300
mg)

CC/A
pTLC/A

EA1.2 (15,1 g)

CC/A
pTLC/A

EA3. (29,8 g)

EA1.2.2
(3,4 g)

pTLC/C

5 (195,5 mg) 4 (295,7 mg) 49 (7,8 mg)
9 (6,9 mg)
46 (8,8 mg)
45 (14,8 mg) 47 (9,7 mg)

EA4 (64,2 g)

EA2.1.1
(8,0 g)

41 (20,2 mg)
43 (1,5 g)
44 (1,0 g)
48 (13,1 mg)

EA4.2 (25,3 g)

EA4.1.1-3 EA4.1.4
(8,1 g)
(6,4 g)

EA4.3 (15,2 g)

Ghi chú:
EA: ethyl acetat
Ac: aceton
C: chloroform
M: methanol
W: nước

CC/B

39 (6,1 mg)
6 (30,1 mg)
40 (9,9 mg)
42 (79,7 mg)

Hệ dung môi A
Hệ dung môi B
Hệ dung môi C
Hệ dung môi D
Hệ dung môi E

H:EA:AcOH
C:EA:Ac
C:EA:Ac:AcOH
H:EA:AcOH
H:EC:A

Sơ đồ 4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ địa y từ Roccella sinensis

7

Methanol (50,4 g)

CC/D
pTLC/E

EA2.1.2 EA2.1.3
(2,5 g) (10,2 g)

CC/B
pTLC/C

Methanol

CC/H:A:AcOH 7:3:0.02-0:10:0.02

CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02

CC/B

EA1.2.1
(0,3 g)

(70-100%)

EA1.3 (1,1 g) EA2.1 (22,1 g) EA2.2 (33,9 g) EA4.1 (16,1 g)

CC/B

EA1.1.3
(1,2 g)

(40%)

9:1:0.05
9:1:3
9:1:3:0.02
7:3:0.02
1:1:1


II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Phần tổng quan của luận án trình bày về:
 Định nghĩa, ứng dụng, hoạt tính sinh học và sinh tổng hợp của các hợp chất địa y.
 Tổng kết các công trình nghiên cứu ở trong nước cũng như trên thế giới về hóa học và
hoạt tính sinh học của các loài địa y thuộc chi Parmotrema và chi Roccella.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, thiết bị
Phần này mô tả chi tiết hóa chất và thiết bị được sử dụng cho nghiên cứu.
2.2. Nguyên liệu
Phần này mô tả chi tiết nguyên liệu, mẫu địa y sử dụng cho nghiên cứu.
2.3 Trích ly và cô lập các hợp chất
Phần này mô tả chi tiết quá trình trích ly và cô lập các hợp chất từ bốn loài địa y sử dụng
cho nghiên cứu
2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại 4 dòng tế bào ung thư (Hela, MCF-7, HepG2 và NCIH460) của các mẫu là các hợp chất tinh sạch được thực hiện ở nồng độ 100 µg/mL, sử dụng
chất nhuộm Sulforhodamine B (SRB) và chất chứng dương là camptothecin.
Mẫu được gửi thử nghiệm tại Bộ môn Di truyền. Khoa Sinh. Trường Đại học Khoa Học

Tự Nhiên. 227 đường Nguyễn Văn Cừ. Quận 5, TP. Hồ Chí Minh.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập
Từ bốn loài địa y khảo sát như trình bày trong chương 2, chúng tôi đã cô lập được 49
hợp chất, trong đó có 15 hợp chất mới.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu
phổ nghiệm IR, MS, 1D và 2D–NMR, đo năng lực triền quang và nhiệt độ nóng chảy, kết
hợp so sánh với số liệu trong tài liệu tham khảo, đã được trình bày chi tiết trong quyển luận
án.
8


Các hợp chất được phân loại theo 8 nhóm được trình bày trong bảng 3.1.
Quyển tóm tắt luận án chỉ trình bày khảo sát cấu trúc hóa học của một vài hợp chất
thuộc các khung sườn depsidone, diphenyl ether và dẫn xuất erythritol.
Nhóm 1: Hợp chất đơn vòng

6 hợp chất

Nhóm 2: Depside

5 hợp chất

Nhóm 3: Depsidone

6 hợp chất

Nhóm 4: Dẫn xuất của acid furfuric

5 hợp chất

Nhóm 5: Diphenyl ether

3 hợp chất

Nhóm 6: Dẫn xuất của erythritol

9 hợp chất

Nhóm 7: Steroid và triterpenoid

8 hợp chất

Nhóm 8: Các hợp chất loại khác

7 hợp chất

Parmosidone A (38)
Hợp chất 38 được cô lập ở dạng vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử được xác
định là C18H14O9 thông qua khối phổ phân giải cao chế độ ghi nhận ion âm tại mũi ion phân
tử giả m/z 373.0578 [MH]. Phổ 1H NMR cho thấy sự xuất hiện một nhóm aldehyde tại δ
10.61 (1H, s), một nhóm methine nhân thơm δ 6.78 (1H, s), một nhóm hydroxymethylene
tại δ 4.49 (2H, s) và hai nhóm methyl tại δ 2.41 và 2.62 (mỗi nhóm 3H, s). Phổ 13C NMR và
HSQC của 38 (Bảng 3.3) cho thấy sự hiện diện của 18 carbon bao gồm một nhóm formyl (
192.2), hai nhóm carbonyl ( 170.6 và 162.2), 12 carbon nhân thơm, trong đó có 5 carbon
mang oxygen cộng hưởng trong vùng 164111 ppm, một carbon oxymethylene tại  52.5 và
hai nhóm methyl tại  21.4 và 14.2. Trong phổ HMBC (Hình 3.5), proton aldehyde tại 
10.61 cho tương quan với các carbon tại  111.6 (C-3), 116.7 (C-5), 164.1 (C-4). Tín hiệu
proton nhân thơm ( 6.78, H-5) cho tương quan với các carbon tại  111.6 (C-3), 164.1 (C4) và với nhóm methyl (C-9) và đồng thời các proton này ( 2.41, H3-9), cũng có tương

quan với các carbon tại  116.7 (C-5), 112.5 (C-1), và 151.9 (C-6). Vì thế, vòng A của 38
được xác định là 3-formyl-4-hydroxy-6-methyl-2-O-aryl-1-carbonyl.
Trong vòng B, phổ HMBC của 38 cho thấy sự tương quan của proton của nhóm
oxymethylene tại  4.49 (H2-8') với các carbon tại  117.5 (C-3'), 143.8 (C-4'), 162.2 (C-2')
9


và của proton của nhóm methyl thứ hai tại ( 2.62, H3-9') với các carbon tại  115.6 (C-1'),
131.6 (C-5'), 139.6 (C-6'), 162.2 (C-2'), và 170.6 (C-7'). Hai tương quan 4J của H3-9' giúp
xác định vị trí lân cận giữa nhóm methyl và nhóm carboxyl trên vòng B. Vì thế, vòng B của
38 được xác định là 2',4',5'-trihydroxy-3'-hydroxymethylene-6'-methyl-1'-carbonyl.
Trong quá trình xác định cấu trúc của 38, chúng tôi nhận thấy dữ liệu phổ của 38 có sự
tương đồng với dữ liệu phổ của acid protocetraric (Brandao L. F. G. et al., 2013 [10]). Tuy
nhiên, sự so sánh chi tiết dữ liệu phổ 13C NMR của 38 và acid protocetraric cho thấy có sự
khác nhau của những tín hiệu thuộc vòng B giữa chúng, cụ thể với các carbon C-2' (C =
+7.8), C-5' (C = 10.3), và C-6' (C = +10.3) mặc dù chúng được đo trong cùng dung
môi DMSO-d6. Sự thay đổi về dữ liệu phổ 13C có thể xuất phát từ sự thay đổi vị trí của các
nhóm thế trên nhân thơm B. Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ MS, 1D và 2D-NMR giúp xác
định trên nhân B của 38, nhóm methyl đã tráo đổi vị trí với nhóm hydroxymethylene. Ngoài
ra, từ sự phân tích về sự lân cận của nhóm methyl và nhóm carboxyl giúp xác định nhóm
carboxyl cũng đã tráo đổi vị trí với nhóm hydroxyl, khi so sánh với acid protocetraric, một
para-depsidone đã biết. Như vậy, 38 được đề nghị là một meta-depsidone, được đặt tên là
parmosidone A, với công thức được trình bày trong hình 3.5.

Hình 3.5: Một số tương quan HMBC của 31, 37, và 38.

10


Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của 29-31, 37-38

29a

N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
7'OCH3

δH, J (Hz)

6.83 (s)

10.59 (s)
2.43 (s)

4.60 (s)
2.40 (s)

30a

δC
112.4
161.2
111.8
163.8
117.0
152.0
163.9
191.7
21.3
116.6
155.0
118.6
144.5
141.7
129.4
170.1
52.9
14.3

δH, J (Hz)

6.84 (s)

10.58 (s)

2.42 (s)

4.50 (s)
2.40 (s)
3.22 (s)

31a

δC
112.5
161.5
112.5
164.4
117.6
152.2
164.6
192.0
21.8
116.5
155.9
116.3
146.0
142.6
131.4
170.8
62.8
15.0

δH, J (Hz)

6.80 (s)

10.62 (s)
2.42 (s)

2.07 (s)
2.57 (s)

37b

38b

δCb
113.8
164.9
111.6
164.9
116.8
151.9
162.0
192.2
21.4
116.8
162.0
115.0
143.7
128.9
139.9
nd
9.1

14.1

δH, J (Hz)

6.78 (s)

10.61 (s)
2.41 (s)

4.49 (s)
2.62 (s)

δC
112.5
161.9
111.6
164.1
116.7
151.9
162.2
192.2
21.4
115.6
162.2
117.5
143.8
131.6
139.6
170.6
52.5

14.2

δH, J (Hz)

2.23 (s)

112.6
150.7
132.2
150.8
114.4
133.7
163.3
19.9

4.46 (s)
2.77 (s)

115.1
163.3
116.6
144.0
132.2
139.9
170.9
52.9
14.2

6.54 (s)

57.9
10.27 (s)
8.85 (s)

Tất cả phổ NMR được đo trong DMSO-d6: a 500
MHz, b 400 MHz, nd: không xác định

11

δC


Parmoether A (33)
Hợp chất 33 được cô lập dưới dạng vô định hình, màu trắng. Phổ HR-ESI-MS giúp xác
định công thức phân tử của 33 là C28H28O11, trong đó có ít hơn một nguyên tử oxygen và có
nhiều hơn 4 nguyên tử hydrogen khi so sánh với 34.
Phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC của 33 cho thấy sự hiện diện của 15 tín hiệu
singlet, bao gồm một nhóm aldehyde (δ 10.31), hai proton nhân thơm (δ 6.55 và 6.11), hai
nhóm methoxy (δ 3.06 và 3.78), một nhóm methylene (δ 3.78), bốn nhóm methyl (δ 2.35,
2.08, 1.98, và 1.89), và năm nhóm hydroxy (δ 11.94, 9.89, 9.62, 9.23 và 8.82). Phổ

13

C-

NMR cho thấy sự hiện diện của 28 carbon bao gồm một nhóm aldehyde (δ 194.4), hai nhóm
carboxyl ester (δ 170.6 và 165.4), 18 carbon nhân thơm cộng hưởng trong vùng 162-107
ppm, trong đó có hai nhóm methine tại δ 111.7, và 107.3. Ở vùng từ trường cao, phổ 13CNMR còn cho thấy hai nhóm methoxy (δ 51.6 và 51.3), một nhóm methylene (δ 20.4), và
bốn nhóm methyl (δ 19.9, 17.5, 16.1 và 8.9).
So sánh dữ liệu phổ NMR và MS giữa 33 và 34 cho thấy 33 cũng chứa ba nhân thơm

nhưng mất đi một carbon carboxyl và chứa nhiều hơn một nhóm methoxy và một nhóm
methine nhân thơm. Trên vòng A, phổ HMBC (Hình 3.8) cho thấy sự tương quan của H-5
tại δ 6.55 với các carbon tại δ 113.7 (C-1), 109.7 (C-3), 162.3 (C-4), và 19.9 (C-9); của H3-9
tại δ 2.08 với C-1, C-2, và C-3, và của nhóm aldehyde tại δ 10.31 (H-8) và 4-OH tại δ 11.94
với C-3, C-4, và C-5. Những tương quan này giúp xác định hợp chất 33 phải sở hữu đặc
điểm cấu trúc vòng A tương tự như atranorin (2), hay vòng A của các hợp chất 29, 31, 37,
và 38. Tuy nhiên, những khác biệt rõ rệt trong độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của proton
thơm (H-5), proton aldehyde (H-8), và proton nhóm methyl (H3-9) của 33 khi so sánh với
những nhóm thế tương tự trong các hợp chất 29, 31, 37, và 38 mặc dù chúng được đo trong
cùng dung môi DMSO-d6 (Bảng 3.5), như vậy có sự thay đổi trong khung sườn của vòng A
của 33 và những dẫn chứng trên còn chứng tỏ 33 không phải là một depsidone. Cụ thể, vòng
lactone bảy cạnh như trong các hợp chất 29, 31, 37, và 38 đã bị mở vòng để thành nhóm
methoxycarbonyl gắn tại C-1 của nhân A và nhóm hydroxyl gắn tại C-4' của nhân B. Hơn
nữa các đặc điểm cấu trúc này được xác định bởi tương quan HMBC của nhóm methoxy tại
δ 3.06 với carbon carboxyl tại δ 165.4. Vì thế, 33 phải có cấu trúc của một diphenyl ether.

12


Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của 25, 32, và 33.
33 (DMSO-d6)a

NO
1
2
3
4
5
6
7

8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
1''
2''
3''
4''
5''
6''
7''
8''
9''
7-OCH3
7''-OCH3
4-OH
2'-OH
4'-OH

δH

6.54 (1H, s)

10.31 (1H, s)

2.08 (3H, s)
3.08 (3H, s)
6.11 (1H, s)

3.77 (2H, s)
1.89 (3H, s)

1.97 (3H, s)
2.35 (3H, s)
3.08 (3H, s)
3.77 (3H, s)
11.94 (1H, s)
9.89 (1H, s)
9.23 (1H, s)

2''-OH

9.61 (1H, s)

4''-OH

8.82 (1H, s)

δC
113.7
157.4
109.7
162.3
111.7
146.5

165.4
194.4
19.9
107.3
151.9
112.1
148.0
134.0
128.4
20.4
16.1
111.7
154.2
109.0
156.1
118.0
134.5
170.6
8.9
17.5
51.3
51.6

32 (Acetone-d6)b

δH

6.53 (1H, s)

10.42 (1H, s)

2.16 (3H, s)
6.22 (1H, s)

3.99 (2H, s)
1.95 (3H, s)

10.32 (1H, s)
2.56 (3H, s)
3.28 (3H, s)
3.94 (3H, s)
12.11(1H, s)

25 (CDCl3)b

δC
115.4
153.6
110.8
164.4
113.1
148.3
166.3
195.6
20.0
108.7
151.3
112.7
148.3
134.0
129.5

20.5
16.7
108.4
158.7
106.5
164.6
121.2
149.4
171.9
194.8
20.0
51.9
52.7

δH

6.53 (1H, s)

10.32 (1H, s)
2.21 (3H, s)
6.27 (1H, s)

3.85 (2H, s)
1.98 (3H, s)
6.30 (1H, s)

6.30 (1H, s)

δC
115.1

158.3
110.2
164.0
114.0
145.8
167.3
193.6
20.8
110.4
151.5
112.8
147.3
136.1
129.1
17.5
16.9
109.8
154.3
110.8
154.3
109.8
139.0

2.18 (3H, s)

21.3

3.23 (3H, s)
12.03 (1H, s)

52.2

Phổ NMR được ghi ở a 400 MHz, b 500 MHz

Sự so sánh dữ liệu NMR của 33 và 34 cho thấy vòng C của 33 có thể là một dẫn xuất
của methyl -orsellinate. Hơn nữa, đặc điểm cấu trúc này được tái xác định bởi phổ HMBC
của 33 (Hình 3.8) với tương quan của nhóm H3-8'' tại δ 1.98 với các carbon tại δ 109.0 (C3''), 154.2 (C-2''), và 156.1 (C-4''); của H3-9'' tại δ 2.35 với các carbon tại δ 111.7 (C-1''),
13


118.0 (C-5''), và 134.5 (C-6''); của 2''-OH tại δ 9.62 với các carbon tại δ 111.7 (C-1''), 154.2
(C-2''), và 109.0 (C-3'') và của nhóm methoxy tại δ 3.78 (7''-OCH3) với carbon carboxyl tại
δ 170.6. Như vậy, vòng A và C của 33 được xác định. Vì thế, khi so sánh với hợp chất 34,
sự biến mất của một carbon carboxyl và đồng thời với sự xuất hiện của một nhóm methine
thơm của 33 tại vòng B đã giúp suy ra sự thay thế nhóm carbonyl bằng nhóm methine trong
33. Trên vòng B, tương quan HMBC của H-1' tại δ 6.11 với các carbon tại δ 151.9 (C-2'),
134.0 (C-5'), 112.1 (C-3'), và 16.1 (C-8') và của H3-8' tại δ 1.89 với các carbon tại δ 107.3
(C-1'), 128.4 (C-6'), và 134.0 (C-5'). Ngoài ra, tương quan NOESY giúp xác định sự lân cận
giữa H-1' và H3-8'. Proton của H2-7' tại δ 3.78 cho tương quan HMBC với các carbon tại δ
112.1 (C-3'), 148.0 (C-4'), và 151.9 (C-2') trên vòng B, và với các carbon tại δ 118.0 (C-5''),
134.5 (C-6''), 156.1 (C-4'') của vòng C. Vì thế, vòng C phải kết nối với vòng B thông qua
carbon nhóm methylene (C-7').
Dựa vào đặc điểm trên, cấu trúc phù hợp nhất của 33 là dẫn xuất ether xuất phát từ acid
furfuric (một para-depsidone) (Cấu trúc 33x, Hình 3.8) hay dẫn xuất của parmosidone C
(một meta-depsidone) (cấu trúc 33y, Hình 3.8). May mắn thay, tương quan HMBC của hai
nhóm hydroxyl tại δ 9.89 (2'-OH) và 9.23 (4'-OH) cũng như của nhóm methylene tại δ 3.78
(H2-7') với cùng carbon tại δ 112.1 (C-3') giúp xác định cấu trúc của 33 là dẫn xuất của acid
furfuric với vòng bảy cạnh bị mở và với sự mất đi của một nhóm carboxyl trên nhân B. Như
vậy, cấu trúc hoá học của 33 được xác định như trình bày trong hình 3.8 và được đặt tên là
parmoether A.

Hình 3.8: Một số tương quan HMBC và NOESY của 25, 32, và 33
14


Montagnetol A (41)
Hợp chất 41 được cô lập dưới dạng bột màu trắng. Công thức phân tử được xác định là
C12H14O6, dựa trên phổ HR-ESI-MS (tại m/z 277.0739 [M-H]-, với tính toán 277.0688),
chứa 6 độ bất bão hòa. Phổ 1H NMR kết hợp với phổ 13C và HSQC cho thấy sự hiện diện
của một nhóm methyl H3-8' (δH 2.50, δC 24.2) và hai nhóm methine ghép meta với nhau,
CH-3' (δH 6.23, d, 2.0 Hz; δC 101.6) và CH-5’ (δH 6.27, d, 2.0 Hz; δC 112.3), tương ứng cho
một đơn vị orsellinyl (C8H7O4) và những tín hiệu của một đơn vị butanetetraol, bao gồm hai
nhóm methylene sp3 mang oxygen, CH2-1 (δH 4.10, dd, 10.0, 5.5 Hz, H-1a; δH 3.94, dd,
10.0, 4.0 Hz, H-1b; δC 72.7) và CH2-4 (δH 4.00, dd, 9.0, 6.0 Hz, H-4a; δH 3.70, dd, 9.0, 6.0
Hz, H-4b; δC 75.4) và hai nhóm methine sp3 mang oxygen, CH-2 (δH 5.45, m; δC 70.9) và
CH-3 (δH 4.59, m; δC 71.0). Những đặc điểm cấu trúc này tương đồng với dữ liệu của hợp
chất D-(+)-montagnetol (43). Độ dịch chuyển hóa học của H-2 (5.45, m) dời về vùng từ
trường thấp giúp xác định đơn vị orsellinyl tại C-2, và được tái xác định nhờ tương quan
HMBC của H-2 với C-7'. Kết hợp với công thức phân tử, 41 sở hữu nhiều hơn một độ bất
bão hòa so với 43 và cùng với việc mất đi một đơn vị H2O giúp xác định sự đóng vòng giữa
hai nhóm hydroxyl tạo thành ether trong 41 khi so sánh với 43. Ngoài ra, proton H-1 cho
tương quan HMBC với C-4 và ngược lại, củng cố khung sườn tetrahydrofuran của 41.

Hình 3.14: Một số tương quan HMBC, NOESY của 41.
.
Trong trường hợp của 41, hằng số ghép cũng như tương quan NOESY không đủ tin cậy
để xác định hóa lập thể của 41, vì thế, những ảnh hưởng của nhóm thế trên cyclopentane
(Edwards D. M., 1992) [22] được vận dụng để xác định hóa lập thể của 41. Về nguyên tắc,
các proton không tương đương diastereotopic của nhóm methylene sở hữu độ dịch chuyển
hóa học 1H khác nhau. Cụ thể hơn, một proton vị trí cis với một nhóm thế sẽ chuyển dịch về

vùng từ trường cao hơn so với khi nó ở tương quan cis với một proton khác. Trong trường
15


hợp của 41, những proton ở vùng từ trường cao H-1b (δH 3.94) và H-4b (δH 3.70) phải ở
cùng phía với các nhóm 2-OPh và 3-OH. Ngoài ra, các proton H-1b và H-4b cũng cho
tương quan NOESY với nhóm methyl 6'-CH3, củng cố vị trí cis của H-1b và H-4b. Những
nhận định này giúp xác định các proton H-1a, H-2, H-3, và H-4a phải ở cùng phía với nhau
và khác phía với các nhóm 2-OPh và 3-OH. Như vậy, cấu trúc của 41 được xác định như
trình bày trong hình 3.14 và hợp chất được đặt tên là montagnetol A.

Montagnetol D (48)
Hợp chất 48 được cô lập dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử
được xác định là C20H22O10 dựa trên phổ HR-ESI-MS (mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z
421.1128, với giá trị tính toán 421.1133). Phổ 1H và 13C NMR của 48 tương đồng với dữ
liệu của 43, ngoại trừ sự hiện diện của thêm một đơn vị thơm orsellinyl. Tín hiệu của hai
đơn vị orsellinyl rất giống nhau và có thể trao đổi nhưng có thể phân biệt một phần nhờ phổ
NOESY (Hình 3.15). Các tương quan NOESY của H-2 và H-3 với H3-8'' (δH 2.41), cũng
như của H3-8'' với H-5'' (δH 6.25) giúp xác định rõ độ dịch chuyển hóa học 1H của hai đơn vị
orsellinyl. Tuy nhiên, độ dịch chuyển hóa học 13C của chúng thì không thể được phân biệt.
Ngoài ra, proton H-2 ở vùng từ trường thấp (δH 5.67, dd, 7.0 Hz, 2.5 Hz) và H-3 (δH
4.12, m) khi so với proton H-2 của 43 [δH 4.00 (H-2) và 3.72 (H-3)] giúp xác định vị trí của
đơn vị orsellinyl tại C-2. Đặc điểm này được củng cố nhờ tương quan HMBC của H-2 với
C-7'' (δC 171.9) và của H-1 với C-7' (δC 172.4).

Hình 3.15: Một số tương quan HMBC và NOESY của 48

Cấu hình tương đối của hai tâm bất đối xứng C-2 và C-3 được xác định là cấu hình
erythro dựa trên hằng số ghép J2,3 7.0 Hz giữa H-2 và H-3, tương tự với 43. Vì vậy, cấu trúc
của 48 được xác định như Hình 3.13, và được đặt tên là montagnetol D.

16


Hopan-6α,16α,22-triol (15)
Hợp chất 15 được cô lập dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng và công thức
phân tử được xác định là C30H52O3, dựa trên mũi ion phân tử giả tại m/z 483.3829 (tính toán
cho C30H52O3+Na, 483.3814). Phổ 1H NMR cho thấy sự hiện diện của tám nhóm methyl
mũi đơn tại  1.15 (s, H3-23), 1.01 (s, H3-24), 0.90 (s, H3-25), 1.04 (s, H3-26), 1.37 (s, H327), 1.11 (s, H3-28), 1.13 (s, H3-29), và 1.38 (s, H3-30), hai nhóm methine mang nhóm
hydroxyl tại  3.89 (td, J = 10.5, 4.0 Hz, H-6) và 4.64 (m, H-16). Phân tích của phổ

13

C

NMR và HSQC của 15 cho thấy sự hiện diện của 30 carbon, bao gồm một carbon tứ cấp tại

C 72.9 (C-22), hai nhóm methine mang oxygen tại C 69.8 (C-16) và 69.5 (C-6), năm
carbon tứ cấp khác, 5 nhóm methine, 9 nhóm methylene, và 8 nhóm methyl (Bảng 3.14).
Phổ 1H và 13C NMR của vòng A và B cho thấy sự tương đồng với dữ liệu của leucotylin
(16) hay zeorin (11). Nhóm methine H-5 (H 0.86, d, J = 11.0 Hz) cho tương tác spin-spin
1,3-nhị trục 1H-1H với nhóm methine mang oxygen (H 3.89, dt, J = 10.5, 4.0, H-6), từ đó
giúp suy ra nhóm hydroxyl tại C-6 ở định hướng α. Vị trí của nhóm oxymethine thứ hai H16 được xác định dựa trên phân tích phổ COSY và HMBC. Những tương quan HMBC quan
trọng của H-16 với C-14, C-15, và C-18; của H-17 với C-16, C-18, C-21, và C-28; và của
H-21 với C-17, C-18, C-20 và C-22, kết hợp với tương quan 1H-1H COSY của H-15/H16/H-17/H-21 giúp xác định nhóm hydroxyl tại C-16 (Hình 3.22). Sự so sánh dữ liệu phổ
của 15 và leucotylin cho thấy chúng rất tương đồng, ngoại trừ những tín hiệu trên vòng D và
E. Những khác biệt quan trọng là sự chuyển dời về vùng từ trường thấp của nhóm
oxymethine tại C-16 và hằng số ghép cặp của proton này. So sánh độ dịch chuyển hóa học
của H-16 của 15 với leucotylin cho thấy proton H-16 của 15 có thể ở vị trí xích đạo dựa trên
hiệu ứng bất đẳng hướng của cyclohexane (Eliel E. L. và Wilen S. H., 1994 [18], xem Hình
3.22). Phân tích sự ghép cặp của proton H-16 cho thấy sự hiện diện của các giá trị hằng số

ghép nhỏ J = 2.5 Hz và 4.0 Hz, tượng trưng cho các giá trị Jee và Jae giữa H-16 và H-17
cũng như giữa H-16 và H2-15. Cấu hình tương đối của 15 còn được xác định nhờ các tương
quan NOESY. Những tương quan NOESY quan trọng tại phía β của vòng của H-16 với Hβ15, H-17, và H3-29 và của H-21 với H-17, H3-29, và H3-30, củng cố sự lân cận trong không
gian giữa chúng (Hình 3.22). Vì vậy, 15 được xác định là hopane-6α,16α,22-triol, một hợp
chất hopane mới.
17


Hình 3.22: Một số tương quan COSY, HMBC và cấu trúc hoá lập thể của 15
3.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ĐỐI VỚI BỐN DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ
Thử hoạt tính gây độc trên bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung
(HeLa), ung thư phổi (NCI-H460) và ung thư gan (HepG2) theo phương pháp SRB trên 16
hợp chất cô lập được, trong đó có 8 hợp chất mới. Kết quả cho thấy các hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol

(13),

hopan-6α,16α,22-triol

(15),

parmosidone

C

(34),

parmoether B (32), montagnetol F (48) có hoạt tính gây độc với các dòng tế bào với phần
trăm ức chế I từ 6090%. Giá trị IC50 cũng được xác định đối với các hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol (13), montagnetol F (48), parmosidone D (35), và parmoether B
(32) (xem Bảng 3.18 và 3.19).
Bảng 3.18 : Phần trăm ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư của

các hợp chất cô lập
No.

Phần trăm ức chế (I %)b

Hợp chấta)
HeLac

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Acid orsellinic (5)
Acide gyrophoric (7)
Methyl lecanortạie (8)
2,4-Dihydroxyphtalide (9)
6α-Acetoxyhopan-16β,22-diol

(13)
Hopan-6α,16α,22-triol (15)
Leucotylin (16)
D-Montagenetol (43)
D-Erythrin (44)
Montagnetol A (51)
Montagnetol E (45)
Parmosidone A (38)
Parmosidone C (34)
Parmosidone D (35)
Parmoether A (33)
Parmoether B (32)
Camptothecin (positive control)c)

NCI-H460c
7.74±3.99
9.54±3.14
21.09±2.73
10.89±0.76

19.07±5.07
28.63±3.57
58.23.3

MCF-7c

HepG2c

12.13±0.99
-

-5.06±5.02
-

71.35±1.09

88.10±1.33

80.99±3.31

95.18±0.61
28.85±0.79
20.09±1.75
25.53±3.58
35.25±2.70
8.77 ± 0.31
19.66 ± 3.63
29.89 ± 0.95
50.67 ± 1.67
41.02 ± 6.99
85.51 ± 0.98
77.60.6

88.99±2.43
51.00±2.60
41.68±3.91
26.71±1.87
29.45±5.82
31.89±4.33
66.75±3.42

79.11±3.47
41.22.4

31.04±4.36
45.56±3.13
-7.18±2.24
3.57 ± 1.23
62.56±2.68
59.36±1.91
84.73±0.68
52.270.58

a) Nồng độ thử nghiệm của các hợp chất tại 100 μg/mL.
b) Dữ liệu được tính từ ba thử nghiệm ± S.D.
c) Camptothecin được sử dụng là chất chứng dương với nồng độ 0.01 μg/mL cho MCF-7 và NCI-H 460, 0.07 μg/mL
cho HepG2, và với 1 μg/mL cho HeLa.

18


Bản 3.19 : Giá trị IC50 (μg/mL) đối với 4 dòng tế bào của các hợp chất 13, 32, 35, và 48
No.

Hợp chấta)
HeLa

1
2
3
4

6α-Acetoxyhopan-16β,22-diol (13)
Montagnetol F (48)
Parmosidone D (35)
Parmoether B (32)

40.95 ± 0.50
-

Dòng tế bào
NCI-H460
MCF-7
77. 86 ± 5.61
47.08±2.64
44.85 ± 1.31
28.86±1.46
63.91±2.28
20.21 ± 1.30
12.37±2.00

HepG2
52.67±2.82
24.78±4.06

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Khảo sát hóa học của bốn loài địa y thu hái ở miền nam Việt Nam đã cô lập được 15
hợp chất mới và 34 hợp chất đã biết. Trong số 34 hợp chất đã biết, 9 hợp chất lần đầu tiên
được tìm thấy trong chi Parmotrema và 3 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong chi
Roccella. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ

nghiệm cũng như so sánh với dữ liệu trong tài liệu tham khảo.
 Hợp chất đơn vòng: 6 hợp chất đơn vòng được cô lập, bao gồm 1, 3, 4, 5, 9, và 10.
Hợp chất 10 lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Parmotrema.
 Depside: 5 depside được cô lập, bao gồm các hợp chất 2, 6-8, và 40. Hợp chất 40 lần
đầu tiên được tìm thấy trong chi Roccella.
 Depsidone: 6 depsidone được cô lập, bao gồm các hợp chấtt 29-31, 36-38 với 3 hợp
chất đã biết 29-30 và 36 và ba hợp chất mới 31, 37-38. Ba hợp chất mới chứa khung
meta-depsdione mới.
 Dẫn xuất của acid furfuric: 5 dẫn xuất acid furfuric được cô lập, bao gồm 25, 3235. Tất cả các hợp chất là hợp chất mới .
 Diphenyl ether: 3 hợp chất diphenyl ether được cô lập, bao gồm 21-23. Hai hợp
chất 22 và 23 được tìm thấy lần đầu tiên trong chi Parmotrema.
 Dẫn xuất erythritol: 9 dẫn xuất erythritol được cô lập từ địa y Roccella sinensis,
trong đó có ba hợp chất đã biết 42-44, và sáu hợp chất mới 41, 45-49. Các hợp chất
46 và 47 được đề nghị là chất giả tạo của 43 do quá trình cô lập đã sử dụng acetone
làm dung môi. Hợp chất 42 lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Roccella.
 Các steroid và triterpenoid: 8 sterol và triterpene được cô lập, hầu hết từ địa y
Parmotrema sancti-angelii. Hai sterol 17-18 thuộc khung sườn ergostane được tìm
19


thấy lần đầu tiên trong chi Parmotrema. Tát cả các triterpene 11-16 đều là dẫn xuất
của zeorin (11) sở hữu khung hopane, trong đó 15 là hợp chất mới. Ngoại trừ 11, các
hợp chất khác lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Parmotrema.
 Các hợp chất mang khung sƣờn khác: gồm có 1 hợp chất khung indole 39, các
alditol 24 và 26, các acid béo 20, 27, và 28, và 1 anthraquinone 19. Hợp chất 39 lần
đầu tiên được tìm thấy trong chi Roccella. Hai hợp chất alditol 24 và 26 lần đầu tiên
được tìm thấy trong chi Parmotrema.
Hợp chất đơn vòng

Depside

20


Depsidone

Dẫn xuất của acid furfuric

21


Diphenyl ether

Dẫn xuất của erythritol

22


Các sterol và triterpene

Các hợp chất khung sƣờn khác

4.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ĐỐI VỚI BỐN DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ
Mười sáu hợp chất được thử nghiệm hoạt tính gây độc trên bốn dòng tế bào ung thư
vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H460) và ung thư gan (HepG2)
theo phương pháp SRB. Kêt quả cho thấy các hợp chất 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13),
hopan-6α,16α,22-triol (15), parmosidone C (34), parmoether B (32), montagnetol F (48) có
hoạt tính gây độc với các dòng tế bào với phần trăm ức chế I từ 6090%. Giá trị IC50 cũng
được xác định đối với các hợp chất 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13), montagnetol F (48),
23