nghiên cứu điều kiện biểu hiện protein interleukin 3 người tái tổ hợp dung hợp với pelb trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MAI DUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN
INTERLEUKIN-3 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP DUNG HỢP VỚI
PELB TRONG ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MAI DUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN
INTERLEUKIN-3 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP DUNG HỢP VỚI
PELB TRONG ESCHERICHIA COLI

CHUYÊN NGÀNH:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS.TS. TRƯƠNG NAM HẢI
TS. NGUYỄN HỮU ĐỨC

HÀ NỘI, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất
kỳ một học vị nghiên cứu nào.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Mai Dung

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận

được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn
GS.TS Trương Nam Hải, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ
Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Hữu
Đức, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ Sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện và hoàn thành bản luận văn này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các Thầy Cô trong Ban Giám đốc Học
viện, Ban Quản lý đào tạo và Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi
trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện luận văn này.
Để thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn kịp thời và giúp
đỡ quý báu của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học,
đặc biệt là TS. Đỗ Thị Huyền, TS. Lê Thị Hồng, NCS. Nguyễn Thị Quý đã nhiệt tình
hướng dẫn, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện
đề tài. Đề tài này được thực hiện nhờ nguồn kinh phí của đề tài độc lập cấp nhà nước
“ Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao
dùng trong y học(điều trị)” giai đoạn 2012-2015 do Bộ Khoa học và Công nghệ
quản lý.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè và
đồng nghiệp, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn vừa qua.
Chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 06 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Mai Dung

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục hình

viii

MỞ ĐẦU

1

1

Đặt vấn đề

1

2

Mục tiêu của đề tài

2

2.1

Mục tiêu chung

2

2.2

Mục tiêu cụ thể

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1

Biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn

3

1.1.1

Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp

3

1.1.2

Hệ biểu hiện E. coli

4

1.1.3

Một số chủng biểu hiện gen thông thường của E. coli

6

1.1.4

Các vector biểu hiện của E. coli

6

1.1.5

Tín hiệu tiết protein

8

1.2

Tổng quan về Interleukin-3

9

1.2.1

Khái niệm

9

1.2.2

Đặc điểm, cấu trúc phân tử

10

1.2.3

Vai trò và ứng dụng của IL–3

11

1.3

Tình hình nghiên cứu Interleukin-3 trên thế giới và trong nước

13

1.3.1

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

13

1.3.2

Tình hình nghiên cứu trong nước

14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16

2.1

Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng

16

2.1.1

Vật liệu

16

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.1.2

Hóa chất

16

2.1.3

Enzyme

16

2.1.4

Các môi trường nuôi cấy và dung dịch

16

2.1.5

Máy móc và thiết bị

19

2.2

Nội dung nghiên cứu

19

2.2.1

Tách dòng gen il3 trong tế bào E. coli

19

2.2.2

Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen il3

19

2.2.3

Biểu hiện protein IL-3 trong tế bào E. coli JM109 và kiểm tra tính
kháng nguyên của IL-3 tái tổ hợp .

2.2.4

19

Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp của protein IL-3 từ chủng
E. coli tái tổ hợp quy mô bình tam giác

19

2.3

Phương pháp nghiên cứu

19

2.3.1

Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

19

2.3.2

Tách chiết ADN plasmid từ E. coli

20

2.3.3

Điện di ADN trên gel agarose

21

2.3.4

Kiểm tra gen trong ADN plasmid bằng enzyme hạn chế

22

2.3.5

Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng Kit thôi gel của Qiagen

22

2.3.6

Phản ứng nối gen ngoại lai vào ADN plasmid

23

2.3.7

Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp từ tế bào E. coli

24

2.3.8

Điện di protein trên gel SDS-PAGE

24

2.3.9

Phương pháp lai Western blotting

25

2.3.10 Khảo sát điều kiện biểu hiện protein IL-3 từ chủng E. coli tái tổ hợp

26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

28

3.1

Tách dòng gen il3 trong tế bào E. coli

28

3.1.1

Biến nạp ADN plasmid vào tế bào tách dòng

28

3.1.2

Cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme hạn chế

30

3.2

Thiết kế vector biểu hiện mang gen il3 cho hệ biểu hiện E. coli

31

3.2.1

Chuẩn bị gen cho việc thiết kế vector biểu hiện

31

3.2.2

Nối gen pelB-il3 vào vector biểu hiện pET22b(+)

32

3.2.3

Tách chiết ADN plasmid từ thể biến nạp

32

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


3.2.4

Kiểm tra gen il3 trong vector biểu hiện pET22b(+) bằng enzyme hạn
chế và đọc trình tự

33

3.3

Biểu hiện protein IL-3 từ tế bào E. coli JM109 (DE3)

35

3.4

Kiểm tra tính kháng nguyên của IL-3 tái tổ hợp bằng phản ứng lai
Western blot

3.5

37

Khảo sát một số điều kiện lên men ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein
IL-3 ở tế bào E. coli

39

3.5.1

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

39

3.5.2

Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG

42

3.5.3

Ảnh hưởng của nhiệt độ

44

3.5.4

Ảnh hưởng của pH môi trường

47

3.5.5

Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng

49

3.5.6

Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu

51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

55

1

KẾT LUẬN

55

2

KIẾN NGHỊ

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

56

PHỤ LỤC

60

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit deoxyribo nucleic

Amp

Ampicillin

Bp

Base pair

CSF

Colony-stimulating factor

E. coli

Escherichia coli

G-CSF

Granulocyte colony-stimulating factor

GM-CSF

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

IL-3

Interleukin-3

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

SDS-PAGE

SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên Bảng

Trang

2.1

Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE

18

3.1

Bảng giá trị OD600 khi thu mẫu của dòng biến nạp

36

3.2

Mật độ tế bào ở thời điểm thu mẫu của chủng E. coli biểu hiện IL-3 ở
các môi trường khác nhau

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

41

Page vii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Sơ đồ minh họa các bước tạo sản phẩm protein tái tổ hợp

1.2

Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3

10

3.1

Điện di đồ ADN plasmid tách chiết từ các thể biến nạp E. coli DH10B..

29

3.2

Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra ADN plasmid pUC57-pelB-il3 bằng

3

enzyme hạn chế.
3.3

30

Điện di đồ sản phẩm tinh sạch plasmid pET22b (+) và gen pelB-il3
sau khi xử lý bằng enzyme hạn chế

3.4

31

Phân tách sản phẩm tách chiết ADN plasmid pET22b-il3 trên gel
agarose 0,8%.

3.5

33

Điện di đồ sản phẩm cắt ADN plasmid bằng enzyme hạn chế NotI
và NdeI

34

3.6

Kết quả biểu hiện thử protein IL-3 từ dòng E. coli JM109 tái tổ hợp

36

3.7

Kết quả Western blot xác định protein tái tổ hợp IL-3 biểu hiện từ
dòng E. coli JM109 tái tổ hợp

37

3.8

Ảnh điện di protein tổng số biểu hiện IL-3 từ các môi trường khác nhau

40

3.9

Ảnh điện di protein tổng số biểu hiện từ môi trường LB và M9

42

3.10

Coomassie kiểm tra mức độ biểu hiện protein IL-3 ở các nồng độ chất
cảm ứng IPTG khác nhau

3.11

43

Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên khả năng sinh trưởng của chủng
biểu hiện IL-3

44

3.12

Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên mật độ tế bào ở thời điểm thu mẫu…

45

3.13

Ảnh điện di protein tổng số biểu hiện IL-3 ở các nhiệt độ khác nhau…..

46

3.14

Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng của chủng
sinh IL-3

48

3.15

Protein tổng số biểu hiện từ môi trường có các pH khác nhau

48

3.16

Protein tổng số biểu hiện các mẫu được cảm ứng ở mật độ tế bào
khác nhau.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

50

Page viii

3.17

Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng đến mật độ tế bào lúc thu mẫu

3.18

Protein tổng số biểu hiện từ các mẫu được thu ở các thời điểm

3.19

51

khác nhau.

52

Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến mật độ tế bào lúc thu mẫu

53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công
nghệ sinh học, ngành công nghiệp sinh phẩm với các sản phẩm có nguồn gốc vi
sinh vật sử dụng trong lĩnh vực y dược ngày càng được chú trọng. Số lượng các loại

protein tái tổ hợp tạo ra cho mục đích dược phẩm đã có sự tăng trưởng vượt bậc,
trong đó cytokine tái tổ hợp là một dạng sinh phẩm quan trọng đối với hệ miễn dịch.
Với bản chất là protein hoặc glycoprotein, Interleukin là một trong 4 nhóm
của cytokine (Interferon, Interleukin, nhân tố hoại tử ung thư, nhân tố sinh trưởng).
Tùy theo chức năng sinh học mà mỗi nhóm Interleukin có vai trò khác nhau trong
hệ miễn dịch và có thể được tạo ra từ các loại tế bào khác nhau. Trong số đó,
Interleukin 3 (IL-3) được xem là loại cytokine có phổ tác dụng rộng nhất trong hệ
tạo máu do nó có nhiều chức năng đối với cơ thể. Trong cơ thể, nguồn sản xuất IL-3
chính là tế bào lympho T đã hoạt hóa. IL-3, IL-7 và nhân tố kích thích cụm bạch
cầu hạt đơn nhân (GM-CSF granulocyte monocyte colony stimulating factor) tham
gia hoạt hóa quá trình tạo máu (Nguyễn Thanh Đạm, 2004).
Trên thế giới, nhiều loại Interleukin đã được nghiên cứu tạo ra theo con
đường tái tổ hợp và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh. IL-3 vẫn đang
được tiếp tục nghiên cứu lâm sàng để đánh giá tác dụng của nó. Nhiều công ty cung
cấp IL-3 người tái tổ hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu với giá thành tương đối
cao. Hầu hết các sản phẩm này đều được biểu hiện từ tế bào vi khuẩn E. coli.
Ở trong nước, bằng công nghệ gen tái tổ hợp, nhóm nghiên cứu thuộc Viện
Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo ra
được sinh phẩm Interleukin-2 (IL-2) tái tổ hợp có khả năng ứng dụng trong việc hỗ
trợ điều trị bệnh ung thư, tạo động lực cho việc nghiên cứu về các loại interleukin
khác, trong đó có interleukin-3.
Vi khuẩn E. coli với những ưu điểm như dễ nuôi cấy, thời gian sinh trưởng
nhanh, lượng protein tạo ra nhiều và dễ dàng xử lý để thu nhận protein mục tiêu làm
giảm thiểu rất nhiều chi phí sản xuất, thể hiện những tính năng vượt trội và là sự

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1

lựa chọn hàng đầu trong các nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp từ trước đến nay. Tuy
nhiên hệ biểu hiện E. coli cũng có những mặt hạn chế nhất định như protein ngoại
lai thường tích tụ ở dạng thể vùi làm giảm hoặc thậm chí không còn chức năng sinh
học, việc cắt methionine đầu N của protein đích không hiệu quả, khả năng tiết
protein bị hạn chế,…Mức độ biểu hiện của protein ngoại lai trong tế bào E. coli phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như đặc điểm của gen (hàm lượng GC, bộ ba mã hiếm,…),
tính chất của protein (trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện, số lượng cầu
disulfide,…), điều kiện biểu hiện (môi trường lên men, nhiệt độ, nồng độ chất cảm
ứng…). Do vậy bước đầu tiên trong việc nghiên cứu sản xuất protein IL-3 tái tổ hợp
là tạo được chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện tốt protein ngoại lai này,
tiếp theo là nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp để protein IL-3 biểu hiện ổn
định, sinh khối tế bào cao nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho bước tách chiết thu
protein IL-3 từ tế bào chủ cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Từ những lý do trên,
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện biểu hiện protein Interleukin-3
(IL-3) người tái tổ hợp dung hợp với PelB trong Escherichia coli ”
Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh
học. Đề tài có sử dụng trang thiết bị của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
gen tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mục tiêu của đề tài
2.1. Mục tiêu chung
- Biểu hiện được Interleukin-3 (IL-3) người tái tổ hợp từ tế bào E. coli.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Tạo được chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein IL-3.
- Xác định được một số điều kiện biểu hiện IL-3 thích hợp ở chủng chủ.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn
1.1.1. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp
Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các bước chính sau: Tách chiết và tinh
sạch ADN thuộc các nguồn khác nhau (gồm vector và ADN mong muốn); tạo ra các
phân tử ADN tái tổ hợp in vitro và đưa phân tử ADN tái tổ hợp này vào trong các tế
bào vật chủ, sau đó tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp (Hình 1.1).

Hình 1.1: Sơ đồ minh họa các bước tạo sản phẩm protein tái tổ hợp
(Nguồn: />Trong những năm gần đây, số lượng các loại protein tái tổ hợp tạo ra cho
mục đích làm dược phẩm đã có sự tăng trưởng vượt bậc, chiếm tới 65% thị phần.
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật di truyền, rất nhiều hệ biểu hiện protein đã được
phát hiện như tế bào vi khuẩn (E. coli, Bacillus subtilis), nấm men (Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris), nấm sợi, côn trùng và các tế bào động vật. Những hệ
biểu hiện này phù hợp cho từng loại gen tái tổ hợp khác nhau. Việc lựa chọn hệ biểu
hiện phụ thuộc vào đặc điểm của gen cần biểu hiện và mục đích sử dụng protein tái

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


tổ hợp. Ví dụ, những protein có kích thước nhỏ (dưới 200 axit amin) thường được
biểu hiện dễ dàng trong vi khuẩn E. coli dưới dạng protein dung hợp (fusion
protein). Một số protein là các phân tử tiết hoặc đóng vai trò là thụ thể bề mặt tế bào
(thường có kích thước lớn hơn 500 axit amin) thì được biểu hiện thành công nhất
trong tế bào động vật.
Trong số các hệ biểu hiện nêu trên thì vi khuẩn E. coli là hệ được sử dụng
phổ biến nhất để tạo ra các protein tái tổ hợp. Sự tổng hợp protein tái tổ hợp từ tế

bào E. coli phụ thuộc vào các plasmid đặc thù. Ngoài ra, đặc điểm của protein đích
như tính kị nước, số lượng cầu disulfide, khả năng tiết protein của E. coli cũng được
chú ý khi biểu hiện gen ngoại lai.
1.1.2. Hệ biểu hiện E. coli
E. coli là một vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que với kích thước bộ gen là
4,6 Mb (Blattner và Plunkett, 1997). E. coli được sử dụng phổ biến trong việc biểu
hiện các protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm như: thao tác đơn giản, có khả năng
sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trong các môi trường cơ chất không đắt
tiền (cứ 20-30 phút lại nhân đôi một lần), môi trường nuôi dưỡng đơn giản và điều
đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ
môi trường ngoài như plasmid, phage... (Yin và cs, 2007). Các yếu tố di truyền
này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế bào E. coli. Hơn nữa, đặc điểm di
truyền và sinh lý của E. coli đã được nghiên cứu đầy đủ qua nhiều năm. Vì vậy
trên thị trường đã thương mại nhiều loại vector và các chủng E. coli đột biến, trở
thành một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng và biểu hiện gen (Baneyx,
1999; Terpe, 2006).
Các nghiên cứu đã cho thấy hiệu suất tổng hợp nhiều loại protein ngoại lai
trong tế bào E. coli rất cao khi sử dụng các plasmid phù hợp. Các plasmid được
chọn thường chứa vùng promoter mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình
tổng hợp protein ngoại lai. Ngoài ra, các plasmid này phải có số lượng bản sao lớn
và tồn tại ổn định trong tế bào chủ. Tính bền vững của plasmid không những phụ
thuộc vào đặc tính di truyền của tế bào chủ, đặc tính sinh học của gen đích mà còn
phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy. Như vậy, với việc sử dụng các plasmid phù

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


hợp, nhiều protein quan trọng đã được tổng hợp trong E. coli một cách nhanh chóng

và thuận tiện.
Bên cạnh những thuận lợi đã nêu, hệ biểu hiện E. coli cũng có những hạn chế
nhất định. E. coli không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích
thước quá lớn hoặc quá nhỏ. Protein của sinh vật nhân chuẩn biểu hiện trong E. coli
không được cải biến chính xác do khả năng hạn chế trong việc hình thành các cầu
disulfide cũng như các cải biến hậu dịch mã khác như phosphoryl hóa, glycosyl
hóa,…hoặc kết hợp với lipid để tạo lipoprotein (Makrides, 1996).
Việc cắt methionine đầu N của protein đích không hiệu quả có thể dẫn đến
protein có tính ổn định thấp. Ngoài ra, các protein tái tổ hợp thường được biểu hiện
dưới dạng thể vùi (inclusion bodies) do việc tổng hợp protein một cách ồ ạt hay thiếu
các phân tử đặc hiệu chaperone giúp cuộn xoắn đúng cấu trúc (Yin và cs, 2007). Sự
hình thành thể vùi tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch, tuy nhiên protein sau
đó phải trải qua quá trình hồi tính để trở về dạng có hoạt tính sinh học.
Một nhược điểm nữa của hệ biểu hiện E. coli trong việc sản xuất các protein
trị liệu là sự tích lũy của các chất có khả năng gây sốt là thành phần
lipopolysaccharide (LPS), được biết đến là nội độc tố (endotoxin); nếu không có
quá trình loại bỏ sau khi tinh sạch sẽ gây ra phản ứng phụ cho người và các động
vật khi dùng bằng đường tiêm (Terpe, 2006). Ngoài ra, E. coli thiếu hệ thống tiết để
giải phóng hiệu quả protein tái tổ hợp ra khoang chu chất hoặc môi trường nuôi cấy
(Kingston và Brent, 2007). Thông thường, protein tìm thấy trong màng ngoài hoặc
không gian periplasmic được tổng hợp trong tế bào chất là protein non. Những
protein non này có chứa một chuỗi gồm 15-30 axit amin đặc biệt (tín hiệu trình tự),
cho phép các protein được xuất ra bên ngoài tế bào chất. Một số các chuỗi tín hiệu
đã được sử dụng cho sản xuất tiết hiệu quả của các protein tái tổ hợp trong E.
coli bao gồm PelB, OMPA, PhoA, endoxylanase, và StII. Trình tự tín hiệu này là
những axit amin kỵ nước (chẳng hạn như alanine, valine và leucine), một điều cần
thiết cho tính năng tiết ra các protein vào khoang chu chất của E.
coli (Pugsley, 1993). Trong quá trình vận chuyển protein ra khỏi tế bào chất, các tín
hiệu trình tự được cắt bởi peptidase để tạo ra protein trưởng thành. Các vị trí cắt
thường là ít kỵ nước và chứa điểm nhận biết của enzyme peptidase (Pugsley, 1993).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


1.1.3. Một số chủng biểu hiện gen thông thường của E. coli
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chủng E. coli với những cải biến
khác nhau để phù hợp với gen đích và khắc phục được những hạn chế trong quá
trình tách dòng và biểu hiện gen. Một trong những chủng E. coli thường được sử
dụng cho mục đích tách dòng gen là E. coli DH10B do có hiệu suất biến nạp cao,
khả năng duy trì và ổn định các plasmid có kích thước lớn, giúp tạo ra được một
lượng lớn các plasmid ổn định và tương đối tinh sạch.
Chủng vi khuẩn E. coli JM109 (DE3), có nguồn gốc từ chủng K với hai đột
biến là recA1 và endA1, đồng thời có một bản copy gen mã hóa cho T7 RNA
polymerase. Chủng JM109 (DE3) được dùng để biểu hiện ở mức độ cao các gen nối
vào vector xuôi chiều từ T7 promoter và nó chứa gen cảm ứng bởi IPTG để tổng
hợp T7 RNA polymerase. Với hai đột biến trên, chủng E. coli JM109 giúp ngăn
chặn việc đào thải các plasmid ngoại lai, từ đó tăng cường khả năng biểu hiện nhiều
loại protein tái tổ hợp khác nhau.
Chủng E. coli BL21 và BL21(DE3) là các chủng biểu hiện được Studier và
đồng nghiệp phát triển. Đó là chủng B xuất phát từ chủng B834.
Chủng vi khuẩn E. coli Soluble có nguồn gốc từ chủng chủ BL21 giúp cải
thiện đáng kể tính tan của protein được biểu hiện. Ngoài ra, nếu như protein đích
có chứa lượng lớn các codon hiếm, chủng E. coli được lựa chọn sẽ đồng biểu
hiện tARN cho những codon hiếm, đó chính là chủng E. coli Rossetta. Chủng
này có nguồn gốc từ chủng BL21 lac ZY. Đây là một dẫn xuất BL21 được thiết kế
để tăng cường sự biểu hiện của protein eukaryote có chứa codon hiếm khi được sử
dụng trong E. coli, có chứa gen kháng Chloramphenycol. Chủng vi khuẩn E. coli
Origami 2 là chủng có nguồn gốc từ K-12 đã bị đột biến ở gen thioredoxin

reductase (trxB) và gen glutathione reductase (gor), làm tăng đáng kể sự tạo thành
cầu disulfide do môi trường tế bào chất oxy hóa của E. coli. Chủng Origami 2 là
chủng nhạy cảm với kanamycin. Để làm giảm khả năng hình thành cầu disulfide
giữa các phân tử, chủng chứa đột biến ở gen trxB và gor được khuyến cáo chỉ dùng
trong trường hợp biểu hiện protein đòi hỏi sự hình thành chính xác cầu disulfide.
1.1.4. Các vector biểu hiện của E. coli
Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mARN của
chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai.
Vector có thể là ADN plasmid, phage hay cosmid. Đây là những phân tử ADN có
khả năng nhân đôi, phiên mã, dịch mã độc lập với ADN của vật chủ. Ngoài ra,
vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng dùng làm dấu hiệu chọn
lọc. Gen thường được sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh. Gen
này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang ADN plasmid.
Như vậy, vector biểu hiện hoàn chỉnh phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) là vị trí gắn của ADN polymeraza, quyết
định số lượng bản sao trong vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker), thường là các
gen kháng chất kháng sinh, để đảm bảo duy trì sự tồn tại của vector trong tế bào vi
khuẩn đồng thời giúp chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid.
- Promoter kiểm soát phiên mã (như lac, trp hoặc tac) để nhận biết tín hiệu
khởi đầu phiên mã; từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được
nhân dòng sau khi được cảm ứng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như điểm ribosome được bố trí thích hợp và

codon khởi đầu ATG.
- Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt của một số enzyme hạn
chế thuận tiện cho việc đưa gen ngoại lai vào vector.
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà chúng ta có thể thiết kế thêm một số
vùng khác nữa như vùng mã hóa cho đoạn peptide tín hiệu, vùng mã hóa cho đuôi
His-Tag,… Một trong những vector biểu hiện được Studier và Moffatt phát triển
vào năm 1986 chính là vector biểu hiện pET. Ngày nay, vector pET được sử dụng
rộng rãi trong việc biểu hiện protein trong E. coli bởi khả năng sản xuất protein
hàng loạt, các thao tác sinh học phân tử dễ dàng và các đặc tính dựa trên promoter
mạnh và có tính đặc hiệu cao là promoter T7 (Novagen, 2002-2003).
Cũng như các plasmid khác, pET có chứa những thành phần không thể thiếu
của một vector biểu hiện bao gồm: vùng khởi đầu sao chép (ori); gen lacI mã hóa
protein ức chế lac; promoter T7 chỉ đặc hiệu với enzyme T7 ARN polymeraza; lacO

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


giúp điều hòa quá trình phiên mã; vùng đa nối; gen kháng kháng sinh ampicillin để
chọn lọc. Ngoài ra hệ vector này có những ưu điểm vượt trội hơn so với các hệ
vector biểu hiện khác đó là: gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7 – là
promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao; protein có thể được tiết vào khoang chu
chất của tế bào, thuận lợi cho bước tinh sạch ban đầu vì trên vector đã thiết kế sẵn
gen mã hóa peptide tín hiệu ngay đầu N của protein; quá trình phiên mã được điều
hòa bởi lac Operator có cơ chế cảm ứng đơn giản nhưng hiệu quả. Một trong những
vector pET thường được sử dụng là vector pET 22b(+) chứa tín hiệu tiết pelB có độ
dài 22 axit amin, có vai trò hướng protein vừa được tổng hợp tới màng. Sau khi
protein ra khỏi màng thì peptide tín hiệu bị cắt bởi enzyme peptidase của màng
trong ở một vị trí xác định.

1.1.5. Tín hiệu tiết protein
Việc tổng hợp protein tái tổ hợp ồ ạt trong E. coli có thể dẫn đến sự cuộn
xoắn không chính xác của protein, hình thành nên các dạng không tan hay còn gọi
là thể vùi (inclusion bodies) (Betts và King, 1999; Villaverde và Carrío, 2003). Mặc
dù sự tạo thành thể vùi giúp cho việc tinh sạch protein đơn giản hơn, nhưng việc hồi
tính tái cấu trúc in vitro để đảm bảo chức năng sinh học chưa hiệu quả. Năng suất
sau khi hồi tính thường chỉ đạt 10-50% so với lượng protein tạo ra (Villaverde và
Carrío, 2003). Để hạn chế protein biểu hiện ở dạng thể vùi, người ta thường dùng
một trong các cách như biểu hiện đồng thời với chaperone, dung hợp gen với các
yếu tố hòa tan, biểu hiện ở nhiệt độ thấp và định hướng chuyển protein đến khoang
chu chất của vi khuẩn (Makrides, 1996; Schumann và Ferreira, 2004; Terpe, 2006).
Việc định hướng chuyển protein tái tổ hợp ra khoang chu chất của vi khuẩn
nhờ các tín hiệu tiết là một phương pháp thường được sử dụng để ngăn chặn sự hình
thành thể vùi, đồng thời giảm sự phân cắt protein đích bởi các proteaza nội bào.
Nguyên nhân do khoang chu chất là môi trường oxy hóa mạnh, chứa các enzyme
xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, hơn nữa lại chứa ít proteaza
hơn so với tế bào chất (Gottesman, 1996); do đó làm tăng hoạt tính sinh học, tính ổn
định và tính tan của protein đích khi được định hướng tới đây. Ngoài ra, tế bào E.
coli có một ưu điểm là không tiết hoặc tiết rất ít protein nội bào ra ngoài, vì vậy hạn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


chế được khả năng protein tái tổ hợp bị lẫn với các protein của vi khuẩn (Nguyễn
Thị Quý và cs, 2013).
Hiện nay, để định hướng protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất thì phương
pháp phổ biến là thiết kế một trình tự tín hiệu dẫn đường phù hợp vào một đầu của
gen đích và tối ưu hóa mức độ dịch mã. Rất nhiều các trình tự tín hiệu có nguồn gốc

từ các protein tiết tự nhiên như OmpA, OmpT, β-lactamase, alkaline phosphatase và
PelB đã được sử dụng để đưa protein đích đến khoang chu chất của E. coli (Nguyễn
Thị Quý và cs, 2013). Trong số các tín hiệu tiết đó thì PelB được sử dụng phổ biến
hơn cả trong việc biểu hiện các protein tái tổ hợp dùng trong trị liệu. Tín hiệu tiết
PelB có nguồn gốc từ enzyme pectate lyase B của vi khuẩn Erwinia carotovora.
Trình tự này bao gồm 22 axit amin, được gắn vào đầu N của protein đích. Chúng sẽ
định hướng chuyển protein tới màng tế bào chất, sau đó bị cắt bởi enzyme peptidaza
của màng trong, phần protein còn lại có hoạt tính nằm ở khoang chu chất của tế bào.
Tuy nhiên, trong một vài trường hợp, các protein này không di chuyển ra khoang chu
chất của tế bào, bị “ách” và tồn tại bên trong tế bào chất dưới dạng các thể vùi không
hoạt tính hay hoạt tính bị suy giảm (Baneyx F, 1999). Vì vậy mà các nhà nghiên cứu
phải thay đổi điều kiện biểu hiện phù hợp hoặc tiến hành hồi tính protein từ các khâu
tinh chế để thu được lượng lớn protein mục tiêu có hoạt tính sinh học.
1.2. Tổng quan về Interleukin-3
1.2.1. Khái niệm
Thuật ngữ interleukin-3 (IL-3) lần đầu tiên được đề xuất bởi Ihle và các cộng
sự vào năm 1981 và tiếp đó, interleukin-3 được nhân dòng vào năm 1986 (Williams
và cs, 1990). Đây là một glycoprotein liên quan đến sự tồn tại và tự làm mới của các
tế bào gốc tạo máu; sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào tiền thân và hoạt hóa
chức năng của bạch cầu trưởng thành (Niemeyer và cs, 1989).
Trong cơ thể, nguồn sản xuất IL-3 chính là tế bào lympho T đã hoạt hóa và tế
bào NK (Natural Killing cells). Tế bào mast và bạch cầu ưa axit (eosinophil) cũng có
thể tiết ra IL-3 khi được kích thích và hoạt hóa (Jamur và Oliver, 2011). Sản phẩm IL-3
tạo ra theo con đường tế bào mast có ý nghĩa quan trọng với quá trình biệt hóa dòng tế
bào tua (Rissoan và cs, 1999). Ngoài ra, IL-3 còn được tìm thấy ở bạch cầu đơn nhân,
các tế bào biểu mô và các tế bào keratin biểu bì (Dalloul và cs, 1991).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9

1.2.2. Đặc điểm, cấu trúc phân tử
Gen mã hóa cho protein IL-3 người (hIL-3) được định vị trên nhiễm sắc thể số
5, tại vị trí 5q23-q31. Trên nhiễm sắc thể số 5, ngoài IL-3 còn các gen mã hóa cho
các yếu tố tăng trưởng tạo máu khác như GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-9, tiểu đơn vị p40
của IL-12 và IL-13 (Yang và cs, 1986). Gen mã hóa IL-3 gồm 456 nucleotit, mã hóa
chuỗi polypeptide gồm 152 axit amin với một chuỗi peptide tín hiệu kị nước gồm
19 axit amin. Khối lượng phân tử của IL-3 sau khi cắt bỏ peptide tín hiệu ước tính
khoảng 15,2 kDa (Yang và cs, 1986). Đầu N của gen il3 được bắt đầu bằng
dipeptide Ala-Pro (vị trí 20-21), thường được tìm thấy tại đầu N của rất nhiều
cytokine khác (Schrader và cs, 1986). Đầu 3’ không mã hóa chứa các trình tự
ATTTA lặp lại, chúng có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát tính ổn định của
mARN (Shaw và Kamen, 1986). Sau quá trình phiên mã, tiền thân của IL-3 (152
axit amin) được hình thành từ 5 đoạn exon với kích thước axit amin tương ứng là
54, 14, 30, 14 và 40. Tiếp theo là quá trình biến đổi sau dịch mã để loại bỏ đoạn
peptide tín hiệu (19 axit amin) để trở thành protein IL-3 có hoạt tính bao gồm 133
axit amin với hai vùng asparagines bảo tồn (Schrader và cs, 1986).

Hình 1.2: Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3
(Lindemann và Mertelsmann, 1993)
Về cấu trúc, protein IL-3 bao gồm 4 xoắn α A,B,C, D (Hình 1.2), có hai vị trí
glycosyl hóa (vị trí 15 và 70) và một cầu nối lưu huỳnh giữa axit amin Cys16 và
Cys84 (Niemeyer và cs, 1989). Các vị trí axit amin như Ser17, Asn18, Asp21, Thr25

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10

trên chuỗi xoắn A và Arg108, Phe113, Lys116, Glu119 trên chuỗi D đóng vai trò
không thể thiếu trong quá trình gắn kết giữa IL-3 với thụ thể của nó trên bề mặt tế
bào đích. Đặc biệt, nếu thay thế vị trí Glu22, hoạt tính của IL-3 có thể bị mất hoàn
toàn (Klein và cs, 1997). Ngoài ra, dạng IL-3 tự nhiên cũng có sự khác biệt so với
IL-3 tổng hợp bởi sự đa dạng về thành phần chuỗi cacbonhydrat gắn kết vào trong
quá trình hình thành cấu trúc glycosyl hóa. Do đó, kích thước tự nhiên của IL-3
tiết ra bởi tế bào T hoạt hóa có thể thay đổi từ 22, 28 hay 36 kDa (Ziltener và cs,
1994). Tuy nhiên, các phân tích trên IL-3 người tái tổ hợp cho thấy cấu trúc
glycosyl hóa không làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein IL-3. Đây là
một ưu điểm để có thể tiến hành biểu hiện protein này dưới dạng tái tổ hợp trong
tế bào E. coli vì ở E. coli không có quá trình biến đổi sau dịch mã như glycosyl
hóa, acetyl hóa,.. Thụ thể của IL-3 là một heterodimer bao gồm một chuỗi IL-3α
đặc hiệu và hai tiểu đơn vị ßc. Tiểu đơn vị ßc không bám trực tiếp với IL-3 mà hình
thành một thụ thể ái lực cao với IL-3α (Stomski và cs, 1996). Đồng thời, thụ thể ái
lực cao ßc cũng tồn tại trên thụ thể của IL-5 và trên yếu tố kích thích dòng bạch cầu
hạt-đại thực bào (GM-CSF) (Stomski và cs, 1996). IL-3 người là một protein kẽm
bao gồm hai chuỗi axit amin đồng thuận tại Glutamate 22- histidine 26 và histidine
95-histidine 98, là đặc trưng cho liên kết các protein kẽm (Smit V và cs, 1992).
1.2.3. Vai trò và ứng dụng của IL–3
IL-3 là một yếu tố tăng trưởng được thiết lập trong mối liên hệ giữa hệ
miễn dịch và hệ tạo máu. Trong cơ thể, IL-3 đóng vai trò quan trọng trong quá
trình tăng sinh và phát triển của hầu hết tế bào tiền thân tạo máu. Từ đó, IL-3
cũng hỗ trợ cảm ứng sự tăng trưởng và hoạt hóa chức năng của các tế bào trưởng
thành như các tế bào nhân khổng lồ (megakaryocyte), tế bào mast, bạch cầu ưa
kiềm và bạch cầu ưa axit, ngoài ra IL-3 còn liên quan đến sự phát triển của tế bào
B (Morris và cs, 1990).
Trong cơ thể, IL-3 kích thích sự phát triển vô tính của các tế bào nền không
tạo máu trong tủy xương. IL-3 là một trong những yếu tố mồi cho các tế bào gốc tạo
máu cả in vitro và in vivo, giúp các tế bào đáp ứng được với các yếu tố hoạt hóa sau
như Epo, GM-CSF và IL-6. IL-3 cũng cảm ứng sự biểu hiện tăng cường các thụ thể

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


của các yếu tố kích thích dòng khác (CSF). Tại nồng độ rất nhỏ, khoảng vài nano-mol,
IL-3 là một “chất hấp dẫn hóa học” (chemo-attractant) với bạch cầu ưa axit và cũng
ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào này trong việc đáp ứng với các yếu tố hoạt động.
IL-3 làm tăng đáng kể sự tiết các cytokine khác như IL-1, IL-6 và TNF cũng như sự
tăng sinh của các tế bào sừng. IL-3 cũng đặc biệt cảm ứng sự tạo thành của các enzyme
liên quan đến quá trình trao đổi chất của tế bào, biệt hóa và chuyển hóa ADN.
Ngoài ra, IL-3 còn tăng cường chức năng của các tế bào dòng tủy như thực
bào, khả năng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (antibody - dependent cellular
cytotoxicity - ADCC), trao đổi chất của bạch cầu ưa axit cũng như khả năng gây
độc của bạch cầu đơn nhân (Kurimoto và cs, 1989).
Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của IL-3 trong các bệnh dị ứng. Phản ứng
dị ứng có thể chia thành hai giai đoạn và đều dưới sự điều khiển của cytokine được
tạo ra bởi tế bào lympho T. Giai đoạn đầu tiên là một phản ứng tức thì, histamine và
các chất trung gian khác được giải phóng từ tế bào mast thông qua thụ thể IgE
(Plaut và Lichtenstein, 1983). Giai đoạn thứ hai, gồm các phản ứng xảy ra sau 5-8
tiếng, đặc trưng bởi sự xuất hiện của bạch cầu ưa axit (Gleich, 1990). IL-3 được tạo
ra ngay sau khi các phản ứng dị ứng xuất hiện, trực tiếp giải phóng histamine từ
bạch cầu ưa kiềm của các đối tượng bị dị ứng (Sugiyama và cs, 1993). Hoạt động
giải phóng histamine trực tiếp này của IL-3 phụ thuộc vào sự hiện diện của tập hợp
IgE, chúng hỗ trợ việc giải phóng các yếu tố giải phóng histamine (MacDonald và cs,
1989). Ảnh hưởng của IL-3 còn được tăng cường bằng cách kết hợp với các thành
phần bổ sung như C3a, C5a, IL-8 (Kurimoto Y và cs, 1989).
Trong suốt giai đoạn hai của phản ứng viêm dị ứng, bạch cầu ưa axit di
chuyển đến các vị trí viêm dị ứng, đồng thời chúng trở nên hoạt hóa và giải phóng

ra các anion oxy hóa, yếu tố kích hoạt tiểu cầu (platelet-activating factor - PAF), và
một số enzyme như peroxidaza, chất độc thần kinh,… có vai trò phá hủy các chất
gây dị ứng. Vai trò của IL-3 trong giai đoạn này là thu hút bạch cầu ưa axit theo
dòng máu đến các mô bị dị ứng đồng thời tăng cường phá hủy các chất gây dị
ứng (Kurimoto Y và cs, 1989).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


1.3. Tình hình nghiên cứu Interleukin-3 trên thế giới và trong nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Để tạo ra IL-3 người tái tổ hợp (rhIL-3), nhiều cơ quan cũng như các công ty
sinh học đã tiến hành nghiên cứu và phát triển sản phẩm. Vì IL-3 không ở dạng
glycosyl hóa vẫn mang hoạt tính sinh học nên sáng chế 5128450 đã đề xuất biểu
hiện IL-3 dưới dạng không glycosyl hóa trong tế bào nấm men S. cereviciae (Urdal
và Sassenfeld, 1992). Trình tự biểu hiện không phải là hoàn toàn 133 axit amin
giống như trình tự gốc của IL-3 mà có sự loại bỏ một số axit amin ở đầu N và thay
thế một số axit amin khác [Met3 rhuIL-3 (Pro8 Asp15 Asp70), Thr4 rhuIL-3 (Pro8
Asp15 Asp70), Thr6 rhuIL-3 (Pro8 Asp15 Asp70)]. Sáng chế 5817486 và 6132991 cũng
công bố trình tự axit amin cho sản phẩm rhIL-3 không cần phải biểu hiện hoàn toàn
133 axit amin. Các axit amin ở vị trí từ 1 đến 14 ở đầu N và 15 vị trí khác ở đầu C
(từ 119 đến 133) hoàn toàn có thể loại bỏ khi tiến hành tạo sản phẩm rhIL-3 trong
hệ tế bào vi khuẩn mà vẫn giữ nguyên, thậm chí còn tăng hơn về mặt hoạt tính sinh
học khi so sánh với sản phẩm được giữ nguyên trình tự axit amin gốc (Bauer và cs,
2000). Hơn nữa, để nhằm loại bỏ hoàn toàn sự bắt cặp sai của cầu nối lưu huỳnh,
các Cystein tại vị trí 16 và 84 đều có thể thay đổi thành alanin mà vẫn giữ nguyên
được hoạt tính sinh học vốn có (Dorssers và Leen, 2002). Tuy nhiên, sáng chế
6384194B1 lại tiến hành tạo sản phẩm với trình tự axit amin đầy đủ cho phân tử IL3 hoàn chỉnh với hệ biểu hiện gồm cả tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào động

vật. Sáng chế này còn đề cập đến các phương pháp để tinh chế được sản phẩm IL-3
tái tổ hợp từ các dòng tế bào biểu hiện khác nhau trên. Quá trình tinh chế tập trung
vào một số phương pháp tinh chế chính như tinh chế trên hệ thống FPLC và HPLC
với các cột trao đổi ion, tương tác kỵ nước hay sắc ký đảo pha. Các sản phẩm IL-3
tinh chế đều mang hoạt tính sinh học (Dorssers và cs, 2002).
Hiện nay, trên thị trường cũng có nhiều công ty cung cấp sản phẩm rhIL-3 sử
dụng cho mục đích nghiên cứu. Hầu hết các sản phẩm này đều được biểu hiện trong tế
bào vi khuẩn E. coli như: hãng Invitrogen (691 USD/100 µg), hãng CST (585
USD/50 µg), hãng Prospec (130 UDS/10 µg), hãng Sigma-Aldrich có cả IL-3 được
tạo từ tế bào E. coli (204 USD/ 10 µg) và tế bào động vật HEK (264 USD/ 10 µ g),….

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Kể từ khi IL-3 người được nhân dòng lần đầu tiên vào năm 1986, vai trò của
IL-3 đã được nghiên cứu và tiến hành các thử nghiệm lâm sàng. IL-3 được xem là
loại cytokine có phổ tác dụng rộng nhất trong hệ thống tạo máu. Tính chất hay hoạt
tính của IL-3 được gắn liền với nhiều tên như yếu tố kích thích tế bào bền vững
(Persisting cell – stimulating factor), yếu tố kích thích tế bào tạo histamine, yếu tố
kích thích các dòng bạch cầu (multi-CSF), yếu tố sinh trưởng tạo máu đa dòng
(multilineage hemopoietic growth factor), yếu tố kích ứng Thy-1, hoạt tính kích
thích CFU, CSF-2α, CSF-2β, yếu tố phát triển dòng tế bào mast, eosinophil–CSF,
megakaryocyte–CSF, erythoid-CSF, hoạt tính tăng cường bùng nổ (burst-promoting
activity), neutrophil granulocyte-CSF, hoạt tính hiệp đồng (synergistic activity) (Lin
và Leonard, 2003). Với vai trò như vậy, hiện nay, IL-3 được nghiên cứu biểu hiện
trên nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào động vật có vú, nấm men, B.
licheniformis và E. coli.
Các kết quả nghiên cứu thu được trong điều trị lâm sàng cho thấy IL-3 thúc

đẩy sự phục hồi của tủy xương sau khi ghép tủy xương hoặc phục hồi suy tủy thứ
phát do hóa chất, kích thích sự gia tăng của tiểu cầu (Schrader, 2003). Các thử
nghiệm lâm sàng trên động vật và người cho thấy IL-3 kết hợp với G-CSF hoặc
GM-CSF có thể kích thích mạnh mẽ khả năng tạo tế bào tủy xương, ứng dụng trong
điều trị bệnh thiếu máu bất sản hoặc là các bệnh thiếu máu khác. Bên cạnh đó, cũng
có nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành nhằm áp dụng IL-3 để điều trị các
bệnh khác như để kiềm chế một số bệnh nhiễm trùng (Korenaga và cs, 1996), sử
dụng để nâng cao hiệu quả tác động cho tế bào trình diện kháng nguyên trong
điều trị ung thư (De Wilt và cs, 2001), kiểm soát các bệnh hen phế quản và dị ứng
(Schroeder và cs, 2009). và gần đây nhất là ở nhiễm trùng huyết (Georg F.Weber,
Benjamin G.Chousteman và cs, 2015).
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện nay trong nước đã có một số công ty như công ty vắc xin và sinh phẩm
số 1, công ty vắc xin và sinh phẩm Nha Trang (BioPharco), công ty Nanogen đã sản
xuất thành công một số dược phẩm có nguồn gốc từ protein tái tổ hợp như interferon
alpha 2a, interferon alpha 2b, interferon gamma 1b, reteplase, Filgrastim, insulin,…

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14