Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 4

Phần 4
Kết quả và thảo luận

4.1.Sản phẩm DNA li trích
Li trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành
công cho phản ứng PCR sau này. Đối với lá cacao, việc li trích gặp một số khó khăn
do lá cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh, bên trong mô lá chứa hàm lượng
lớn polysaccharide, polyphenol và các sắc tố khác. (Hoàng Thị Liễu, 2004).
Qui trình li trích DNA của chúng tôi đạt hiệu quả vì DNA li trích có độ tinh
khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Vì ở qui trình li trích này, trong dịch trích DNA
có chất mercapto có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bước ủ Rnase sẽ phân
hủy RNA có trong mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA
trong phản ứng PCR sau này. Đặc biệt sự có mặt của muối sodium acetate có khả
năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bước sử dụng Chloroform
được lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide
có trong mẫu. Do đó, DNA thu được rất tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra
Kết quả định lượng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu đem
li trích có độ tinh sạch tương đối cao với tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
nằm trong khoảng 1.5
đến 2.2 và lượng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl.
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA
 Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh sạch không cao, chúng tôi vẫn có thể
chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý như sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi
50
li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4
o
C để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ
nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường

hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì
2µl) và giảm thể tích nước đi 2µl.
Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li
trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ
thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống.

4.2.Sản phẩm PCR
Qui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer. Tuy nhiên primer
mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các
primer khác. Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA
lên gấp đôi.
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7
Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định. Những mẫu có nồng độ DNA li
trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng, rõ.
Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi.
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR
51
4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao
Sản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà
không cần phải qua bước tinh sạch. Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch và
không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau. Do đó sản phẩm PCR không cần phải
tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém.
Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất phân
tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm PCR riêng
biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi formamide như với 1
sản phẩm. Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho kết quả phân tích tốt.
Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di hoặc
band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự DNA
bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp mang điện
di.

Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No
data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong phản
ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl). Do đó chúng tôi thu được kết quả phân tích của
tất cả các mẫu với 5 primer.
Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở 2
bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping (xem
trang 54). Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân biệt được
21 kiểu gen khác nhau.
Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị hợp
(VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp (VD:
al 288- al 288).
Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng cacao
khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được bảng dữ
liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và phân tích đa
dạng di truyền.
52
Bảng 4.1: Dữ liệu microsatellite thu được với 3 primer
Thứ tự Tên dòng
mTcCIR 8 mTcCIR 11 mTcCIR 15
A1 A2 A1 A2 A1 A2
1 BAL 209 288 290 298 305 252 254
2 BAL 244 292 292 295 314 244 246
3 BR 25 302 305 298 308 235 244
4 KKM 225 286 286 295 298 235 244
5 PBC 123 288 290 295 305 235 250
6 PBC 154 288 305 298 305 232 252
7 PBC 157 288 302 295 305 235 250
8 PBC 159 288 302 298 305 235 244
9 PBC 230 286 288 305 314 235 250
10 PBC 236 290 290 298 305 235 250

11 QH 1213 288 290 295 298 252 254
12 QH 22 288 302 295 298 232 252
13 QH 441 288 288 295 295 232 252
14 CT1 288 288 141 314 248 250
15 CT3 288 290 141 305 244 248
16 CT4 269 269 150 150 242 252
17 CT5 288 294 305 314 244 248
18 CT6 288 288 288 314 252 252
19 CT7 286 294 141 314 248 250
20 CT8 288 288 288 288 248 250
21 CT9 286 286 150 314 248 250
Bảng 4.2: Dữ liệu microsatellite thu được với 2 primer
Thứ tự Tên dòng
mTcCIR 7 mTcCIR 18
A1 A2 A1 A2
1 BAL 209 155 157 344 346
2 BAL 244 157 157 337 344
3 BR 25 153 155 331 344
4 KKM 225 153 155 331 346
5 PBC 123 155 157 331 342
6 PBC 154 153 157 342 344
7 PBC 157 155 157 331 346
8 PBC 159 155 157 331 346
9 PBC 230 155 157 331 342
10 PBC 236 153 157 342 344
11 QH 1213 153 157 344 346
12 QH 22 153 157 342 344
13 QH 441 157 157 342 344
14 CT1 153 153 335 344
15 CT3 153 157 333 344

16 CT4 153 157 333 335
17 CT5 153 157 333 335
18 CT6 155 157 344 344
19 CT7 153 153 342 342
20 CT8 153 153 342 342
21 CT9 153 153 335 342
53
 Allele dropping
Allele dropping là những al chỉ xuất hiện 1 lần trong 3 lần lặp lại thí nghiệm. Đó
là những al xuất hiện không ổn định, có thể do nồng độ mẫu quá thấp, hoặc bị tạp nhiễm
với 1 kiểu gen khác trong quá trình thí nghiệm, hoặc do việc thêm vào một nucleotid
adenosine (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA khuếch đại (Smith et al., 1996), hoặc do lỗi
phân tích của máy ABI 3100. Những al đó cần được ghi nhận để loại bỏ trong những lần
phân tích sau.
Trong quá trình thí nghiệm, một số mẫu được lặp lại 2-3 lần với cùng một primer
để tìm nồng độ pha loãng thích hợp và để định danh lại mẫu mã hóa. Từ đó, chúng tôi
ghi nhận được sự xuất hiện allel dropping của một số dòng như sau:
 Dòng PBC 159 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 246.
 Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15:al 244.
 Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331.
 Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331.
Có 6 mẫu dưới đây chỉ mới lặp lại thí nghiệm 2 lần, do đó cần lặp lại thí nghiệm
một lần nữa để khẳng định allele dropping, bao gồm:
 Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 295.
 Dòng PBC 123 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244.
 Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244.
 Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 298
 Dòng BAL 244 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 150.
 Dòng QH 1213 có 2 allele dropping với primer mTcCIR15: al 235, al 244.

Al dropping 246
54