Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát

MỞ ĐẦU
Ung thư gan là một trong năm dạng ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng
hàng thứ ba về nguyên nhân gây chết do ung thư trên toàn cầu. Cơ hội sống sót của
bệnh nhân mắc ung thư gan là rất thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt ở một số
nơi tỷ lệ này chỉ là 17% sau 1 đến 3 năm được chẩn đoán mắc bệnh [31]. Hàng năm
có khoảng 600.000 người được chẩn đoán mắc ung thư gan và gần bằng con số đó
là số lượng người đã chết vì nó mỗi năm . Từ những con số trên cho thấy một thực
tế rằng việc chẩn đoán và điều trị ung thư gan trên thế giới hiện nay gặp rất nhiều
khó khăn.
Proteomics là công cụ số một trong phân tích hệ protein của cơ thể sinh vật.
Kỹ thuật proteomics đã được áp dụng cho các nghiên cứu chỉ thị sinh học của các
bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư thanh
quản, ung thư vòm họng, ung thư gan, ung thư máu... Việc nghiên cứu bằng kỹ
thuật proteomics đang ngày càng được mở rộng, đem lại kết quả ngày càng lớn ứng
dụng trong sinh học, y học, dược học và nghiên cứu cơ chế của các quá trình sinh
học .
Ung thư gan nguyên phát là dạng ung thư xuất phát từ các tế bào gan và nó
chiếm đến hơn 90% các trường hợp ung thư gan. Nhiễm virus viêm gan B (HBV),
viêm gan C (HCV) mạn tính và xơ gan được cho là các nguyên nhân chính dẫn đến
ung thư gan . Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao do nhiễm
HBV và HCV. Do đó, việc phát hiện sớm ung thư gan rất quan trọng đối với việc
điều trị loại ung thư này.
Thực hiện luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân
tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích:


Phân tích protein ty thể, microsome và phần còn lại của tế bào tách từ

mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan.

-1-



Phân tích và so sánh sự biểu hiện của các protein ty thể, microsome và

phần còn lại trong mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung
thư gan nhằm tìm ra các protein đặc trưng có liên quan đến bệnh.
Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
-2-


1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ GAN
Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới.
Bệnh này khó chẩn đoán, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao và tử vong trong thời
gian ngắn kể từ khi phát hiện. Trong năm 2008 ước tính có 12 triệu trường hợp
được chẩn đoán mắc ung thư, 7 triệu người chết và khoảng 25 triệu người đang
sống chung với ung thư trên thế giới. Tại Mỹ, năm 2009 ước tính có 22.620 trường
hợp được chuẩn đoán mắc ung thư, 18.160 người chết. Ung thư gan (UTG) gồm hai
loại là nguyên phát và thứ phát. Dạng nguyên phát hình thành từ các mô của gan,
trong khi dạng thứ phát tạo nên bởi các tế bào từ những cơ quan khác trong cơ thể
di căn thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan và tạo khối u (nên còn gọi là ung thư
gan do di căn). Dưới kính hiển vi, các tế bào ung thư di căn gan nhìn giống như các
tế bào ung thư mà chúng xuất phát. Do đó, trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi
chỉ xin đề cập đến ung thư gan nguyên phát với dạng ung thư phổ biến nhất của nó
là ung thư biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [52].

1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát
Các khối u ác tính nguyên phát của gan có thể phát sinh từ thành phần biểu
mô hoặc không phải biểu mô, trong đó ung thư biểu mô là loại hay gặp nhất, chiếm
vị trí quan trọng nhất trong bệnh học UTG. Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh
hoá tế bào, UTG nguyên phát được phân loại thành các dạng sau [3]:
- Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) là dạng ung
thư ác tính xuất phát từ các tế bào gan, chiếm khoảng 90% các dạng UTG
nguyên phát. Bệnh nhân mắc HCC có nguy cơ tử vong rất cao.
- Ung thư biểu mô đường mật (Cholangio carcinoma) là dạng có những khối u
ác tính trong gan bao gồm các tế bào giống tế bào biểu mô đường mật. Bệnh
thường gặp ở lứa tuổi cao hơn so với ung thư tế bào gan, trung bình khoảng
65 tuổi. Dạng này có thể chia thành 2 thể cơ bản là thể ngoại vi và thể trung
tâm.
-3-


- Ung thư hỗn hợp tế bào gan – đường mật (hepatocholangiocarcinoma) là
dạng mang đặc điểm mô bệnh học của cả hai loại nói trên, nói chung ít gặp.
- Ung thư nguyên bào gan (hepatoblastoma) là dạng thường gặp ở trẻ em, rất
hiếm ở người trưởng thành.
- Ung thư nội mạch máu dạng biểu bì (Epithelioid hemangioendothelioma) là
loại mới được mô tả, thường gặp ở tuổi 50, 2/3 số trường hợp phát hiện là ở
phụ nữ.
1.1.2. Các giai đoạn của ung thư gan
Ung thư gan được chia làm 4 giai đoạn:
• Trong giai đoạn I, có một khối u và không lây lan sang các mạch máu
gần đó.
• Trong giai đoạn II, có một khối u đã lan ra các mạch máu gần đó;
hoặc nhiều hơn một khối u, không cái nào trong số đó lớn hơn 5 cm.
• Giai đoạn III được chia thành các giai đoạn IIIA, IIIB, và IIIC; Trong

giai đoạn IIIA, một trong những điều sau đây được tìm thấy: nhiều
hơn một khối u lớn hơn 5 cm hoặc một khối u đã lan rộng đến một chi
nhánh chính của các mạch máu gần gan. Trong giai đoạn IIIB, có một
hay nhiều khối u của bất kỳ kích thước mà có một trong hai: lây lan
đến các cơ quan lân cận khác với các túi mật, hoặc bị hỏng thông qua
các màng của khoang phúc mạc. Trong giai đoạn IIIC, ung thư đã lan
•

đến hạch bạch huyết gần đó.
Trong giai đoạn IV, ung thư đã lan tràn vượt ra ngoài gan đến những
nơi khác trong cơ thể, chẳng hạn như xương hay phổi. Các khối u có
thể có kích thước bất kỳ và cũng có thể đã lan ra các mạch máu gần
đó và các hạch bạch huyết [53].

1.1.3. Nguyên nhân ung thư gan
Mỗi một tác động xấu đều làm tăng nguy cơ mắc một căn bệnh bất kì và có
thể là ung thư. Các bệnh ung thư khác nhau có các tác nhân gây bệnh khác nhau. Ví
dụ, để làn da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh là tác nhân dẫn đến ung
thư da. Hút thuốc là một tác nhân dẫn đến ung thư phổi, miệng, thanh quản, bàng
quang, thận, và nhiều cơ quan khác. Nhưng việc có một, hay có vài tác nhân không
-4-


có nghĩa rằng một người sẽ mắc bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số tác
nhân làm tăng khả năng dẫn đến ung thư biểu mô tế bào gan.
UTG được xem là biến chứng phổ biến nhất của các bệnh mãn tính thường
gặp ở gan. Chúng thường được gặp ở nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng
5,5–14,9/100.000 người mắc bệnh và ước tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử
vong . Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhau nhiều tuỳ theo khu vực địa lý trên thế
giới, nhất là giữa phương Đông và phương Tây. Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao

nhất là Đông Á, Đông Nam Á và khu vực Nam sa mạc Sahara. Nghiên cứu dịch tễ
học đã xác định được các yếu tố nguy cơ chính của UTG bao gồm: nhiễm virus
viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) dẫn
đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); các loại hoá chất gây
ung thư như rượu, asen, dioxin (hình 1),… và các rối loạn chuyển hoá apocphirin,
thiếu hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền. Ngoài ra
những yếu tố như độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền,… cũng ảnh hưởng đến nguy
cơ mắc bệnh. Mặc dù các yếu tố nguy cơ gây UTG tác động đến tế bào gan theo các
con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều dẫn đến biến đổi di truyền và hình thành
tế bào ung thư.

Hình 1: Các nguyên nhân chính gây ung thư gan [57]

-5-


Nhiễm virus HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTG trên toàn thế giới, sự
phân bố địa lý giữa tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính và tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan
chặt chẽ. Ví dụ như Trung Quốc, các nước thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa
mạc Sahara có những tỉ lệ này đều ở mức cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World
Health Organization - WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV có thể ngăn ngừa được
khoảng 70% UTG ở các vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao. HBV là một retrovirus có
vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn. Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy
sự hiện diện của ADN của HBV trong hệ gen các tế bào gan của khoảng 90%
trường hợp bệnh nhân ung thư gan [3]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi
ADN của HBV chèn vào hệ gen của người làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt
hoá các gen ung thư như c–Myc, c–Fos,… và bất hoạt một số gen ức chế khối u như
TP53. Ngoài ra, các sản phẩm protein của hệ gen HBV như HBx, protein của gen
pre S/S cũng hoạt hoá các gen ung thư dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào và ức
chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis).

Nhiễm virus HCV là yếu tố nguy cơ thứ 2 của UTG. Có khoảng 2–4% số
trường hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG. Ở những quốc gia, vùng
lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thường cũng có tần suất UTG thấp hoặc
trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV là yếu tố nguy cơ số 1). Số ca tử vong
do UTG ở Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, cùng thời gian đó tỷ lệ nhiễm HBV
là không đổi, chỉ có viêm gan HCV là tăng lên tương ứng với tỷ lệ tử vong. Những
nghiên cứu gần đây cho thấy sản phẩm protein của HCVcó thể tương tác với các
protein vật chủ tham gia vào quá trình phát triển, tăng sinh và điều hòa hoạt động tế
bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính. Có ba protein được xem là bằng chứng tham
gia vào quá trình này đó là protein lõi (core protein), NS3 và NS5A.
Aflatoxin (AF) là một mycotoxin được tiết ra từ các chủng nấm mốc
Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thường mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc
ẩm ướt, đã được chứng minh là có thể gây UTG thực nghiệm trên súc vật (hình 2).
AF là chất tương tác với virus HBV tăng đáng kể nguy cơ mắc UTG. AF gây ra các
-6-


đột biến gen, trong đó đột biến gen p53 được quan sát thấy nhiều nhất. Hàng loạt
nghiên cứu đã chỉ ra đột biến gen này, đặc biệt là đột biến G/T ở codon 249 luôn
được tìm thấy ở bệnh nhân UTG tại những khu vực có sự phơi nhiễm AF cao .

Hình 2: Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan [13]

Ngoài các nguyên nhân trên thì các yếu tố khác như tuổi, giới tính, chủng tộc
hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm
sắt ở mô, thiếu hụt α1-antitrypsin cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư
gan [35].
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị ung thư gan
1.1.4.1.Chẩn đoán
Gan được cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả

năng tái sinh mạnh, do đó ung thư gan phát triển rất nhanh. Đồng thời, các triệu
chứng của ung thư gan thường biểu lộ khi bệnh đã nghiêm trọng, do đó, việc điều

-7-


trị ung thư gan gặp rất nhiều khó khăn. Đây chính là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ
lệ tử vong do ung thư gan rất cao.
Việc chẩn đoán ung thư gan ở giai đoạn sớm là vô cùng cần thiết. Có hai
phương pháp thông dụng nhất hiện nay để chẩn đoán ung thư gan là các xét nghiệm
chẩn đoán vật lý và xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh
bệnh nhân bị ung thư.
Để chẩn đoán khi có các triệu chứng của ung thư gan, một số phương pháp
chẩn đoán vật lý được áp dụng như: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hưởng
từ (MRI - Magnetic Resonance Imaging), chụp X- quang. Tuy nhiên, những
phương pháp này tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc và không hiệu quả để
phát hiện khối u ở giai đoạn sớm.
Cách chẩn đoán thứ hai rất thông dụng đó là việc xét nghiệm chỉ thị AFP
trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối lượng 70kDa, được tổng hợp ở
gan và túi noãn hoàng trong giai đoạn thai nhi, và sau đó nó được tiết vào huyết
thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh giảm
và hầu như không phát hiện được ở người trưởng thành khỏe mạnh. AFP có thể
được dùng để sàng lọc người có nguy cơ bị ung thư gan cao. AFP mất đi ngay sau
khi trẻ sinh ra, nếu hiện diện ở máu người lớn có nghĩa là có biến đổi về tế bào gan
và có khả năng mắc ung thư gan cao [10].
Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vì có thể nó cũng
tăng ở những người bị viêm gan. Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp AFP cũng
không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thư gan mà hàm lượng AFP trong máu
vẫn bình thường (đặc biệt ở những bệnh nhân có khối u nhỏ hơn 3cm) [11].
Hàm lượng AFP cao có thể cho chúng ta nghi ngờ chứ không thể chắc chắn

bệnh nhân đã mắc ung thư gan. Các xét nghiệm có thể giúp chẩn đoán ung thư gan,
nhưng trong đa số trường hợp cách duy nhất để chắc chắn là lấy một mảnh của khối

-8-


u và xem xét nó dưới kính hiển vi. Điều này được gọi là sinh thiết. Có nhiều cách
khác nhau để có được những mẫu khối u. Trong một số trường hợp, một mẫu sinh
thiết có thể được thực hiện trong khi phẫu thuật. Nếu khối u đã lớn hoặc đã lan rộng
khắp gan, một kim rỗng có thể được đặt qua da trong bụng và vào trong gan. Sinh
thiết mẫu cũng có thể được thực hiện trong thời gian phẫu thuật nội soi.
1.1.4.2 Điều trị
Có 2 nhóm điều trị chính: phẫu thuật và không phẫu thuật. Nhóm phẫu thuật
là phương thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hơn hẳn, và trong đó cắt gan là điều
trị chọn lựa, tuy nhiên chỉ có khoảng 10-20% bệnh nhân có khả năng cắt bỏ UTG.
Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa và UTG, tuy nhiên, vấn đề là thiếu gan cho để
ghép.
 Điều trị không phẫu thuật có thể dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn
qua da, phá hủy u bằng nhiệt, phá hủy u bằng sóng tần số radio, hóa trị toàn
thân với Doxorubicin, xạ trị qui ước, điều trị nhắm đích.
 Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, ngoài ra có thể hủy u
bằng laser hay đông lạnh cho các u bề mặt.
1.2

CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC

1.2.1 Khái quát
Như chúng ta biết, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư gặp rất nhiều khó
khăn. Những phương pháp áp dụng hiện thời hầu như không đủ khả năng để có thể
tạo những bước đột phá trong việc chẩn đoán sớm ung thư, đặc biệt là ung thư gan.

Trong những năm gần đây có một hướng nghiên cứu trọng yếu đó là việc nghiên
cứu tìm kiếm các chỉ thị sinh học.
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học.
Chỉ thị sinh học có thể đơn thuần là một chất, như glucose là chỉ thị của bệnh tiểu

-9-


đường, hoặc phân tử protein, như các kháng thể là chỉ thị của bệnh nhiễm trùng, hay
các dấu ấn ADN là chỉ thị cho các bệnh liên quan đến di truyền. Với phát triển của
những kỹ thuật sinh học hiện đại, người ta có thể nghiên cứu nhiều phân tử trên
cùng một mẫu bệnh phẩm như microarray, proteonomics [.
Trong nghiên cứu bệnh học, chỉ thị sinh học có thể là những phân tử gây bệnh
hay những phân tử được tạo ra sau khi bệnh phát triển. Biomarker còn được gọi là
“chỉ thị” của một hiện tượng sinh học, những nghiên cứu gần đây đã chứng minh
tính hữu dụng của chỉ thị sinh học cho nhiều bộ môn sinh học từ nghiên cứu đến
ứng dụng. Các nhà nghiên cứu chỉ thị sinh học tin tưởng rằng chỉ thị sinh học chứa
đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm chỉ thị sinh học sẽ giúp đạt được
những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học. Những ứng dụng
này gồm các phương pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến
nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh...), hoặc các bệnh miễn
nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường. Chỉ thị sinh học
cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc .
1.2.2 Các phương pháp nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư
Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở bệnh nhân ung thư, có nồng
độ thay đổi liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của những khối u ác tính. Chỉ
thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối
u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai
dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các
kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormon và những biến đổi di truyền

của tế bào. Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm các chất hóa sinh phát hiện ở
những nồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, và các loại
dịch của cơ thể.
Hiện nay, có ba phương pháp chính đang được tiến hành để nghiên cứu các chỉ
thị phân tử phục vụ cho việc chẩn đoán sớm ung thư:
-10-


-

Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gen lạ thường có
liên quan đến các loại ung thư riêng biệt. Tuy nhiên, các kết quả của
những nghiên cứu này mới chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh
chứ chưa tìm được cơ chế thực sự của bệnh. Có hai lý do chính về giới
hạn phương pháp genomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư. Thứ nhất,
phần lớn các gene liên hệ đến di truyền có tần số rất thấp trong quần thể
đa dạng sinh học; thứ hai, các bệnh đều có sự tham gia của một phức hệ
gene, mà phần lớn chưa biết tới, chứ không phải từ một gene.

-

Phương pháp proteomics xác định được hầu hết các protein có triển vọng
trở thành các protein chỉ thị ung thư. Các kỹ thuật proteomics có thể xác
định chính xác các đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lượng
bệnh, dự đoán được các ảnh hưởng của việc điều trị và giúp phát triển y
học cho từng cá nhân. Hạn chế của phương pháp này là nhiều protein chỉ
thị ung thư chỉ được tìm thấy ở mô ung thư mà không có mặt trong máu.

-

Phương pháp sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận
dạng các kháng nguyên ung thư. Tuy nhiên, do có hiện tượng phản ứng
chéo trong phản ứng miễn dịch, do đó kết quả của phương pháp này
không đảm bảo tính đặc hiệu .

Proteomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư
Proteomics ung thư là từ được dùng để chỉ các ứng dụng của kỹ thuật
proteomic trong nghiên cứu ung thư. Như chúng ta đều biết ung thư là một bệnh kì
lạ bởi các đột biến diễn ra ở tế bào ung thư. Những thay đổi ADN ở các tế bào này
được dùng trong chẩn đoán nguy cơ bệnh, chẩn đoán sớm và đưa ra hướng điều trị.
Việc sử dụng kỹ thuật proteomic để xác định các tế bào người bệnh sẽ mang lại một
cuộc cách mạng trong y học.
Việc tìm các chỉ thị sinh học hiệu quả nhất là việc tìm các chỉ thị protein, vì
protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác động trực tiếp đến các hiện tượng
-11-


sinh học. Lý do quan trọng hơn nữa là protein là thành phần sinh học phong phú
nhất của tế bào so với mRNA hay xa hơn nữa là gene. Một gene có thể có nhiều bản
sao mRNA, biến đổi dịch mã và sau dịch mã thường tạo ra nhiều protein hơn số bản
sao mRNA. Theo ước lượng hiện nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein từ
số lượng khoảng 30.000 gene của bộ gene người [2].
Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các chỉ thị ung thư đã trở thành
mục đích chính của các nghiên cứu ung thư. Thành công trong ứng dụng của kháng
nguyên tuyến tiền liệt (PSA) trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt đã thúc đẩy các
nghiên cứu để tìm ra những chỉ thị thích hợp cho các loại ung thư khác. Các chỉ thị
sinh học cũng được ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi ung thư, chẩn đoán sự tái
phát bệnh, và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh. Với các đích đã được xác định, các
thuốc điều trị như imatinib (Novartis’ Gleevec), trastuzumab (Roche’s Herceptin),
và rituximab (Roche’s Mabthera) đã được tạo ra để tác động đặc hiệu nhằm điều trị

có hiệu quả bệnh ung thư. Hiện nay, xu hướng lựa chọn các chỉ thị và bệnh nhân để
tiến hành điều trị sẽ tốt cho việc dự đoán tình trạng kháng thuốc. Các chỉ thị sinh
học thực sự rất cần cho việc phát triển điều trị cho từng cá nhân. Các protein có thể
được tiết ra một cách tích cực hoặc được giải phóng ra bởi các tế bào khối u như là
kết quả của sự hoại tử hay quá trình apoptosis và sau đó chúng được lưu thông trong
máu. Điều này dẫn đến sự thay đổi hệ thống protein. Sự khác biệt về cường độ tín
hiệu có thể được tìm ra bằng cách so sánh với huyết tương của những người bình
thường. Các kỹ thuật như Antibody Microarray, điện di hai chiều và khối phổ là
những kỹ thuật chính được sử dụng để tìm các chỉ thị cho bệnh ung thư .
Kết quả từ Viện nghiên cứu Y học Hoa Kỳ (NIH) đã cho biết có 14 protein
có khả năng dùng làm chỉ thị cho bệnh ung thư vú từ các phân tích khối phổ với
mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân[9]. Trong các nhóm được thử nghiệm, độ chính xác
của các chỉ thị này rất cao so với việc dùng các gene BRCA (BRCA là gene của
bệnh ung thư vú di truyền, tuy nhiên gen này chỉ có tỉ lệ thấp từ 2-5% của bệnh này
khi dùng để chẩn đoán chung). Một số chỉ thị protein khác cũng đã được phát hiện
-12-


từ nghiên cứu các bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư bàng quang,
và ung thư buồng trứng; về các bệnh tim mạch đã có một số chỉ thị protein được
cho là có liên quan đến bệnh nghẽn động mạch.
1.2.3 Nghiên cứu chỉ thị sinh học với ung thư gan
Với ung thư gan, việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học đã và đang được tiến
hành với cả ba hướng, bao gồm việc dò tìm các chỉ thị ADN, protein và các kháng
thể đặc hiệu. Trong đó, một trong những hướng nghiên cứu quan trọng nhất là phân
tích tìm ra các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của các tế bào ung thư
gan. Các phân tử chỉ thị này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh
tế bào, gây biến đổi ADN (protein PCNA, Ki-67, Mcm2, MIB1, MIA, và
CSE1L/CAS); gen TP53 và phân tử liên quan đến MDM2; các protein khác tham
gia điều khiển chu trình tế bào (cyclin A, cyclin E, cdc2, p27, p73); các gen gây ung

thư và các thụ thể của chúng (ras, c-myc, c-fms, HGF, c-met, và erb-B); các yếu tố
liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào (Fas và FasL) và sự hoạt động
của các telomerase. Một hướng nghiên cứu khác là tìm ra các chỉ thị phân tử liên
quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thư, các chỉ thị phân tử loại này gồm
các phân tử bám dính (E-cadherin, catenins, các dạng CD44 khác nhau), các
enzyme thủy phân protein làm giảm chất gian bào (MMP-2, MMP-9, Upa, Upar,
PAI), các yếu tố sinh trưởng tham gia vào sự hình thành mạch giúp khối u phá vỡ
vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể …
1.3.

PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ THỊ UNG THƯ

GAN
1.3.1. Proteomics
Thuật ngữ “proteomics” lần đầu tiên được Marc Wilkins và cộng sự đưa ra
năm 1994 đã mở ra một thời kỳ phát triển mạnh mẽ các nghiên cứu về protein.
Proteomics là ngành khoa học nghiên cứu hệ protein, tập hợp tất cả các protein
được mã hóa và biểu hiện bởi hệ gen của cơ thể sinh vật .

-13-


Proteomics là một nhánh của nghiên cứu chức năng hệ gen, nó được sinh ra
khi các nhà nghiên cứu về gen đối mặt với câu hỏi “chức năng của tất cả các protein
là gì ?”. Proteomics có thể được định nghĩa là những nghiên cứu rộng rãi mọi mặt
protein như là sự biểu hiện, những tương tác của protein trong tế bào cũng như việc
mô hình hóa protein. Protein là sản phẩm của ARN thông tin, nó thực hiện phần lớn
các phản ứng của tế bào và nó không có một mối quan hệ tuyến tính nào giữa mức
độ cấu trúc ARN thông tin và protein hay “proteome”trong tế bào. Ngoài ra, hầu hết
các đích tác dụng của thuốc là protein; do đó, các phương pháp để nghiên cứu có

hiệu quả phức hợp protein trong tế bào có thể đóng vai trò trực tiếp cho việc phát
triển thuốc.
Ngày nay, các nghiên cứu proteomics tập trung vào ba mặt chính là: nhận
dạng protein, mô tả sự biểu hiện protein, mô hình hóa hệ thống và sự cải biến
protein.
- Nhận dạng protein là nhiệm vụ cơ bản của proteomics nhằm xác
định tất cả các protein có trong mẫu nghiên cứu. Mục đích của việc này là
đưa ra một danh sách các protein hoàn chỉnh đã được biểu hiện trong thực tế
chứ không phải là suy ra từ dữ liệu về biểu hiện gen.
- Mô tả sự biểu hiện protein là việc xác định sự biểu hiện của các
protein trong một thời điểm nhất định của tế bào, mô. Mô tả protein thực
chất là một trường hợp đặc biệt của việc nhận dạng. Ứng dụng phổ biến nhất
là các phân tích sự khác biệt, trong đó có hai trạng thái riêng biệt của hệ
được so sánh với nhau. Ví dụ như việc nghiên cứu so sánh các mô bình
thường và mô bệnh để xác định xem protein nào biểu hiện khác nhau trong
các trạng thái đó. Các protein biểu hiện khác nhau đó có thể trở thành chỉ thị
sinh học của bệnh.
- Mô hình hóa hệ protein là xác định xem các protein liên hệ như thế
nào với các thành phần khác trong hệ thống sống. Hầu hết các protein thực
-14-


hiện chức năng của nó trong việc kết hợp chặt chẽ với các protein khác.
Nghiên cứu các tương tác này giúp xác định được chức năng của protein. Mô
hình hóa sự cải biến protein là nhiệm vụ xác định xem các protein biến đổi
như thế nào. Nói chung, nhiều cải biến sau dịch mã đã chi phối cấu trúc,
chức năng và hoạt động của các protein.
1.3.2. Hệ protein gan người
Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể người. Gan có vai trò quan trọng trong
các quá trình tiêu hóa, trao đổi chất và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein sinh

chất, là vị trí có hiệu quả nhất để phân giải các chất ngoại sinh, cho quá trình thực
bào đối với các chất rắn, tham gia bảo vệ bộ máy tiêu hóa và các bộ phận khác của
cơ thể. Gan có vai trò chính trong việc xác định động dược học của thuốc, vì đây là
cơ quan chính để đào thải nhờ khả năng chuyển hóa và bài tiết của mật, và cũng là
vị trí chính có ảnh hưởng đến sự phân bố do có quá trình tổng hợp các protein gắn
với thuốc.
Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome người (Human Proteome
Organisation_HUPO) diễn ra ngày 28-29/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánh
dấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan người (Human Liver Proteome Project,
HLPP) với sự tham gia của đông đảo của các viện, trường đại học và các công ty
trên thế giới. Tại hội thảo này đã có sự thống nhất về phương hướng, mục đích,
tương lai khoa học của dự án HLPP và đặc biệt nhấn mạnh các mục tiêu khoa học
của dự án, bao gồm: tạo được bức tranh tổng thể của proteomics gan; xác định sự
phân bố và bức tranh tổng thể của các protein ở mức độ dưới tế bào; lập bản đồ liên
kết của các protein gan; làm sáng tỏ các biến đổi tổng thể của proteome gan; liên
kết giữa các dự án proteome gan và dự án proteome huyết tương để phát hiện các
chỉ thị sinh học của các bệnh về gan [43].
1.3.3. Proteomics trong nghiên cứu ung thư gan

-15-


Tác hại của ung thư gan đối với sức khỏe con người và xã hội là vô cùng lớn.
Việc phân tích proteomics ung thư gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu
biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thư gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn
nữa là đưa ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC. Việc
phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở việc xác định các chỉ thị trong mô, hay
chỉ với nghiên cứu proteomics huyết tương. Việc tìm kiếm các chỉ thị trong huyết
tương kết hợp với nghiên cứu trên mô sẽ giúp chúng ta tiến gần hơn đến việc chẩn
đoán ung thư một cách đơn giản và chính xác hơn chỉ với một xét nghiệm máu đơn

giản. Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thư, phân
tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung thư gan đã và đang
được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu được một số kết quả khả
quan .
Vì nguyên nhân chính của ung thư gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên
cứu đã tập trung vào đối tượng là bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan. Để
tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thư gan có tiền sử viêm gan
B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thư, các nhà khoa học Trung
Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thư bằng kĩ thuật điện di
2 chiều DIGE (điện di 2 chiều các mẫu khác nhau trên cùng một bản gel). Mẫu lấy
từ 12 bệnh nhân HCC có tiền sử viêm gan B được phân tích. Hàm lượng protein
tương đương từ 12 cặp mẫu (bệnh và bình thường) được trộn lại với nhau làm thành
nội chuẩn và được đánh dấu bằng Cy2 trong khi đó mẫu ung thư và không ung thư
được đánh dấu ngẫu nhiên bằng Cy3 hoặc Cy5. Tổng số 61 spot được xác định là
biểu hiện tăng lên trong các mẫu ung thư trong khi đó 158 spot có biểu hiện giảm.
Có 71 sản phẩm của gen đã được xác định từ những spot này. Các thành viên của
họ protein sốc nhiệt 70 và 90 có biểu hiện tăng, trong khi các protein chuyển hóa lại
giảm ở bệnh nhân HCC. Sự giảm các protein ti thể và protein peroxisom trong
nghiên cứu này đưa ra cho chúng ta một gợi ý rằng có sự mất đi những chức năng
chuyên biệt của cơ quan tử trong tế bào gan ung thư. 4 enzyme chuyển hóa trong
chu trình methyl hóa ở gan biểu hiện giảm ở các mô gan ung thư, biểu thị bằng sự
-16-


thiếu hụt S-adenomethionine trong ung thư gan. Hai sản phẩm của gen là
glycerandehyde-3-phosphate

dehydrogenase

và

formimidoyltransferase-

cycledeaminase được xác định từ các spot biến đổi nghịch, từ đó chỉ ra rằng các
đồng phân hoặc các dạng cải biến sau dịch mã của hai protein này có thể đóng vai
trò khác nhau trong ung thư gan. Nghiên cứu này lần đầu tiên chỉ ra rằng sự biểu
hiện tăng của protein Hsp70/Hsp90 và các thể dị hợp ribonulceoprotein nhân C1/C2
trong các mô HCC là các chỉ thị ung thư, được khẳng định bằng Western blot và kĩ
thuật nhuộm hóa miễn dịch tế bào ở 70 mẫu HCC .
Ung thư gan là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, nó
tác động đến nhiều nước trong những năm gần đây. Theo thống kê có khoảng 53%
các trường hợp HCC trên thế giới có liên quan đến HBV. Nguy cơ tiến triển thành
HCC từ những người mang HBsAg cao gấp 25~37 lần so với những người không bị
nhiễm [27]. Khi các virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể sẽ làm cho cơ thể sinh ra
các kháng thể chống lại chúng. Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết
thanh của người bình thường, người nhiễm virus và người bị ung thư gan đã chỉ ra
rằng sự tồn tại của từng kháng thể tự miễn này có liên quan với HCC và là yếu tố
chẩn đoán sớm hiệu quả đối với các trường hợp viêm gan nguy cơ cao . Nghiên cứu
được thực hiện trên huyết thanh của 37 bệnh nhân HCC và 31 trường hợp viêm gan
B/C không bị HCC. Huyết thanh lấy từ các bệnh nhân bị ung thư không phải HCC
và 24 trường hợp khỏe mạnh được dùng làm đối chứng. Có 8 loại protein tạo ra đáp
ứng thể dịch trong huyết thanh từ 70% trong tổng số 37 bệnh nhân trong nghiên
cứu, với tỉ lệ biểu hiện của từng protein riêng biệt từ 11~27%. Các kháng thể tự
miễn kháng β-tobulin, creatine kinase B, hsp60 và cytokeratin18 được phát hiện
trong huyết thanh của các bệnh nhân viêm gan B/C, trong khi đó, kháng thể kháng
calreticulin, cytokeratin8, F1-ATP synthase β-subunit và NDPKA chỉ thấy xuất hiện
nhiều ở bệnh nhân HCC. Calretibulin và một dạng bị cắt của nó (Crt32) đã được xác
định là phổ biến nhất ở các bệnh nhân HCC với tần suất biểu hiện là 27% .
Việc lựa chọn nguồn bệnh nhân để lấy mẫu và cách lấy mẫu sinh phẩm là
rất quan trọng, có vai trò quyết định đến kết quả của một nghiên cứu. Năm 2003,

-17-


Các nhà khoa học tại Seoul, Hàn Quốc tiến hành một phương pháp lấy mẫu độc
đáo với 21 cặp mẫu (các mô ung thư và các mô không ung thư xung quanh gan)
được lấy từ 21 bệnh nhân ung thư gan. Các bệnh nhân này được chia ra làm 3
dạng HCC bởi các chỉ thị virus: 7 HBsAg dương tính (HCC dạng B), 7 anti-HCV
dương tính (HCC dạng C) và 7 HBsAg và anti-HCV âm tính. Protein tổng số được
phân tích bằng điện di 2 chiều và khổi phổ MALDI-TOF-MS và những thay đổi
trong hệ protein đã được chỉ ra. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 60 protein có
mức độ biểu hiện khác nhau giữa các mẫu ung thư và không ung thư, trong số đó
14 protein bị thay đổi trong cả 3 dạng HCC, trong khi đó, 46 protein lại là chỉ thị
đặc hiệu về virus. Tóm lại, các protein đã xác định được phân loại theo tác nhân
virus có liên quan đến HCC dạng B và C. Các kết quả này chỉ ra một cách rõ ràng
rằng sự biểu hiện của hệ protein của các mô trong HCC liên quan mật thiết với
các yếu tố gây bệnh và cơ chế ung thư gan có thể diễn ra khác nhau do các yếu tố
HBV và HCV .
Cũng trên đối tượng các bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan B, tháng
4 năm 2008, Min He và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu phát hiện và xác
định NAP-2 như là một chỉ thị sinh học của ung thư gan liên quan đến viêm gan B
bằng kĩ thuật proteomic. Nghiên cứu được tiến hành trên 81 bệnh nhân HCC có tiền
sử HBV và 33 người khỏe mạnh với kĩ thuật SELDI-TOF-MS đã mô tả hệ protein
của các mẫu huyết thanh.
Năm 2006, nhóm các nhà khoa học Mỹ đứng đầu là Mary Ann Comunale đã
tiến hành phân tích proteomic các glycoprotein huyết thanh bị fuco hóa trong giai
đoạn đầu ung thư gan. Các tác giả đã chỉ ra rằng với sự gia tăng các mức độ fuco
hóa có thể được quan sát qua phân tích polysaccharide với huyết thanh tổng số và
có liên quan đến sự tiến triển HCC. Như đã biết AFP là một chỉ thị sinh học trong
ung thư gan (trên 50ng/mL gặp ở 30~60% trường hợp HCC tại thời điểm chẩn
đoán), tuy vậy, AFP thường biểu thị không đầy đủ ở những mô nhỏ. Trong nghiên

cứu này, các nhà khoa học đã tiếp cận phương pháp glycoproteomics để xác định
-18-


các glycoprotein huyết thanh liên quan tới tiến triển ung thư và GP73 đã được phát
hiện với mức độ gia tăng trong các đối tượng HCC. Protein này đã được phân tích
kĩ và được chỉ ra như là một chỉ thị HCC tốt hơn AFP ở người . Ngoài ra, người ta
còn phát hiện ra một dạng đồng phân khác của AFP khi bị fuco hóa là DCP
(Desgamma carboxyprothrombin) cũng liên quan đến HCC [.
Nhằm làm rõ hơn bằng chứng về sự biểu hiện của đáp ứng miễn dịch cơ thể,
bằng việc chỉ ra sự xuất hiện các kháng thể tự miễn tương tác với các kháng nguyên
mô ở người bị ung thư. Nghiên cứu của Paradis và cộng sự (2007) với mục đích
đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên liên quan đến khối u trong huyết thanh
(tumor-associated antigens-TAAs) trong chẩn đoán ung thư gan. Các tác giả đã sàng
lọc huyết thanh của 142 bệnh nhân HCC bằng việc sử dụng 8 TAAs chọn trước
(Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, Cyclin B1, surviving và p16) không liên quan đến các
mô gan. Các TAAs được định lượng bằng ELISA trên mẫu huyết thanh và được so
sánh giữa một nhóm HCC và một nhóm huyết thanh bình thường. Nghiên cứu này
đã giải quyết vấn đề miễn dịch ung thư từ đó cho phép phân tích toàn diện các
kháng thể tương tác với các kháng nguyên trong một khối u và đánh dấu cho sự
phát triển trong nghiên cứu chỉ thị sinh học bệnh đặc biệt là ung thư .
Năm 2010, Pleguezuelo và các cộng sự tại đại học Reina Sofia Cordoba Tây
Ban Nha đã tiến hành nghiên cứu nhận dạng chỉ thị mới của ung thư gan bằng
phương pháp proteomics. Các bệnh nhân HCC với 3 nguyên nhân chính là nhiễm
virus viêm gan B, viêm gan C và do rượu. Mẫu được phân tích bằng điện di hai
chiều để xác định các protein có biểu hiện khác biệt. Các protein được phân tách
trên một thanh trip có gradient pH từ 3 đến 10 và điện di biến tính với SDS. Phân
cắt protein bằng trypsin và phân tích nhận dạng peptide. Kết quả là 3 apolipoprotein
biểu hiện khác biệt đã được nhận dạng: Apo-A1, Apo-A4 và Apo-E. Apo-A4 có
biểu hiện thấp hơn ở bệnh nhân HCC so với mẫu không có HCC. Nhiều ý kiến cho

rằng Apo-A4 và Apo-A1 là các nhân tố độc lập liên quan đến chẩn đoán HCC.

-19-


Nghiên cứu đưa ra kết luận rằng Apo-A4 và Apo-A1 có thể được sử dụng như một
chỉ thị có độ nhạy và đặc hiệu cao với HCC .
Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong những nguyên nhân phổ
biến gây khối u ác tính gây tử vong cao. Tỷ lệ mắc HCC ở Hoa Kỳ đang gia tăng.
Matos và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu proteomics ung thư gan của người Mỹ.
Khối u và mô từ ba bệnh nhân HCC người Mỹ bị viêm gan và không liên quan đến
viêm gan đã được phân tích để tìm sự khác biệt phổ biến trong biểu hiện protein.
Protein đã được phân tách bởi điện di 2D (gel 10% SDS-PAGE). Gel đã được cố
định và sau đó nhuộm màu với xanh Coomassie. Số hóa và xử lý được thực hiện
bằng cách sử dụng phần mềm PDQuest. Sử dụng kiểm định t-student để phát hiện
sự thay đổi protein giữa khối u mà mô lành của tất cả các cặp mẫu với xác suất P <
0,01. Kết quả thu được với 19 spots biểu hiện khác biệt có ý nghĩa (> 2 lần). Trong
số 19 spots, 9 spots biểu hiện tăng và 10 biểu hiện giảm ở u. Các protein biểu hiện
tăng bao gồm: beta-5-tubulin, beta-actin, vimentin, carbamoyl-phosphate,
synthetase-1, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, serum albumin, catalase,
autoimmune regulator, and transcription factor, ets. Các protein biểu hiện giảm bao
gồm:

BiP

protein,

A-kinase

anchoring

protein

18

gamma,

inorganic

pyrophosphatase, keratin 8, repulsive guidance molecule, butyrophilin, superoxide
dismutase, TSA, heat-shock 70-kDa protein 9B, and hemoglobin alpha-2. Đặc biệt,
các protein tự miễn dịch được biểu hiện cao 14 lần trong mô khối u, cho thấy nó có
thể có một vai trò trong HCC. Xác nhận và tiếp tục điều tra về những thay đổi
protein này có thể dẫn đến việc phát hiện ra phân tử chỉ thị mới [19].
Trong dự án tin sinh học proteomic, Kondo đã chỉ ra rằng 23 protein xuất
hiện trở lại khi tái phát ung thư gan sau phẫu thuật. Hơn nữa, khi tập trung vào
những khác nhau về tế bào học, tác giả đã chỉ ra rằng APC gắn protein EB1 là một
chỉ thị sinh học mới cho tiên lượng HCC. Protein EB1 liên quan đến con đường dẫn
truyền tín hiệu có biểu hiện khác thường ở bệnh nhân HCC và ung thư thực quản.
Kiểm tra hóa miễn dịch tế bào sự biểu hiện EB1 sẽ giúp xác định các trường hợp có
-20-


nguy cơ tái phát cao và tác động điều trị có thể được cải thiện thông qua theo dõi và
điều trị bệnh .
1.3.4. Nghiên cứu hệ protein ty thể

Ty thể được xem như là cái đích lý tưởng cho việc phân tích hệ protein vì
chúng có độ phức tạp không cao và có nguồn gốc từ các tế bào prokaryote. Ngoài
ra, người ta còn thấy vai trò của chúng trong rất nhiều các rối loạn, gây lên nhiều

các bệnh tật khác nhau. Ngoài chức năng tạo nguồn năng lượng sinh học, ty thể
tham gia điều hòa quá trình gây chết của tế bào, điều chỉnh ổn định nội môi ion, oxy
hóa các hydrate cacbon và axit béo, tham gia trong nhiều quá trình đồng hóa và dị
hóa khác nhau. Vì vậy, rối loạn chức năng của ty thể có thể gây những hậu quả
nặng nề, từ những khuyết tật trong chuyển hóa năng lượng đến các bệnh lý có
nguyên nhân phức tạp, bao gồm cả bệnh Alzheimer, Parkinson, ung thư, đái tháo
đường typ 2, tim mạch và viêm khớp xương mạn tính. Sự liên quan của ty thể với
các bệnh phát sinh kể trên đã và đang hướng những nghiên cứu thực nghiệm vào
xác định hệ protein ty thể, khám phá những chỉ thị phân tử cho sự phát triển thuốc
và can thiệp vào việc chữa bệnh.
Theo Taylor (2003), Cotter (2004), Prokisch (2004), người ta dự đoán sẽ có
khoảng 1500 loại protein sẽ được xác định trong ty thể. Việc áp dụng các kỹ thuật
điện di hai chiều và khối phổ trong những nghiên cứu hiện tại đang mở ra những
hứa hẹn mới trong sự nhận diện hệ protein của ty thể [1].
Ty thể là bào quan phổ biến trong gan. Mỗi tế bào gan có hàng nghìn ty thể.
Trong ung thư gan, sự rối loạn chức năng ty thể có thể có những mối liên quan trực
tiếp đến bệnh. Đặc biệt ty thể có một vai trò quan trọng trong con đường hoạt hóa
apoptosis nội bào. Những sai hỏng trong con đường apoptosis có khả năng cho tế
bào được sống sót, góp phần gây nên tình trạng ác tính của u. Quan trọng hơn nữa
là sự thay đổi biểu hiện và những đột biến trong quá trình apoptosis liên quan tới
các protein có trong các cơ chế quan trọng làm cho các u trở lên kháng thuốc. Vì
-21-


vậy, vai trò chủ chốt của con đường apoptosis trong sự phát triển ung thư và đáp
ứng điều trị cho thấy rằng các protein ty thể có liên quan đến quá trình này có khả
năng như là các chỉ thị sinh học chẩn đoán ung thư.
Các protein có liên quan đến quá trình apoptosis thông qua ti thể thường
xuyên được nghiên cứu để được đánh giá là các chỉ thị sinh học trong ung thư. Cụ
thể, là những chất điều hòa chủ chốt của con đường này, các phân tử họ Bcl-2 được

nghiên cứu thường xuyên như các chỉ thị sinh học apoptosis trong nhiều loại ung
thư, bao gồm cả ung thư gan.
Những sai hỏng chức năng của ty thể được cho là có vai trò quan trọng trong
sự phát triển của ung thư. Hơn 70 năm trước, Warburg [44] đã mở đường cho việc
nghiên cứu những biến đổi trong vai trò hô hấp nội bào của ty thể đối với ung thư
và đã đề xuất ra một cơ chế để giải thích quá trình phát sinh ung thư. Trong một loạt
các bài báo, ông đã đưa ra giả thiết rằng sự kiện chìa khóa trong việc phát sinh ung
thư là sự phát triển của một “tổn thương” trong bộ máy hô hấp nội bào, dẫn đến sự
tăng sinh bù lượng ATP glycolytic. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu
cầu năng lượng của mình bằng cách sản xuất một phần lớn ATP của mình thông
qua cơ chế glycolytic hơn là thông qua phosphoryl hóa oxy hóa. Do sự sản sinh
ATP glycolytic kém hiệu quả, điều này phần nào phản ánh cơ chế trao đổi chất duy
nhất của các tế bào ác tính và điều đó sẽ yêu cầu tiêu thụ một lượng lớn glucose để
đáp ứng nhu cầu năng lượng của tế bào. Điều này xảy ra trái ngược ở nhiều tế bào
bình thường, các tế bào sử dụng phosphoryl hóa oxy hóa như là cách chủ yếu để
tổng hợp ATP với hiệu suất cao. Sự khác biệt trong chuyển hóa năng lượng giữa
các tế bào ung thư và các tế bào bình thường tạo thành một cơ sở hóa sinh để suy
đoán rằng các hướng điều trị có thể được phát triển để chọn lọc tiêu diệt các tế bào
ung thư trong trạng thái tổn thương hô hấp tế bào.
Kể từ khi ấn phẩm phẩm đầu tiên của Warburg được xuất bản hơn nửa thế kỷ
trước, một số bệnh ung thư liên quan đến khuyết tật ti thể đã được xác định và được

-22-


mô tả trong các tài liệu. Những khiếm khuyết bao gồm thay đổi biểu hiện và hoạt
động của các tiểu đơn vị chuỗi hô hấp và các enzym glycolytic, giảm quá trình oxy
hóa các chất NADH được liên kết, cũng như đột biến ADN ti thể (mtDNA). Trong
khi có nhiều báo cáo về các hiện tượng, các cơ chế chịu trách nhiệm về việc bắt đầu
và tiến triển của đột biến mtDNA, vai trò của nó trong sự phát triển của bệnh ung

thư, và tiến triển bệnh vẫn còn chưa được làm sáng tỏ .
Hơn 300 triệu người đang bị nhiễm mạn tính với virus viêm gan B, và nhiều
người trong số này có khả năng phát triển thành ung thư gan. HBV mang 7 protein
virus, trong đó có protein không có cấu trúc X (nonstructural X) (HBx). Các kết quả
nghiên cứu với các tế bào bất tử hay các tế bào chuyển gen và với HBx của chuột
biến đổi gen đã chứng minh rằng HBx có thể tương tác với các ty thể. Tuy nhiên,
không có những nghiên cứu mô tả chính xác vị trí HBx trên ty thể hay ảnh hưởng
của nó đến các trạng thái sinh lý của ty thể. Clippingen và cộng sự đã tiến hành
nuôi cấy tế bào gan chuột mô hình đặc trưng để mô tả trí của HBx ti thể và ảnh
hưởng của nó về mặt sinh lý học. Kết quả, đã cho thấy sự định vị của HBx với mật
độ cao và liên kết với màng ngoài ty thể. Họ đã chứng minh rằng HBx có khả năng
điều hòa màng ti thể trong các tế bào gan và chức năng này của HBx thay đổi tùy
theo tình trạng hoạt động của NF-αB. Trong các tế bào gan chuột sơ cấp, sự hoạt
hóa HBx của NF-αB ngăn cản sự khử cực màng ti thể, tuy nhiên, khi hoạt động của
NF-αB bị ức chế, HBx gây sự khử cực màng thông qua sự điều khiển tính thấm lỗ
ti thể. Tóm lại, các kết quả này xác định con đường tiềm năng mà qua đó có thể
kích hoạt HBx để điều chỉnh quá trình sinh lý của ti thể, do đó làm thay đổi nhiều
hoạt động tế bào và cuối cùng góp phần vào sự phát triển các nghiên cứu ung thư
gan liên quan đến HBV.
1.3.5. Nghiên cứu hệ protein microsome

Microsome là những túi tiết được hình thành từ mạng lưới nội chất khi các tế
bào eukaryote bị phá vỡ. Ở điều kiện bình thường microsome không tồn tại trong

-23-


các tế bào sống. Microsome có thể được tách và thu lấy từ những mảnh vỡ tế bào
bằng cách ly tâm. Các tế bào không vỡ, nhân, và ty thể sẽ bị lắng xuống ở khoảng
11.000g, trong khi các enzyme hòa tan và lưới nội chất chứa cytochrome P450 vẫn

còn trong dung dịch. Khi sử dụng máy siêu ly tâm tốc độ lên tới 100.000g các
microsome bị lắng xuống thành cặn còn các enzyme hòa tan thì vẫn nổi trên mặt.
Bằng cách này microsome được tách ra. Microsome thu được có màu nâu đỏ do sự
có mặt của các cofactor có chứa sắt, nhân heme trong enzyme P450 có rất nhiều
trong gan của người và động vật.
Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao đổi chất
của các hợp chất và kiểm tra các tương tác thuốc. Các nhà nghiên cứu thường chọn
microsome dựa trên mức độ hoạt động đặc trưng của các enzyme CYP.
Năm 2008 Nakamura và cộng sự

đã tiến hành nghiên cứu proteomic

microsome trên mô gan chuột thí nghiệm được thực hiện bằng sự kết hợp các kỹ
thuật điện di biến tính 1 chiều và sắc ký lỏng nano kết hợp với khối phổ (nano-LCMS/MS) để nghiên cứu hệ protein màng. Hơn 100 protein đã được nhận dạng bằng
phân tích khối phổ, và hầu hết các protein trong đó đã được chỉ ra là có liên quan
với các protein màng như microsomal glutathione S- transferase 1, cytochrome P450 và một số ít các protein liên quan đến thụ thể lipoprotein.
Trong microsome thì hệ cytochrome P450 (CYP) là hệ protein được quan
tâm nhất. Hệ protein này tham gia vào sự khử độc và đáp ứng thuốc trong tế bào.
Do đó, việc nghiên cứu hệ protein microsome giúp chúng ta tiến gần đến việc dự
đoán và điều trị thuốc cho các vấn đề bệnh lý.
Năm 2006, Aderson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích
proteomics so sánh đáp ứng của CYP trong mô gan chuột xử lý vơi 1,4-bis-2- (3,5dichloropyridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán đáp ứng
của thuốc. Trong nghiên cứu này, họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics
P450 của gan chuột dưới tác động của TCPOBOP. Phương pháp nghiên cứu gồm
-24-


thu microsome bằng ly tâm, phân tách các protein microsome bằng phương pháp
điện di, phân cắt protein bằng enzyme trypsin, và đánh dấu đồng vị 18O/16O, sau đó
nhận dạng các peptide bằng kỹ thuật khối phổ nano-LC-MS/MS và LC-MS. 17

protein trong họ P450 đã được xác định. Tất cả các P450 phát hiện ra được nhận
dạng một cách rõ ràng ngoại trừ CYP2A4/2A5. Trong đó CYP1A2, -2A4 /5, -2B10,
-2B20, -2C29, -2C37, -2C38, -3A11, và -39A1 có biểu hiện tăng và CYP2C40,
-2E1, -3A41, và -27A1 có biểu hiện giảm so với đối chứng. Sự biểu hiện khác biệt
của các protein này cho ta thấy CYP đã có những đáp ứng với thuốc và việc nghiên
cứu hệ protein microsome có thể giúp ta nghiên cứu những đáp ứng với độc chất
trong tế bào [5].
Việc phân tích hệ protein microsome trong những biến đổi của bệnh ung thư
gan vẫn chưa được tiến hành nhiều. Tuy nhiên, với vai trò của nó trong việc đáp
ứng với những thay đổi trong tế bào thì việc nghiên cứu hệ protein microsome hứa
hẹn sẽ đem lại những kết quả tốt cho việc tìm các chỉ thị cho bệnh và tiến đến chẩn
đoán phát hiện sớm ung thư đặc biệt là với ung thư gan.
1.3.6 Nghiên cứu proteomics ở Việt Nam
Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay, nhà nước đã đầu tư kinh phí để xây dựng
các Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia với các thiết bị nghiên cứu proteomic
tiên tiến được trang bị. Cho đến nay, có 3 Phòng thí nghiệm như thế đã được đưa
vào triển khai hoạt động tại Viện Công nghệ Sinh học (năm 2002), Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội (năm 2004) và Trung tâm
nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học thuộc Học Viện Quân Y (năm 2006). Tại
các Phòng thí nghiệm này, các nghiên cứu proteomic đã được triển khai và đã bước
đầu đạt được những kết quả nhất định.
Bằng cách sử dụng sắc ký lỏng Nano đa chiều và hệ khối phổ liên tục, Vũ
Minh Thiết và cộng sự [4] đã xác định được hơn 900 trình tự protein có trong mẫu
huyết thanh người như các tác nhân đông máu, bổ thể, các protein gắn kết, vận
-25-