NGHIÊN cứu đa DẠNG DI TRUYỀN PHÂN đoạn s7 của các CHỦNG VIRUS gây BỆNH lúa lùn sọc ĐEN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lại Phƣơng Liên

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7
CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lại Phƣơng Liên

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7
CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội và
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn
Hoàng Quang cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong
thời gian thực tập tại Bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn
Di truyền học, khoa Sinh học , trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong một môi trƣờng học
tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học.
Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè,những
ngƣời luôn đứng sau giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013
Học viên thực hiện

Lại Phƣơng Liên

i


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BVTV
bp

Bảo vệ thực vật
Base pair (Cặp bazơ)

cDNA

complementary (DNA bổ sung)

ddNTP

Dideoxyribonucleoside triphosphate

DNA

Axit deoxy ribonucleic

dNTP

Deoxynucleotidetriphosphates

dsRNA

Double stranded RNA (ARN sợi đôi)

FDV

Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji)

EDTA

Axit Ethylenediaminetetra acetic

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết

với enzyme)
EtBr

Ethidium Bromide

IRRI

International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế)

Kb

Kilobase

LB

Môi trƣờng Luria Bertani

LSĐPN

Lùn sọc đen phƣơng Nam

MRCV

Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto)

MRDV

Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô)

NLRV

Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens)

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn
OD

Optical Density (mật độ quang học)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

OSDV

Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch)

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RBSDV

Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen)

RGSV

Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ)

RNA

Axit ribonucleic

RRSV

Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá)

ii


RSV
RT-PCR

Rice stripe virus (Virus lúa sọc)
Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp

phiên mã ngƣợc)
RTSV

Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu)

RTBV

Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng)

RDV

Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn)

RGDV

Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa)

SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn s ọc đen phƣơng Nam)
TAE

Tris base – Acetic - EDTA

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1

Các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu.

22

Bảng 2

Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa

Bảng 3

Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và

35
40

RT-PCR một bƣớc
Bảng 4

Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng

42

So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các

54

RT-PCR
Bảng 5

mẫu Việt Nam và Trung Quốc

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1

Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam

Hình 2

Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV

Hình 3

Cấu trúc phân tử các Fijivirus

Hình 4

Tổ chức bộ gen của các Fijivirus

Hình 5

9

11
11

Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13

Hình 6

8

12

Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV

14

trên gel polyacrylamide 12,5%.
Hình 7

Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh

16

(rầy Sogatella furcifera) dƣới kính hiển vi điện tử
Hình 8

Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phƣơng pháp DOT-ELISA

Hình 9

Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các

17
32

enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T
Hình 10

Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam

37

Hình 11

Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh

38

Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một

39

Việt Nam
Hình 12

bƣớc của các mẫu lúa
Hình 13

Hình ảnh điện di genome của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu

40

Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập đƣợc của SRBSDV

42

lúa
Hình 14

trên gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2)
Hình 15

Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân

43

Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit

45

đoạn S7
Hình 16

GenJETTM Gel Extraction trên gel agarose 1%
Hình 17

Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T

Hình 18

Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46

v

46


DH5α
Hình 19

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel

47

agarose 1%
Hình 20

Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng

48

cặp mồi S7-Fw/S7-Rv
Hình 21

Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng

49

cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
Hình 22

Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp

50

pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI
Hình 23

Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus

50

SRBSDV (mẫu Nghệ An)
Hình 24

Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên

51

phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)
Hình 25

Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7

53

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
Hình 26

Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7

53

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
Hình 27

Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự

gen P7-1 (B)

vi

55


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM........................... 3

1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa.............................................................................................. 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam.............................................................. 3
1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV...................................... 5
1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam........................................................ 5
1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam................................................... 5
1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam............................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam................................................. 7
1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết......................................................................................................... 7
1.2.2.2. Vector truyền bệnh ....................................................................................................... 8
1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV......................................................................... 10
1.2.3.1. Phân loại.................................................................................................................... 10
1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV............................................................................... 12
1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV..................................................................... 12
1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV..................................... 14
1.2.3.5. Chuẩn đoán virus SRBSDV........................................................................................ 16
1.2.4. Tình hình nghiên c ứ u b ệ nh lùn s ọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở Việ t
Nam.......................................................................................................................................... 17
1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV

......................................................... 17

1.2.4.2. Các nghiên cứu về quy trình chẩn đoán virus SRBSDV............................................ 19
CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................... 21
2.1. VẬT LIỆU........................................................................................................................ 21
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất......................................................................................................................... 21
2.1.3. Thiết bị........................................................................................................................... 22

vii


2.2. PHƢƠNG PHÁP............................................................................................................. 22
2.2.1. Thu mẫu........................................................................................................................ 22
2.2.2. Xét nghiệm mẫu........................................................................................................... 22
2.2.2.1. Phƣơng thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA"............................................ 23
2.2.2.2. RT-PCR một bƣớc...................................................................................................... 25
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%............................................................................ 26
2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11......................................................... 26
2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA.......................................................................................... 28
2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi.......................................................................................................... 28
2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1................................................................................................. 28
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR.............................................................. 29
2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.............................. 30
2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning................................ 31
2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T.................................................... 31
2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α............................................. 32
2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep.......... 33
2.2.7. Cắt enzyme giới hạn...................................................................................................... 33
2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng............................................................ 34
2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7..................................................................... 35

CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 36
3.1. Thu thập và bảo quản mẫu............................................................................................... 36
3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc......38
3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phƣơng pháp Sandwich- ELISA........................... 38
3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp RT-PCR 1 bƣớc................................................... 39
3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV........................................................................... 39
3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh..................................... 41
3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR...................................................... 43
3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 ..43
3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR................................................... 43

viii


3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV........................................... 44
3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T................................................................ 45
3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α.............. 45
3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ p̣ ........................................... 47
3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ p̣ bằng phản ứng PCR. ..... 47
3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng cách xử lí với enzyme
cắt giới hạn EcoRI .................................................................................................................... 49
3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV........................................................................ 50
3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV.................................. 52
3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV
trên thế giới.............................................................................................................................. 52
3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền......................................................................................... 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 57
Kết luận .................................................................................................................................... 57
Kiến nghị................................................................................................................................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 57

PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................................. 62
PHỤ LỤC 2 .............................................................................................................................. 68

ix


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học
MỞ ĐẦU

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời
cũng là nguồn lƣơng thực chính cho một nửa dân số thế giới. Là nƣớc xuất khẩu gạo
đứng thứ 2 trên thế giới, lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp
xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nƣớc.
Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo của Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách
thức nhƣ (1) điều kiện bất lợi của môi trƣờng do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi
khí hậu toàn câu và (2) dịch bệnh do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học
dẫn đến mất cân bằng sinh thái. Trong điều kiện thích hợp, các tác nhân gây bệnh trên
lúa có thể phát triển rất mạnh, làm giảm năng suất tới trên 85%, thậm chí mất trắng.
Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất, dẫn đến sản lƣợng
nông nghiệp không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực.
Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do
khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát. Ở Việt Nam, virus gây ra một
số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn,
bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen...Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa
lùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng
diện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha, gây thiệt hại lớn cho sản suất Nông
nghiệp. Mặc dù, nguyên nhân gây bệnh bƣớc đầu đã đƣợc xác định là virus gây bệnh
lúa lùn sọc đen (SRBSDV) và dịch bệnh đến nay đã tạm thời lắng xuống nhƣng diễn

biến gây bệnh vẫn tồn tại trong sản suất lúa. Đặc biệt, virus SRBSDV là chủng vius
mới xuất hiện nên tất cả các nghiên cứu nhƣ: (1) nguyên nhân gây bệnh, (2) đặc trƣng
sinh học, (3) dịch tễ bệnh và (4) phòng chống bệnh cần phải đƣợc nghiên cứu. Thực tế
các nghiên cứu hiện tại vẫn đang tập trung vào việc hoàn thiện quy trình chẩn đoán, sau
đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt trung gian truyền bệnh,
trồng giống lúa kháng rầy, luân canh...; chƣa có các nghiên cứu chuyên sâu về bản chất
hệ gene, mức độ đa dạng di truyền, mức độ đột biến, nguy cơ phát sinh chủng mới. Vì
nguy cơ phát dịch trở lại của loại virus này vẫn tiềm ẩn.

1


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi,
có kích thƣớc từ 1 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào
kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF
có chiều dài 1073 và 930 nucleotide. Trong đó, ORF 7-1 chứa gen 7-1 quy định protein
P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector trung gian truyền bệnh là rầy
lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa
dạng di truyền và sự tiến hóa của virus.
Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa
dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen” với
những mục tiêu chính nhƣ sau:
- Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa
nhiễm bệnh thu thập tại 5 vùng sinh thái trồng lúa của Việt Nam.
- Phân tích tính đa dạng di truyền và so sánh mức độ tiến hóa của các chủng
SRBSDV ở Việt Nam với các chủng SRBSDV khác trên thế giới.

2


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM
1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa
Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân
chính làm sản lƣợng nông nghiệp không ổn định, gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng
thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do
việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và
mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào
hết. Trong sản xuất nông nghiệp tổng cộng có 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1)
và khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ
cây ngô, đậu tƣơng…Trong số các virus hại lúa ngoài Rice hoja blanca virus (một
Ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một Luteovirus, phân bố tại
châu Âu), Rice stripe necrosis virus (một Furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus
còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á. Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây
hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn
lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam
Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành
các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác nhau trên cả nƣớc. Tuy
nhiên, cho đến nay mới ghi nhận 5 loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di
động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15]. Hiện
nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang

và đang có nguy cơ thành dịch [14].
Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó
áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng
giống kháng rầy, luân canh… Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ Thực vật và
Trƣờng đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng

3


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn
xoăn lá, đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện RGSV, RRSV,
RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13]. Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng
lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và
biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên
cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7]. Các nghiên cứu về virus hại lúa
tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các
nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng Công nghệ
gen. Hiện Viện Di truyền Nông Nghiệp đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn
và lùn xoăn lá lúa ở ngân hàng gen NCBI, đã xác định đƣợc các gen quan trọng và các
đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ),
đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc
một số cây chuyển gen [5, 11]. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm
nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã sản suất
đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 virus lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: RGSV,
RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, RTBV, RDV và RGDV với số lƣợng đủ cho nghiên
cứu, hợp tác và chẩn đoán [5].

Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là
đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus
hiện nay. Vì vậy, chiến lƣợc nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần
phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hạn. Nghiên cứu
đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản suất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó
xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, trong khi nghiên cứu dài hạn tập trung vào
khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến
để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác,
nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây
bệnh dựa trên công nghệ gen.

4


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV
1.2.1. Giớ i thi ệ u chung v ề b ệ nh lùn s ọc đen phƣơng Nam
1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam.
Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại
một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc. Cây lúa
nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần
nhỏ. Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen.
Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc và
bản chất hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh
là do 1 chủng virus mới với tên gọi virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam. Nhóm virus
mới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lƣng trắng – một đặc điểm quan trọng và
khá đặc trƣng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus. Hình dạng, kích thƣớc và cấu

trúc đặc trƣng của các tiểu thể virus dƣới kính hiển vi điện tử có những đặc điểm rất
đặc trƣng. Toàn bộ trình tự gen của 2 biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã đƣợc
xác định. Các tính chất đặc trƣng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng nhƣ trình tự
axit amin của 2 biến chủng này có độ tƣơng đồng cao hơn hẳn so với sự sai khác giữa
các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nằm trong khoảng sai
khác khi so sánh giữa các chủng với nhau. Mặt khác, những khác biệt này lại gần gũi
hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV)
và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 của
nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các phân nhóm khác. Do đó, có thể nói
chính xác hơn rằng SRBSDV là 1 thành viên mới thuộc nhân nhóm 2 – cùng với
RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, họ Reoviridae. Việc đặt tên là lùn sọc
đen phƣơng Nam là do nhóm virus này có sự tƣơng đồng về triệu chứng bệnh trên cây
nhiễm, song virus lùn sọc đen tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virus
SRBSDV mới chỉ ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc [25,24,18]. Ngoài lúa và
ngô, virus SRBSDV cũng đƣợc xác định có thể nhiêm tƣ̃ ̣ nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ

5


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

lồng vƣc̣ (Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus
serotinus có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [7,42,22].
1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam
Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An , mô ̣t bê ̣nh la ̣ (bê ṇ h lùn lu ̣i ) đã xuất hiê ̣n
̃ ṇ h lên tới 5.506 ha, trong đó
trên diê ̣n rô ̣ng trên lú a mùa với tổng diê ṇ tích nhiêm bê
gần 3.510 ha bị mất trắng. Cây bê ṇ h bi ̣lùn ma ̣nh , lá xanh đậm , nhiều lá bi ̣xoắn vă ṇ ,

sau biến vàng, trỗ không thoát . Triê ụ chƣ́ng cây bê ṇ h khá giống với bê ̣nh lùn xoắn lá
tại miền Nam . Tất cả các giống gieo trồng ta ̣i Nghê ̣ An (TH3-3, Nhị ƣu 838, Bio404,
Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hƣơng thơm ) đều bị nhiễm bệnh [9]. Cho tới giƣ̃a
tháng 9, mô ̣t số đia phƣơng
ta ̣i miền Bắ
̣
̣ c nhƣ Nam Đinh , Thái Bì nh cũng thông báo
dịch bệnh tƣơng tự [2].
Báo cáo tại cuộc họp do bô ̣ Nông Nghi ệp và Phát Triển Nông Thôn
(NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo Vệ Thực Vật
(BVTV) đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc. Cục đã phát hiện 5 tỉnh có
diện tích lúa nhiễm bệnh gồm Ngh ệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh
Bình với trên 13 nghìn ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8 nghìn ha bị bệnh rất nặng, có
khả năng mất trắng [3].
Để làm rõ nguyên nhân gây bê ṇ h t ại Nghệ An, đặc biệt khi bệnh đang đƣợc
liên tu ̣c báo cáo xuất hiê ṇ ta ̣i nhiều tin̉ h miền Bắc , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đã
tổ chƣ́c hô ̣i thảo khẩn cấp về nguyên nhân gây bê ̣nh ta ̣i Nghê ̣ An do đích thân Bô ̣
trƣởng Cao Đƣ́c Phát chủ trì với sƣ ̣ tham gia của các chuyên gia đầu ngành cả nƣớc và
Tiến sĩ Rogelio , chuyên gia về bê ṇ h virus lúa của Viê ̣n nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI).
Dƣạ chủ yếu vào triê ụ chƣ́ng quan sát bê ̣nh trên thƣc̣ điạ và ý kiến chuyên gia , hô ̣i nghi ̣
kết luâ ṇ bê ṇ h lúa lùn lu ̣i ta ̣i Nghê ̣ An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn / lùn xoắn lá
giống nhƣ ở miền Nam với vector truyền bê ̣nh là rầy nâu . Các kết quảxét nghi ệm
ELISA trên các mâũ rầy nâu thu thâ ̣p đƣơ ̣c thƣ̉ nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm BVTV
phía Nam , Bô ̣ NN &PTNT và Cục BVTV v ẫn kết luâ ̣n nguyên nhân gây bê ṇ h lúa lùn
lụi ở miền Bắc là do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầy nâu lan truyền [4].

6


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

Trong tháng 9, 10 năm 2009, các hoạt động nghiên cứu nhằm xác đin h tác nhân
gây bê ṇ h đã đƣơ ̣c thƣc̣ hiê ̣n tić h cƣc̣ ta ̣i các cơ quan nhƣ Viê ṇ BVTV , Cục BVTV ,
Trƣờng ĐHNN Hà Nô ̣i và Viê ṇ Nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI). Kết quả nghiên cứu đã
xác định tác nhân gây bê ṇ h lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía bắc trong vụ mùa
2009 là do SRBSDV [9]. Ngay sau khi tác nhân gây bệnh đƣợc xác định, Bộ
NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch lùn sọc đen do thứ trƣởng Bùi
Bá Bổng làm trƣởng ban chỉ đạo.
Trong vụ mùa 2010, cũng theo thông báo của Cục BVTV, tính đến tháng 10,
bệnh lùn sọc đen cũng vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm
tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy
là 1.700 ha. Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm:
+ Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La,
Bắc Giang, Hải Dƣơng, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh; Hải Phòng, Hòa
Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hƣng Yên, Cao Bằng và Hà Nam.
+ Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị,
Hà Tĩnh và Thanh Hóa.
+ Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng.
Đến năm 2013, bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một
vài tỉnh thành. Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng
tái bùng phát thành dịch.
1.2.2. Đặc điể m b ệ nh h ọc của b ệ nh lùn s ọc đen phƣơng Nam
1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết
Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của
bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra. Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh bao
gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách
mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt
sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân. Các u sáp này đƣợc hình thành do sự phát triển vƣợt trội

7


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

cả về số lƣợng và kích thƣớc của mô mạch dẫn nhựa. Khi cây còn non gân chính trên
bẹ lá cũng bị sƣng phồng. Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thƣờng
nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định. Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u
sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân). Cây lúa bị bệnh
nặng không trổ bông đƣợc hoặc trổ bông không thoát, hạt thƣờng bị đen [11] (Hình 1).

Hình 1: Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam[11]
1.2.2.2. Vector truyền bệnh
Vector chính truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam là rầy lƣng trắng (Sogatella
furcifera). Cả rầy non và rầy trƣởng thành đều có khả năng truyền bệnh. Rầy lƣng
trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh
đến khi chết. Một nghiên cứu về phƣơng thức lan truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam
ở lúa đã đƣợc tiến hành nhằm đánh giá khả năng lan truyền virus SRBSDV qua vector
đã đƣợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lƣng trắ ng (Sogatella furcifera), rầy nâu
(Nilaparavata lugenes) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus). Kết quả cho thấy cả
rầy lƣng trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền SRBSDV tƣ̀ lúa sang lúa với
hiê ụ quả truyền rất cao (100 % cây nhiêm bễ ṇ h với chỉ 3 – 4 rầy/cây). Tuy nhiên, chỉ

8


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

có rầy lƣng trắng (Hình 2) mới có khả năng truyền SRBSDV tƣ̀ lúa sang ngô . Nghiên
cƣ́u này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đƣơ ̣c SRBSDV [36,38,39].

Rầy cánh dài

Rầy cánh ngắn

Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11]
Rầy lƣng trắng gây hại cùng với rầy nâu nhỏ, nhƣng trong cùng một lứa thì rầy
lƣng trắng phát sinh rộ sớm hơn. Rầy lƣng trắng thƣờng có mật độ cao, gây hại nặng
vào giai đoạn lúa làm đòng. Cũng nhƣ rầy nâu, rầy lƣng trắng thích hợp với điều kiện
khí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở vùng Đồng bằng sông Hồng, một
năm có 6-7 lứa rầy, quan trọng nhất là lứa rầy vào tháng 4 (vụ xuân) và cuối tháng 8
đầu tháng 9 (vụ mùa). Vụ xuân thƣờng gây hại nặng hơn vụ mùa. Rầy lƣng trắng hại
nặng trên các giống lúa nhiễm rầy, lúa lai; nếu thâm canh cao, bón nhiều đạm, ruộng
lúa cấy dày, rậm rạp là điều kiện cho rầy lƣng trắng phát sinh, phát triển. Rầy lƣng
trắng phân bố rộng rãi trên khắp các vùng trồng lúa của Việt Nam và trên thế giới, có
khả năng du nhập và di chuyển rất cao [7].
Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lƣng trắng Sogatella
furcifera đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn
phát triển của bệnh cũng nhƣ tìm phƣơng pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Bằng
phƣơng pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định đƣợc sự có mặt của virus
SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S. furcifera, bao gồm cả
giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S. furcifera khi đã nhiễm virus
SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại. Tuy
nhiên, virus SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng. Mỗi cá thể rầy S. furcifera
mang virus SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90

cây lúa. Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lƣng trắng truyền virus cho cây lúa non

9


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

tƣơng ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy. Kết
quả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm virus
SRBSDV từ rầy nâu lƣng trắng nhất[29].
Ngoài cây lúa, virus SRBSDV còn gây hại trên ngô, cỏ lồng vực, cỏ chát, cỏ
đuôi phụng, vì các cây này là vật chủ của rầy lƣng trắng và cũng là nguồn chứa virus
để rầy lƣng trắng truyền sang cây lúa. Bệnh cũng có thể lƣu tồn trên lúa chét của cây
lúa bị bệnh trƣớc đó. Virus gây bệnh tồn tại trong cơ thể rầy lƣng trắng sống qua mùa
đông hoặc di chuyển rất xa theo gió và bão để gây bệnh cho lúa và một số loài cây
khác ở các vùng khác hoặc vụ tiếp theo [29].
1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV
1.2.3.1. Phân loại
Dựa trên các phân tích phân tử, virus SRBSDV đƣợc xếp là một thành viên
mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae.
Họ Reoviridae: Các virus thuộc họ Reoviridae (đƣợc gọi chung là các Reovirus)
đƣợc đặc trƣng bởi có bộ gene RNA sơ ̣i kép (dsRNA), phân đoạn bao gồm 10 đến 12
phân tử RNA sợi kép mạch thẳng. Tất cả các phân tử RNA đều đƣợc lắp ráp trong cùng
một phân tử virus hình cầu. Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ. Trong số 12
chi của họ, có tới 8 chi hại ngƣời và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực
vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus)), (2) Oryzavirus
(ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus), (3) Fijivirus (ví dụ virus
lúa lùn sọc đen RBSDV (Rice black streaked dwarf virus))[30].

Chi Fijivirus: Các virus thuộc chi Fijivirus đƣợc đặc trƣng bởi có phân tử virus
hình khối đa diện đối xứng 20 mặt (icosahedral) và nhìn dƣới kính hiển vi điện tử có
dạng hình cầu, kích thƣớc 65-70 nm. Phân tử virus có cấu trúc phức tạp, gồm 2 lớp vỏ
(với lớp vỏ ngoài có số tam giác T = 13 còn lớp vỏ trong có T = 2). Trên bề mặt phân
tử, ở mỗi lớp vỏ đều có 12 gai vỏ (Hình 3)
Tất cả các Fijivirus đã biết đều có b ộ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA sợi

10


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

kép, mạch thẳng. Các phân tử RNA này có kích thƣớc dao đô ̣ng tƣ̀ 1,4 kb đến 4,5 kb và
đƣơ ̣c đă ̣t tên lần lƣơ ̣t tƣ̀ S 1 đến S 10 theo tốc đô ̣ di chuyển khi đi ện di PAGE
(Polyacrylamide). Các phân tử RNA genome đều mã hóa cho 1 gen, ngoại trừ phân
đoạn 7 và 9 mã hóa 2 gen (Hình 4) [30].

Hình 3.Cấu trúc phân tử các Fijivirus [30]
Đối với các Fijivirus, phần lớn chức năng của các gen chƣa đƣợc nghiên cứu
ngoại trừ gen VP10 (trên phân đoạn S10) mã hóa protein tạo gai vỏ của virus và VP1
(trên phân đoạn S1) mã hóa cho protein tái bản của virus là RdRp (RNA dependent
RNA polymerase) [30].

Hình 4.Tổ chức bộ gen của các Fijivirus [30]

11

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

Chi Fijivirus là 1 trong 3 chi gây hại thực vật thuộc họ Reoviridae. Hiện nay, chi
Fijivirus đƣợc ghi nhận gồm 9 loài trong đó Fiji disease virus (FDV) là loài điển hình.
Ngoài ra, căn cứ vào mức đồng nhất của bộ gen, các Fijivirrus lại đƣợc chia thành 5
nhóm (phụ lục 2) [10].
Nhóm Fijjivirus-2 là nhóm lớn nhất trong chi Fijjivirus, gồm MRCV, PaSV,
RBSDV và SRBSDV (phụ lục 2), các thành viên của nhóm Fijjivirus-2 có nhiều đặc
điểm di truyền và sinh học tƣơng đồng hơn hẳn so với 5 nhóm còn lại trong chi
Fijjivirus.
1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV
Virus SRBSDV có hình thái điển hình của chi Fijivirus là dạng hình cầu đa diện đối
xứng icosahedral [38] Đƣờng kính lớp vỏ ngoài là ~ 70 nm, trên bề mặt vỏ ngoài có 12
gai ngắn gắn trên 12 đỉnh của hình đa diện icosahedra kiểu T=13. Hình đa diện
icosahedra T=13 cấu tạo từ 60 mặt tam giác, mỗi mặt tam giác là 13 phân tử protein,
tạo thành 12 pentamer tƣơng đƣơng với 120 capsomer lục giác (Hình 5) [15].

Hình 5:Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 [ 41]
1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV
Theo một nghiên cứu về SRBSDV gây bệnh ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, virus
SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae. Hệ

12


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến
4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA
sợi đôi (Hình 6). Phân đoạn S1 có chiều dài 4500 bp, mã hóa một polypeptide (chứa
các vùng chức năng của enzym RNA polymerase) có trọng lƣợng phân tử 169 kDa.
Phân doạn S2 có chiều dài 3815 bp, chứa một ORF mã hóa một protein vỏ virus có
trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác định rõ chức năng). Phân đoạn S3 có chiều dài
3618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác
định rõ chức năng) và có điểm đẳng điện Pi là 5,96. Phân đoạn S4 có chiều dài 3618
bp, chứa một ORF mã hóa một protein có vùng trình tự từ acid amin 608 – 786 tƣơng
đồng 22 – 25% với các thành viên khác của reovirus. Phân đoạn S5 có chiều dài 3167
bp, chứa một ORF chính và một ORF mã hóa một protein (chƣa xác định rõ chức
năng) trọng lƣợng phân tử 24 kDa chồng lên ORF chính. Phân đoạn S6 có chiều dài
2651 bp, mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 90 kDa và có điểm đẳng điện
4,89. Đây là phân đoạn có sự khác biệt lớn nhất về trình tự nucleotide so với các thành
viên trong phân nhóm Fijivirus-2 (70,6% tƣơng đồng so với RBSDV và 62,4% tƣơng
đồng so với MRCV). Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF có chiều dài
1073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5
kDa và 36,4 kDa. Phân đoạn S8 có chiều dài 1928 bp, chứa một ORF có chiều dài
1776 nucleotide mã hóa protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 67.9 kDa. Phân
đoạn S9 có chiều dài 1899 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1044 và 630 bp, mã hóa hai
protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 39,9 kDa và 24,2 kDa. Phân đoạn S10 có
chiều dài 1797 bp, chứa một ORF có chiều dài 1674 nucleotide mã hóa protein hiǹ h
thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus có tr ọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 62,6 kDa và
36,4 kDa. [37,22]. Trong một nghiên cứu khác, hệ gen virus SRBSDV gây bệnh trên
lúa ở tỉnh Hải Nam Trung Quốc đã đƣợc phân lập và giải trình tự. Kết quả là trình tự
nucleotide của hai phân đoạn S9 và S10 có độ tƣơng đồng 98-99% so với chủng Quảng
Đông [22]. Nếu so sánh toàn bộ hệ gen thì hai chủng virus SRBSDV ở Quảng Đông và
Hải Nam có độ tƣơng đồng >97%. Nếu so sánh với các thành viên của phân nhóm

13


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

Fijivirus-2, hai chủng virus này chỉ có độ tƣơng đồng ở mức độ amino acid là 77-78%
so với RBSDV, 65% so với MRCV và 44% so với Fiji disease virus (FDV) [23]. Nhƣ
vậy sau 25 năm kể từ khi dịch virus lùn sọc đen bùng phát lần cuối cùng tại Trung
Quốc vào năm 1975, trình tự nucleotid của hệ gen virus lùn sọc đen đã thay đổi hơn
20%.

Hình 6: Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV trên gel
polyacrylamide 12,5%[37].
1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV
SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae.
Hệ gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8
đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn
RNA sợi đôi [17]. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF không chồng gối
lên nhau: ORF 7-1 có chiều dài 1073 và ORF 7-2 có chiều dài 930 nucleotide lần lƣợt
mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5 kDa và 36,4 kDa [33].
Phân đoạn S7 có phần không dịch mã ở đầu 5„ dài 40bp, phần không dịch mã ở
đầu 3„ dài 81bp và vùng intron dài 51bp, trình tự bảo thủ ở hai đầu S7 là 5‟AAGTTTTT và CAGCTGATGTC-3„. Ngoài ra, SRBSDV tồn tại đặc điểm đặc trƣng

14