Nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men sản xuất sinh khối SACCHAROMYCES CEREVISIAE từ phế thải chứa tinh bột sóng xử lý bởi đa ENZYME

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT
SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE TỪ PHẾ THẢI CHỨA
TINH BỘT SỐNG XỬ LÝ BỞI ĐA ENZYME

Giáo viên hướng dẫn

: Ts. Vũ Văn Hạnh

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Hoa

Lớp

: CNSH-11-03

HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học,
Viện Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em kiến thức quý báu trong quá
trình học tập và rèn luỵên tại trường, đặc biệt là các thầy cô Chủ nhiệm khoa
và Văn phòng khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô đã luôn tạo điều kiện và
giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tớiT.S Vũ Văn Hạnhvà mọi người trong
phòng Các Chất chức Năng Sinh Học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người đã tận tình chỉ bảo,
hướng dẫn cho em, trực tiếp giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm để có
thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này đúng thời gian quy định.
Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người
thân và bạn bè, đã quan tâm chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành tốt nhiệm vụ được giao trong quá trình học tập và thực nghiệm hoàn
thành khóa luân này.

Hà Nội, tháng 5/2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Hoa

Nguyễn Thị Hoa

i

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần có trong bã thải sắn
Bảng 3.1: Dựng đường chuẩn glucose 0.1%
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ enzym trong quá trình đường hóa
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân tinh bột
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân
Bảng 3.5: Ảnh ng của thời gian trong quá trình thủy phân
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân tinh bột của chủng A13
Bảng 3.7: Nghiên cứu điều kiện tối ưu sản xuất sinh khối nấm men

Nguyễn Thị Hoa

ii

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1: Giống được hoạt hóa trên đĩa thạch
Hình 3.2: Giống cấp 2
Hình 3.3: Đồ thị đường chuẩn glucose
Hình 3.4: Biểu đò thể hiện ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Hình 3.6: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian trong quá trình thủy phân
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình thủy phân

Nguyễn Thị Hoa

iii

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. iii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 3
PHÂN 1 TỔNG QUAN. ................................................................................ 5
1.1. TÌNH HÌNH CHẾ BIẾN TINH BỘT VÀ CHẤT THẢI TỪ CHẾ BIẾN
TINH BỘT HIỆN NAY ................................................................................. 5
1.1.1. Tình hình chế biến tinh bột ............................................................. 5
1.1.2. Thành phần có trong bã thải ............................................................ 6
1.2 ENZYM THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG (AMYLASE) ....................... 7
1.2.1 Giới thiệu Amylase............................................................................. 7
1.2.2 Enzyme α-amylase (α-1,4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1):.................. 7
1.2.3 Enzyme ɣ-amylose (glucoamylase) (EC 3.2.1.3): ............................. 10
1.3 NẤM MEN SACCHAROMYCES CERIVISIAE ...................................... 11
1.3.1 Giới thiệu chung về nấm men ........................................................... 11
1.3.2 Saccharomyces cerevisiae. ............................................................... 15
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16

2.1 NGUYÊN- VẬT LIỆU........................................................................... 16
2.1.1 Nguyên - Vật liệu ............................................................................. 16
2.1.2 Thiết bị máy móc.............................................................................. 16
2.1.3 Môi trường nuôi cấy ......................................................................... 17
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 17
2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống vi sinh vật ........................................... 17
2.2.2 Phương pháp nhân giống cấp 1, cấp 2............................................... 17
2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính Enzym theo Miller (1959). ............. 18

Nguyễn Thị Hoa

1

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.4 Xác định mật độ nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa
petri. .......................................................................................................... 19
PHÂN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 20
3.1 HOẠT HÓA GIỐNG VÀ NHÂN GIỐNG CẤP 1, CẤP2 ...................... 20
3.1.1 Hoạt hóa giống ................................................................................. 20
3.1.2 Nhân giống cấp1, cấp 2 .................................................................... 21
3.2 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIÊN THÍCH HỢP CHO QUÁ
TRÌNH DỊCH HÓA TINH BỘT .................................................................. 22
3.2.1 Dựng đường chuẩn glucose .............................................................. 22
3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong quá trình thủy phân23

3.2.3 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân ........................ 24
3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân 25
3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân .......... 26
3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân. .................... 27
3.3 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU LÊN MEN SẢN
XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN .................................................................. 28
KẾT LUẬN.................................................................................................. 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 31

Nguyễn Thị Hoa

2

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nông nghiệp lâu đời, trong đó chăn nuôi là một ngành
quan trọng của nông nghiệp hiện đại, nuôi lớn vật nuôi để sản xuất những sản phẩm
như: thực phẩm, lông và sức lao động. Sản phẩm từ chăn nuôi cung cấp lợi nhuận
và phục vụ cho đời sống sinh hoạt của con người. Chăn nuôi xuất hiện lâu đời trong
nhiều nền văn hóa kể từ khi con người chuyển đổi từ lối sống săn bắn hái lượm sang
định canh định cư.
Trước kia chăn nuôi chỉ diễn ra trong hình thức nhỏ lẻ, hộ gia đình. Ngày nay,
việc phát triển công nghiệp hóa, Hiện đại hóa đất nước các trang trại chăn nuôi quy
mô được hình thành. Bên cạnh phát triển chăn nuôi thì nguồn thức ăn đóng vai trò

quan trọng.
Trong nhiều năm qua nước ta có thế mạnh trong xuất khẩu nông sản, song
ngành chăn nuôi lại trong tình trạng thiếu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Theo tổng hợp kết quả sản xuất nông nghiệp của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn. Tính chung cả 2 tháng đầu năm 2015 tổng giá trị nhập khẩu tất cả
nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi 496 triệu USD so với 438 triệu USD 2 tháng đầu
năm 2014, nhập khẩu tăng 13,2% về giá trị kim ngạch. Mà giá nhập khẩu các
nguyên liệu giảm cũng là nguyên nhân khiến nhập khẩu thức ăn gia súc và nguyên
liệu tăng cao trong 2 tháng đầu năm 2015.
Nước ta được biết đến là một trong những nuớc có nền nông nghiệp phát triển,
chủ yếu trồng cây lương thực. Và sắn là cây lương thực có sản lượng lớn thứ hai sau
cây lúa và đang có xu hướng tiếp thục tăng về sản lượng và diện tích. Sắn được
dùng làm nguyên liệu cho chế biến tinh bột. Bã sắn là phụ phẩm của quá trình chế
biến tinh bột. Trong bã sắn chứa nhiều tinh bột, tuy vậy người dân vẫn chưa tiếp cận
được với nguồn nguyên liệu này do chưa biết giá tri dinh dưỡng của chúng. Vì vậy
lượng bã thải ra không được tiêu thụ hết, được thải trục tiếp ra môi trường, tồn đọng
ở các ao, mương rãnh lâu ngày bị phân hủy tạo mùi hôi thối gây ô nhiễm môi

Nguyễn Thị Hoa

3

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

trường. Sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi là giải pháp có thể khắc phục vấn đề

trên.
Tuy bã sắn có chứa nhiều tinh bột nhưng chưa thực sự tốt cho đông vật. Vì thế
cần bổ sung nguồn nấm nem để tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn. Hàm lượng
protein trong nấm men đạt 40-60%, với acid amin không thay thế gần giống protein
của động vật. Nấm men cung cấp vitamin B tự nhiên phong phú, chứa nhiều
enzyem kích tố có ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất nhưng không gây độc hại
cho cơ thể. Thành phần khoáng trong nấm men rất đa dạng với tỷ lệ phù hợp với
nhu cầu và khả năng hấp thụ và chuyển hóa của động vật.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài với
mục đích: nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình lên men tăng sinh khối
của nấm men và tìm ra điều kiện tối ưu lên men sản xuất sinh khối nấm men cao
sản.

Nguyễn Thị Hoa

4

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHÂN 1 TỔNG QUAN.
1.1.

TÌNH HÌNH CHẾ BIẾN TINH BỘT VÀ CHẤT THẢI TỪ CHẾ BIẾN
TINH BỘT HIỆN NAY

1.1.1. Tình hình chế biến tinh bột
Theo số liệu của tổng cục Hải quan, năm 2013 xuất khẩu sắn và các sản phẩm
của sắn đạt 3,1 triệu tấn với kim ngạch1,1 tỷ USD , giảm 25,7% về lượng và giảm
16,8% về kim ngạch so với năm 2012. Năng xuất sắn của Việt Nam hiện nay đứng
khoảng thứ 10 trong số các quốc gia năng xuất cao, với năng xuất 17,6 tấn/ha (theo
số liệu của Tổng Cục Hải Quan, 2013)
Số liêu thống kê cũng cho ta biết, diện tích trồng sắn của cả nước có 560 nghìn
ha, với tổng sản lượng đạt gần 9,4 triệu tấn. 30% sản lượng thu được phục vụ nhu
cầu tiêu dùng trong nước phục vụ làm lương thực, chế biến thức ăn chăn nuôi, công
nghiệp dược phẩm, làm nguyên liệu sản xuất xăng sinh học…70% được xuất khẩu
với dạng tinh bột hoặc sắn lát khô. Xuất khẩu sắn và sản phẩm từ sắn của Việt Nam
dứng thứ 2 trên thế giới, chỉ sau Thái Lan và đã có mặt tại các quốc gia trong khu
vực Chấu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, …(theo số liệu của Tổng Cục Thống Kê,
2013)
Toàn quốc hiện có 8 nhà máy chế biến tinh bột sắn và sản xuất cồn với tổng
cộng suất ước tính khoảng 7 triệu tấn củ tươi/năm và 6 nhà máy chế biến nhiên liệu
sinh học (ethanol) đang được triển khai, tạo thuận lợi cho sản xuất sắn. Các nhà
máy này có địa điểm xây dựng trải rộng trên toàn quốc, thuận lợi cho việc thu mua
nguyên liệu và giảm chi phí vận chuyển. Ngoài ra còn có trên 400 cơ sở chết biến
sắn lát, tinh bột sắn thủ công có công suất 10 tấn củ tươi/ngày nằm rải rác ở hầu hết
các tỉnh trồng sắn, chủ yếu ở các tỉnh Tây Ninh, Đồng Nai. Sắn và mặt hàng từ sắn
là mặt hàng nóng trong những năm qua và phụ thuộc vào nhu cầu nhập khẩu của
các nước (Tổng Cục Thống Kê, 2013).
Bên cạnh chế biến tinh bột sắn tạo ra một lượng lớn bã thải sau chế biến. Nó
chiếm khoảng 45% so với khối lượng sắn nguyên củ (Bùi Quang Tuấn, 2005). Nhà

Nguyễn Thị Hoa

5

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

máy tinh bột sắn Phong An (Thừa Thiên Huế) cho biết vào vụ thu hoạch có khoảng
100-150 tấn bã sắn thải ra mỗi ngày.
Việc nghiên cứu và sử dụng bã sắn vẫn còn hạn chế vì thế vẫn còn tình trạng
thải ra môi trường không qua xử lý gây ô nhiễm môi trường.
1.1.2. Thành phần có trong bã thải
Trong bã sắn tươi chứa khoảng 8% tinh bột, 15-20% chất xơ thô (Bùi Quang
Tuấn, 2005).
Bảng 1.1: Thành phần có trong bã thải sắn
Giá trị

Thành phần
pH

4,21

HCN (mg/kg DM)

240

HCN (mg/kg vật chất tươi)

26,9

DM (% vật chất tươi)

11,2

OM (% DM)

97,2

CP (% DM)

3,6

EE (% DM)

0,3

NDF (% DM)

31,2

Ash (% DM)

2,8

GE (Kcal/kgDM)

4180

Phương pháp phân tích vật chất khô (DM), vật chất hữu cơ (OM), protein thô
(CP), mỡ thô (EE), và khoáng tổng số (Ash) theo AOAC (1990). Xơ không hòa tan

trong chất tẩy trung tính (NDF) được xác định theo Van Soest và cộng sự (1991).
Năng lượng tổng số (GE) được xác định bằng Bomb Calorimeter
Nguyễn Thị Hoa

6

(Bomb

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Calorimeter 6300, Parr Instrument Company), pH được đo bằng pH meter (Sension
3, HACH Company, USA), HCN được phân tích theo phương pháp của Easley và
cộng sự (1970)
1.2 ENZYM THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG (AMYLASE)
1.2.1 Giới thiệu Amylase
Amylase là một hệ enzym rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzym này
thuộc nhóm enzyme thủy phân tinh bột, xúc tác phân giải các liên kết nội phân tử
trong nhóm polysacchride với sự tham gia của nước (công nghệ enzyem, Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
RR’ +H-OH

→ RH +R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin hạn chế. Các enzym Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin),

trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn,
nấm men và vi khuẩn. Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này
hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin)
(Leuchs, 1851). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide
làm cơ chất cho quá tình lên men bởi nấm men.
Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công
nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực khác, đặc biệt trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Các loại Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt
động và tính ổn định nhiệt. Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt
độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau
sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác
nhau. Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt
động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.
1.2.2 Enzyme α-amylase (α-1,4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1):
a) Cấu tạo

Nguyễn Thị Hoa

7

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

α-amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000
đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-amylase từ loài vi khuẩn
Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết

rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-amylase nhưng chỉ có hai loại là takaamylase từ Apergillus orysee và α-amylase của tụy lợn được nghiên cứu về hình thể
không gian cấu bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch
acid amin và về vùng kỵ nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các
enzyme α-amylae đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau (trích từ Huỳnh Thị Mỹ
Duyên, 2009).
b) Cơ chế tác dụng của α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau. α-amylase có khả
năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất
(tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. αamylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà còn thủy phân cả hạt tinh bột sống với
tốc độ chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
• Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ
tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
• Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy
phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không màu với iodine. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disacharide và monosacchride dưới
tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này bị phân cắt
tạo nên các mạch polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến
maltotetrose, maltotriose, maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm
thủy phân của amylose chưa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của αamylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhau nhưng vì không cắt được
liên kết α-1,6-glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù
Nguyễn Thị Hoa

8

YTMT_11-03

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên thì còn
có dextrin phân tử thấp và isomaltose(8%) (Trần Đỗ Quyên, 2005).
c) Đặc tính của α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hơp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein
giàu trytosine, α-amylase, acid glutamic và aspartic.
Enzyme :
• α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 góc cystenine.
• Trọng lượng phân tử của α-amylase của nấm mốc là 45.000-50.000 Da (
Knir,1956; Fisher, Stein, 1960)
• Amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối và rượu loãng.
• Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH= 4,2 - 5,7 (Bernfild, 1951).
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1- 30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia
vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của
enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca còn đóng ai trò duy trì sự tồn tại của enzyme
khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzym phân giải
protein.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn.
Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi
tỉ lệ là 1: 3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953).
α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6-glucoside của
amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây
là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới
hạn phân nhánh.

Nguyễn Thị Hoa

9

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của α-amylase nấm
sợi chủ yếu la maltose, maltotriose.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau.
pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0- 4,8. pH tối thích cho
hoạt động dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ Aspergillus orysee trong vùng 5,6 –
6,2 (liphins). Độ bền với dung dịch acid cũng khác nhau. Α-amylase của Aspergillus
orysee bền vững với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn B.subtilis. Ở
pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase
vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi
dường như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm với tác động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991).
1.2.3 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3):
a) Cấu tạo
Glucoamylase là những anzyme có thể thủy phân được cả liên kết của các mạch
α-glucan để giải phóng ra dạng β (EC 3.2.1.3).
Glucoamylose được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc

Aspergillus, penicillium và Rhizopus.
Glucoamylose từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lớn dao động
rất lớn 27.000 đến 112.000 Dal tùy thuộc vào nuồn gốc của enzyme (Huỳnh Thị Mỹ
Duyên, 2009).
Glucoamylose đều chứa các gốc methionin, tritophan, và một nửa gốc cystein.
Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của
enzyem vẫn chưa được làm rõ.
b) Cơ chế hoạt động

Nguyễn Thị Hoa

10

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Amynoglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thủy phân lặp
lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch glucan từ đầu không khử, chúng cũng thủy
phân được liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (Huỳnh Thị Mỹ Duyên, 2009).
Tốc độ thủy phân cũng phụ thuộc và bản chất của các liên kết cận với các liên
kết glucozit được thủy phân, cũng như kích thước và cấu trúc của cơ chất bị thủy
phân. Nhất là với các α-glucan mạch dài thì bị thủy phân nhanh hơn là các
maltodextrin và các oligosaccharit.
c) Tính chất.
Glucoamylase phân hủy tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục
tách gốc glucose và cuối cùng tạo thành glucose mà không cần có một enzyme

amylase nào khác. Nó có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysaccharide
đồng loạt ở các mối liên kết α-1,4-glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong sản xuất
rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men được về phân tử thấp và
do đó nâng cao hiệu xuất nấu rượu từ tinh bột (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Glucoamylase của Asperillus có pH tối ưu trong vùng có pH 3,0-6,0 và nhiệt độ
55-60oC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone
và không được bảo vệ bởi Ca2+ (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
1.3 NẤM MEN SACCHAROMYCES CERIVISIAE
1.3.1 Giới thiệu chung về nấm men
a) Định nghĩa
Nấm men là tên chung để chỉ nhũng nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng
lẻ hoặc thành từng đám, không di đông và sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy trồi
(Lương Đức Phẩm, 2005).
Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, lương thực thực
phẩm…đặc biệt có nhiều trong quả chín, ngọt.
Nấm men thường có dạng hình trứng, bầu dục, hình tròn, hình dài. Hình dạng
và kích thước của nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dưỡng.
Nguyễn Thị Hoa

11

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

b) Vai trò của nấm men
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu protein,

lipit và vitamin. Chúng có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong
điều kiên hiếm khí, còn trong điều kiên hiếu khí cũng có khả năng tăng nhanh về
sinh khối (Vương Thị Hồng Vi, 2007).
Trong quá trình trao đổi chất của hấu hết các nấm men đều không sinh ra chất
độc gây hại cho sức khỏe con người và động vật. Chúng được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất rượu bia, thức ăn chăn nuôi…(Vương thị
Hồng Vi, 2007).
c) Đặc điểm sinh lý, hóa của nấm men
Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp như một cơ thể hiếu khí
bậc cao, khi môi trường hết oxyl phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là
qua trình lên men. Khi phản phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản
của nấm men bị kìm hãm và đến giai đoạn nhất định thì không còn nữa.
Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế
bào và sau đó khuếch tán vào bên trong tế bào. Màng tế bào và lớp bao bọc nguyên
sinh chất của tế bào đóng vai trò là màng bán thấm ngăn cách, điều hòa các chất
dinh dưỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài.
Các nguồn dinh dưỡng: Cacbon, nitơ, nguyên tố vô cơ (Lương Đức Phẩm,
2005).
d) Sinh trưởng và phát triển của nấm men
Sinh trưởng và phát triền của nấm men diễn ra qua 4 giai đoạn (Vương Thị
Hồng Vi, 2007):
Giai đoạn thích nghi:
Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc bắt đầu sinh sản. Ở
giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới.
Nguyễn Thị Hoa

12

YTMT_11-03

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái
và sinh lý, kích thước tăng lên đán kể và chúng trở nên nhạy cảm với tác động bên
ngoài. Số lượng tế bào nấm men không tăng lên hoặc tăng lên không đáng kể.
Giai đoạn logarit:
Số lượng và sinh khối nấm men trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân. Khả
năng thích ứng với điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên rõ rệt,
đồng thời xuất hiện chức năng lên men rượu.
Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản và thời gian nảy chồi.
Giai đoạn ổn định:
Số lượng tế bào trong giai đoạn này không tăng lên nữa, có thế do sự cân bằng
giữa số sinh và chết đi. Song kích thước tế bào nấm men tăng lên rõ rệt. Quá trình
lên men rượu bắt đầu.
Giai đoạn thoái hóa:
Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu hủy. Lượng protein và acid
nucleic giảm xuống, glycogen và traeganose hoàn toàn tiêu biến.
e) Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy
thu sinh khối tế bào
Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn cacbon, nitơ,
phospho, và một số nguyên tố vi lượng khác: K, Ca, Mg và vitamin.
Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuẩt sinh khối nấm men rất tốt.
Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số lượng nấm men có thể đạt hàng
chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy (Nấm men chăn nuôi lợn, 1970).

Nguyễn Thị Hoa

13

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Môi trường rỉ đường hoặc dịch đường được acid hóa với pH=4, bổ sung thành
phần ding dưỡng và duy trì nhiệt độ 25-30oC, số lượng tế bào nấm men đạt khoảng
25-50g/l (Trần Minh Tâm, 2002, trích từ Nguyễn Thị Hồng Phương, 2006).
Nấm men có khả năng sử dụng môi trường kiềm sulfit thành phần chủ yếu là
đường. Người ta tính được rằng khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ
thải ra một lượng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180kg đường. Dịch này hấp thụ
nhiều oxyl nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60%
(Lương Đức Phẩm, 2005).
Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật có khỏa nhiệt độ tối ưu sinh trưởng và phát triển của chúng.
Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28-30oC, trên 43oC và dưới 28oC thì sự
sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn (Vương Thị Hồng Vi, 2007).
Ở 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces cerevisiae 23 lần, ở 35-38oC chúng phát triển nhanh hơn 6-8 lần.
Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh, còn ở nhiệt độ thấp khoảng
20-23oC, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn.
pH của môi trường.
pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5-5,6. Ở pH=4, tốc độ tích lũy sinh khối
giảm, pH=3-3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh
dưỡng của tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị
ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm

ngoài khoảng đó (Vương Thị Hồng Vi, 2007).
Tốc độ sục khí và khuấy trộn.
Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch lên men liên tục bão hòa oxyl hòa
tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống
của tế bào nấm men. Oxyl không khí di chuyển vào trong tế bào nấm men trải qua
hai giai đoạn: oxly hòa tan vào môi trường nuôi cấy sau đó được nấm men hấp thụ
Nguyễn Thị Hoa

14

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

vào trong tế bào. Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,746 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đường,
nhưng thực tế chỉ một phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn
lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường
(Lao Thị Nga, 1987).
1.3.2 Saccharomyces cerevisiae.
a) Định nghĩa
Saccharomyces cerevisiae là một loại nấm men được biết đến nhiều nhất có
trong bánh mì nên thường được gọi là nấm men bánh mì. Nấm men bánh mì là một
loài vi sinh vật thuộc chi sacharomices lớp Ascomycetes ngành nấm. Loại này có
thể xem như một loại nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người hàng ngàn năm
trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và
bia.
b) Đặc điểm hình thái

Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có
kích thước nhỏ từ 3-6 đến 5-12 µm. Sinh sản bằng cách nảy chồi và tạo bào tử
(Meyen, 1938).
Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose,
saccharose, maltose như nguồn cacbon và sử dụng axit amin và muối amon làm
nguồn nitơ.
c) Lịch sử hình thành
Con người biết về nấm men S.cerevisiae và những tính chất của nó mới được
hơn 150 năm. Đến đầu thế kỷ 19, nấm men bia (nấm men thải từ nhà máy rượu bia)
đã được con người sử dụng làm nấm men bánh mì. Cuối thế kỷ 19, nhiều cải tiến kỹ
thuật hệ thống thông khí (nước Anh), kỹ thuật tách ly tâm để tách tế bào nấm men
khỏi môi trường tăng trưởng (Mỹ) đã được dùng để sản xuất nấm men bánh mì.

Nguyễn Thị Hoa

15

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN- VẬT LIỆU
2.1.1 Nguyên - Vật liệu
Chủng saccharomyces cerevisiae thuộc phòng Các Chất Chức Năng Sinh Học.
Bã sắn lấy từ làng nghề sản xuất tinh bột Cát Quế, Hà Tây, Hà Nội.
Chế phẩm enzym của phòng Các Chất Chức Năng sinh Học (chế phẩm enzym

từ chủng Aspergillus orysee (chủng A13)).
Các hóa chất dùng trong thí nghiêm.
•

Cao nấm men

•

Agar

•

Dextrose

•

Pepton

•

Glucose 1%

•

Hồ tinh bột

•

Enzym A13

•

DNS

•

Đệm

2.1.2 Thiết bị máy móc
•

Cân điện tử sartorius (Đức)

•

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

•

Máy lắc Beckman (Đức)

•

Máy li tâm (Đức)

•

Máy đo OD (Pháp)

•

Tủ ấm (Hungarry)

•

Máy Voltex ( Đức)

•

Nồi khử trùng Beckman (Đức)

•

Bếp từ

•

Các dụng cụ thí nghiệm khác: pipet, ống nghiệm, đĩa

petri...
Nguyễn Thị Hoa

16

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2.1.3 Môi trường nuôi cấy
a) Môi trường nhân giống chủng nấm men S.cerevisiae (gam/lit):
• Cao nấm men

10

• Pepton

5

• Dextrose

10

• Agar

20

Môi trường pha xong được đổ và bình, khử trùng ở 115oC áp suất 0,8 trong
30 phút bằng nồi khử trùng.
a) Môi trường lên men lỏng.
• Cao nấm men

10

• Pepton

5

• Dextrose

10

Môi trường sau khi pha được đổ vào các bình tam giác, khử trùng ở 115oC,
trong 30 phút bằng nồi khủ trùng.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống vi sinh vật
Chủng nấm men được giữ trong ống nghệm (giữ ở -20 oC) được hoạt hóa
trên môi trường thạch. Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện ria trên đĩa petri có
chứa sẵn môi trường thạch. Nuôi trong tủ ấm 28oC trong hai ngày.
2.2.2 Phương pháp nhân giống cấp 1, cấp 2
Nhân giống cấp 1.
–

Hút 3ml dịch môi trường đã khử trùng vào các ống penicilin. Sử dụng
que cấy đầu tròn lấy khuẩn lạc từ đĩa giống cho vào ống penicilin.

–

Lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 1 ngày.

Nhân giống cấp 2.

Nguyễn Thị Hoa

17

YTMT_11-03

Viện Đại Học Mở Hà Nội
–

Khóa luận tốt nghiệp

Giống cấp 1 sau khi lắc được cấy chuyển sang bình tam giác nuôi ở
28oC, 200 vòng/phút, trong 2 ngày.

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính Enzym theo Miller (1959).
Phương pháp dựng đường chuẩn glucose
Glucose (µl)

0

20

40

60

80

100

Nước cất khử

100

80

60

40

20

0

100

100

100

100

100

100

800

800

trùng (µl)
DNS

Lắc đều, ủ 100oC trong 5 phút và để nguội ở nhiệt độ phòng
Nước cất khử

800

800

800

800

trùng (µl)

Thực hiện đo OD ở 540nm.
Xử lý chế phẩm đa Enzym trong phòng thí nghiệm.

1 gam enzym thô + 9ml đệm CH3COONa
Ngâm+ vontex trong 1giờ
Ly tâm thu dịch nổi

Nguyễn Thị Hoa

18

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Bảng 2.1: Phương pháp test Enzym của chủng A13

Blank

test

Dịch Enzyme(µl)

0

50

Cơ chất(µl)

50

50

100

100

50

0

800

800

ủ ở các nhiệt độ khác nhau

DNS(µl)
Dịch enzyem(µl)
o

Đun 100 C trong 5 phút
Nước cất(µl)

Thực hiện đo OD ở bước sóng 540nm.
2.2.4 Xác định mật độ nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa
petri.
Thực hiên pha loãng dịch lên men: hút vào mỗi ống nghiệm 9ml dịch pha
loãng. Hút 100µl dịch lên men vào ống thứ nhất thực hiện vontex. Tiếp tục hút
1ml từ ống thứ nhất sang ống hai, vontex. Lần lượt thực hiện tương tự với các
ống tiếp theo.
Sau khi đã thực hiện pha loãng thì ta dùng petri đã vô khuẩn lấy 0,1ml dịch
huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch. Sau đó sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh để
dàn đều các tế bào trên đĩa thạch (khử trùng que cấy trước khi thực hiện dàn đều
tế bào).
Đặt đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm ở 30oC trong 48 giờ.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng
Di được tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = AixDi/V
Trong đó: Ai số khuẩn lạc trung bình / đĩa
Di là độ pha loãng
Mi dung tích dịch cho vào mỗi đĩa (ml).
Nguyễn Thị Hoa

19

YTMT_11-03

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 HOẠT HÓA GIỐNG VÀ NHÂN GIỐNG CẤP 1, CẤP 2
3.1.1 Hoạt hóa giống
Mục đích của việc hoạt hóa giống vi sinh vật là làm mới giống tạo ra các khuẩn
lạc riêng rẽ, không bị nhiễm.
Giống gốc ban đầu được thực hiện hoạt hóa trên môi trường thạch, ủ 28oC,
trong 48 giờ ta thu được đĩa giống mới với khẩn lạc riêng rẽ và không bị nhiễm vi
sinh vật khác.

Hình 3.1: Giống được hoạt hóa trên đĩa thạch

Nguyễn Thị Hoa

20

YTMT_11-03


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

3.1.2 Nhân giống cấp1, cấp 2
Mục đích của việc nhân giống là để tăng số lượng tế bào vi sinh vật.

Nhân giống cấp 1(giai đoạn phòng thí nghiệm): giai đoạn cấy vi sinh vật thuần
khiết từ đĩa thạch đem nhân ra môi trường dinh dưỡng tuyến tính vô trùng, nuôi
trong phòng thí nghiêm nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước nhân
giống cấp 2.
Nhân giống cấp 2 là giai đoạn cần nhân một lượng lớn giống để đáp ứng cho
khâu giống sản xuất.
Hình ảnh của giống cấp hai phục vụ cho lên men sản xuất sinh khối của nấm
men.

Hình 3.2: Giống cấp 2

Nguyễn Thị Hoa

21

YTMT_11-03