Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5 hydroxymethylfurfural trong thuốc, nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÀO THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
5-HYDROXYMETHYLFURFURAL TRONG
THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÀO THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
5-HYDROXYMETHYLFURFURAL
TRONG THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ : 60720410

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Vũ Công Sáu
2. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà

HÀ NỘI 2016


LỜI CÁM ƠN

Hoàn thành bản luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt
tình và có hiệu quả của rất nhiều cá nhân và tập thể, của các thầy cô giáo, các
bạn đồng nghiệp xa gần.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Thị
Thanh Hà - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học
Dược Hà Nội và TS. Vũ Công Sáu - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an là
những người thầy đã hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, các thầy
giáo, cô giáo Bộ môn Hóa phân tích và độc chất và các bộ môn khác của trường
Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu
trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các cán bộ Phòng Hóa lý, cán bộ Trung
tâm Giám Định Ma Túy - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực nghiệm. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn tới TS.
Nguyễn Xuân Trường - Giám đốc Trung tâm Giám Định Ma Túy, Thầy đã tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi luôn ghi nhớ đến sự giúp đỡ, chia sẻ cả về vật chất cũng như tinh thần
của mọi thành viên trong gia đình, bạn bè tôi, đó là nguồn động lực mạnh mẽ,
niềm khích lệ to lớn giúp tôi yên tâm học tập, nghiên cứu.
Trân trọng cảm ơn!

DS. Tào Thị Phương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................

1

Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................

3

1.1. Tổng quan về 5-HMF .................................................................................

3

1.1.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo .................................................................

3

1.1.2. Tính chất vật lý .........................................................................................

3

1.1.3. Tính chất hoá học ....................................................................................

3

1.1.4. Điều chế ....................................................................................................

3

1.1.5. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF ......................................

4

1.1.6. Một số phương pháp định lượng 5-HMF ...............................................

8

1.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................

13

1.2.1. Đại cương về sắc ký khí ...........................................................................

13

1.2.2. Detector khối phổ......................................................................................

15

1.2.3. Một số thông số đặc trưng .......................................................................

17

1.2.4. Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ ..........................................................

18

1..2.4.1. Phân tích định tính ................................................................................

18

1.2.4.2. Phân tích định lượng .............................................................................. 18
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................

19

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................

19


2.2. Hoá chất và thiết bị ....................................................................................

19

2.2.1. Hoá chất, dung môi .................................................................................. 19
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................

19

2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................

19

2.4. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................

20

2.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu .............................................................................. 20
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ........................................................... 20
2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt
bằng GC-MS ...................................... ...................................... ......................... 21
2.3.4. Bước đầu áp dụng phương pháp khảo sát một số mẫu thực tế .............

23

2.4. Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................

24

Chương 3. KẾT QUẢ........................................................................................

25

3.1. Xây dựng phương pháp phân tích............................................................. 25
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.......................................................................

25

3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký khí khối phổ....................................

25

3.2. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt
bằng GC-MS .....................................................................................................

34

3.2.1. Tính phù hợp của hệ thống .....................................................................

34

3.2.2. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu..............................................................

34

3.2.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................................

36

3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính .....................................................................

36


3.2.3. Độ đúng và độ chính xác .........................................................................

38

3.3. Bước đầu ứng dụng phương pháp khảo sát một số mẫu ........................ 40
Chương 4. BÀN LUẬN .....................................................................................

44

4.1. Về phương pháp GC-MS ........................................................................... 44
4.2. Về quy trình phân tích ............................................................................... 45
4.3. Về thẩm định phương pháp ......................................................................

45

4.4. Ứng dụng của phương pháp phân tích ....................................................

46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................................

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
5-HMF
ACN
AOAC
AF
C
CAFAM
CI

CTNĐ
Dd
EI
FA
FDCA
GC
HMFA
HMFG
HPLC
IS
LC
LD50
LOD
LOQ
MeOH
MS
NN
RSD
S
SD
SK
SMF
SULT1A1
TCVN
TLTK
TPCN
TR

:
:

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

:
:
:

5-Hydroxymethylfurfural
Giá trị trung bình
Acetonitril
Hiệp hội các nhà Hóa phân tích
Hệ số bất đối
Nồng độ
(5-Carboxylic acid-2-furoyl) amino methan
Ion hóa hóa học
Chương trình nhiệt độ
Dung dịch
Ion hóa trên cơ sở va đập điện tử
Acid furoic
Acid 2,5- furandicarboxylic
Sắc ký khí
Acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic
N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycine
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chất chuẩn nội
Sắc ký lỏng
Nồng độ ức chế 50%
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Methanol
Khối phổ
Nước ngọt
Độ lệch chuẩn tương đối

Diện tích pic
Độ lệch chuẩn
Sắc ký
5-Sulfoxymethylfurfural
Sulfotransferase
Tiêu chuẩn Việt Nam
Tài liệu tham khảo
Thực phẩm chức năng
Thời gian lưu


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu bằng phương pháp đo quang ....................................

8

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ..............

8

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

9

Bảng 1.4: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ ..........

11

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát các mức năng lượng va chạm ......................................

26

Bảng 3.2: Sắc ký đồ theo các chương trình nhiệt độ .................................................

28

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát theo các chương trình nhiệt độ ..................................

29

Bảng 3.4: Sắc ký đồ của các chương trình có nhiệt độ ban đầu khác nhau ........

30

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt độ ban đầu . ............................................................

31

Bảng 3.6: Sắc ký đồ với tốc độ khí khác nhau ............................................................

32

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống .......... .......... ......................

34

Bảng 3.8: Kết quả S/N của các mẫu trắng thêm chuẩn .......... .......... .......... ............ 36
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính .......... .......... .......... ..........

37

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác .......... .......... .......... .......... .....

38

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát một số mẫu thực tế .......... .......... .......... ......................

41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 5-HMF …………………………………………….

3

Hình 1.2: Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường …………………………………….

4

Hình 1.3: Quá trình chuyển hoá của 5-HMF ………………………………………...

5

Hình 1.4: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ……………………………………………………. 14
Hình 1.5: Detector khối phổ ……………………………………………………………

15

Hình 3.1: Hình ảnh phổ khối của 5-HMF ……………………………………………

25

Hình 3.2: Cường độ tín hiệu của ion 97, 126 với năng lượng va chạm 1 - 4V

27

Hình 3.3: Phổ khối với năng lượng va chạm là 2 V ……………….................……

27

Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ khí mang ………………………………………...

33

Hình 3.5: Sắc ký đồ của mẫu thử với tốc độ khí là 1,0 ml/phút ………………….

33

Hình 3.6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu ………………………………

35

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ 2 µg/ml ……………...

36

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic ………...

37

Hình 3.9: Kết quả phân tích 5-HMF trong mẫu thực tế …………………………...

42


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong tiêu chuẩn chất lượng thuốc, tiêu chí tạp chất liên quan biểu hiện
tính an toàn của thuốc luôn là vấn đề khó, đòi hỏi sự đầu tư nghiên cứu của
ngành kiểm nghiệm. Bên cạnh đó, trong thực phẩm, vấn đề mất an toàn vệ
sinh đang là vấn nạn đòi hỏi ngành kiểm nghiệm tìm phương pháp kiểm tra.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về 5-HMF ngày càng thu hút được sự
quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học. Đây là một sản phẩm chuyển hóa của
đường, có thể có mặt trong rất nhiều loại sản phẩm. Các nghiên cứu đã cho
thấy 5-HMF có khả năng gây kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc [9],
có khả năng thúc đẩy khả năng hình thành và phát triển của các khối u [7].
Hơn thế nữa, những sản phẩm chuyển hoá của 5-HMF như 5cloromethylfurfural, 5-sulfoxymethylfurfural có khả năng gây đột biến và ung
thư (như ung thư đại tràng, ung thư gan, ung thư da) [31].
Năm 2012, Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng Việt Nam cũng đã
ban hành tiêu chuẩn TCVN-9042:2012 xác định hàm lượng 5-HMF bằng
phương pháp quang phổ có sử dụng thuốc thử p-toluidin [3]. Trong chuyên
luận glucose của dược điển Việt Nam IV [2] cũng mới chỉ đưa ra phương
pháp xác định giới hạn 5-HMF bằng phương pháp đo quang. Tuy nhiên,
phương pháp này lại không đặc hiệu, có thể bị ảnh hưởng bởi các chất trong
nền mẫu, làm ảnh hưởng tới kết quả phân tích. Chính vì vậy cần phải có một
phương pháp có độ nhạy và tính chọn lọc cao để xác định 5-HMF trong chế
phẩm. Trong khi đó, máy sắc ký khí kết nối detector khối phổ ra đời đã làm
tăng cao khả năng phân tích các tạp chất.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu
xây dựng phương pháp xác định 5-hydroxymethylfurfural trong thuốc,
nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ” với 2 mục tiêu sau:

1


1.

Xây

dựng

và

thẩm

định

phương

pháp

xác

định

5-

hydroxymethylfurfural trong thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt bằng
phương pháp sắc ký khí khối phổ.
2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thuốc, thực phẩm chức
năng và nước ngọt trên thị trường.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về 5-HMF
1.1.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo [21]
Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 5-HMF
1.1.2. Tính chất vật lý [29]
- Khối lượng phân tử: M = 126,11 g.
- Dạng tinh thể, chất lỏng màu vàng đậm hoặc dạng bột, có mùi hoa cúc.
- Nhiệt độ sôi: Ở áp suất 0,002 mmHg sôi ở 110 oC; ở áp suất 1 mmHg
sôi ở 114-116 oC.
- Nhiệt độ nóng chảy: 31,5 oC.
- Độ tan: Tan trong nước, methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat,
dimethylformamid; tan được trong ether, benzen, cloroform; ít tan trong
CCl4.
- Cực đại hấp thụ: 283 nm
1.1.3. Tính chất hoá học [21]
Trong phân tử 5-HMF có chứa nhóm hydroxymethyl nên mang đầy đủ
tính chất hóa học của một alcol. Bên cạnh đó, 5-HMF cũng dễ tham gia phản
ứng khử do có nhóm formyl.
1.1.4. Điều chế
Quá trình phản ứng tạo 5-HMF là một quá trình phức tạp, nó trải qua các
phản ứng isomer hoá, phản ứng loại nước, phản ứng tách và phản ứng ngưng
tụ. 5-HMF được tổng hợp chủ yếu do quá trình mất nước của các phân tử
monosacharid (glucose, fructose), disacharid hoặc polysacharid [21].

3


Haworth [15] là người đầu tiên đề cập đến cơ chế dehydrat hoá fructose
để tạo 5-HMF. Sau đó, Kuster [19], [21] đã đưa ra hai con đường chuyển hoá
của hexose thành 5-HMF: con đường a là quá trình chuyển đổi qua các hợp
chất vòng trong khi con đường b lại thông qua các hợp chất mạch hở.

Hình 1.2. Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường
1.1.5. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF
Hầu hết các thực phẩm hoặc sản phẩm chứa đường đều có thể chứa 5HMF với hàm lượng khác nhau. Đặc biệt có những sản phẩm có thể chứa 5HMF với hàm lượng lên đến 1 g/kg. 5-HMF cũng được tìm thấy trong một số
sản phẩm tự nhiên như mật ong, nước ép hoa quả [26].
a) Quá trình chuyển hoá của 5-HMF
Để theo dõi quá trình chuyển hoá của 5-HMF người ta gắn đồng vị
phóng xạ C14+ vào 5-HMF. Sau khi sử dụng, 5-HMF được hấp thu nhanh
chóng, chuyển hóa và đào thải qua đường nước tiểu [5].
5-HMF được chuyển thành acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic (HMFA),
sau đó HMFA kết hợp với glycin tạo N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycin
(HMFG) – đây là sản phẩm chuyển hoá chính của 5-HMF, được đào thải chủ
4


yếu qua đường nước tiểu. Ở cả chuột và người, tỷ lệ HMFA/HMFG giảm khi
mà 5-HMF tăng và glycin tự do giảm, kết quả dẫn tới sự đào thải acid furoic
(FA) hoặc 2,5-furandicarboxylic acid theo con đường thứ hai. Người ta đã tìm
thấy cả HMFA, HMFG và FDCA trong nước tiểu của chuột. Tuy nhiên khi
cho chuột sử dụng nước quả mận khô thì chỉ tìm thấy HMFG, (5-carboxylic
acid-2-furoyl) amino methan (CAFAM) mà không thấy có FDCA. Với những
người sử dụng đến 3944 µmol (497 mg) HMF, sau 6h thu được 36,9 %
HMFG; 4,2 % CAFG và 1,9% CAFGM so với hàm lượng 5-HMF ban đầu

[5].

Hình 1.3. Quá trình chuyển hoá của 5-HMF
Trong các quá trình chuyển hoá của 5-HMF thì quá trình quan trọng nhất
là quá trình chuyển thành SMF dưới tác dụng của SULTs, đây là một chất có
độc tính cao do tính ái điện tử của carbocation allyl. Sự hình thành 5-SMF đã
được nghiên cứu trên chuột FVB/N. Sau khi tiêm tĩnh mạch 793 µmol

5


HMF/kg, thời gian bán thải của pha đầu và pha cuối là 1,7 và 2,8 phút. Nồng
độ SMF đạt cực đại sau 2,5 phút. Có khoảng 452 đến 551 ppm 5-HMF được
chuyển thành SMF [5].
b) Độc tính
Trong nghiên cứu của Edoardo Capuano và Vincenzo Fogliano [9] đã
chỉ ra rằng ở liều cao cho thấy 5-HMF có độc tính, nó có tác dụng kích thích
thị giác, kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc. Đối với chuột, khi sử dụng
đường uống, LD50= 3,1 g/kg. Trong một nghiên cứu khác, đối với chuột cái
LD50= 2,5 g/kg còn đối với chuột đực thì LD50= 2,5-5,0 g/kg.
Khi nghiên cứu về tác dụng gây ung thư của 5-HMF, Archer và cộng sự
đã chứng minh được rằng 5-HMF có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của khối
u và các tổn thương trong chuột. Gần đây, một số báo cáo cho thấy rằng 5HMF là một yếu tố có thể gây ung thư đối với chuộc thí nghiệm. 5-HMF làm
tăng tỷ lệ mắc u gan đối với chuột cái B6C3F1 khi sử dụng liều 188 và 375
mg/kg [7].
Trong quá trình nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể, 5-HMF được chuyển
thành SMF dưới tác dụng của SULT1A1 . Đây là một chất có độc tính mạnh
hơn 5-HMF do có nhóm sulfat ở vị trí allylic có thể dễ dàng bị cắt tạo
electropin, một chất gây ảnh hưởng tới protein và ADN [31].
Năm 1984, Ulbricht và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên chuột cống

thu được LD50= 3100 mg/kg, trong khi với chuột nhắt thì LD50= 1910 mg/kg.
Khi cho chuột sử dụng liều 310 mg/kg/ngày trong 2 tháng dẫn đến sự rối loạn
chức năng gan, thay đổi tỷ lệ protein huyết tương, làm tăng men gan
tributyrinase, tăng hoạt tính của một số men trong đường ruột như
phosphomonoesterase và enterokinase [34]. Một số nghiên cứu in vitro trên tế
bào của một số động vật có vú và một số loài chim cho thấy, với mức liều 1,0
mg/ml đã có thể gây ức chế quá trình tăng trưởng tế bào.

6


Trong nghiên cứu dài hạn, khi sử dụng liều 0, 40, 80 và 160 mg mỗi
ngày, mỗi tuần sử dụng 6 ngày trong vòng 11 tháng. Kết quả cho thấy, chuyển
hoá protein, lipid, nồng độ acid ascorbic và hoạt động của succinat
dehydrogenase không thay đổi. Tuy nhiên với nồng độ 160 mg/kg đã có sự
thay đổi một số thông số lâm sàng như: tăng nồng độ γ-globulin, tăng hoạt
tính của tributyrinase, tăng khối lượng lách [34].

7


1.1.6. Một số phương pháp định lượng HMF
Trên thực tế đã có nhiều nghiên cứu định lượng 5-HMF trong một số sản phẩm khác nhau. Có thể tóm tắt các
phương pháp nghiên cứu trong các bảng sau:
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu bằng phương pháp đo quang
STT

Mẫu phân tích

Thuốc thử

Bước sóng

TLTK

1

Mật ong

p-toluidin

550 nm

[25]

2

Siro và mật ong

p-toluidin

550 nm

[20]

Bảng 1.2 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
STT

Mẫu

Cột

Pha động

TLTK

1

Thực phẩm

-

Acid acetic 0,01 mM

[14]

2

Nước tiểu

MeOH : H2O (5:95)

[24]

RP 100
(55x2mm;3µm)

8

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
STT

1

2

Mẫu phân tích

Mật ong, nước ngọt

Mật ong

Cột sắc ký

Pha động

XBridge C18

A: H2O : ACN: acid percloric (97:3:0,01)

(250x4,6mm;5µm)
RP-18

Bước sóng
(nm)

TLTK

280

[12]

Dd acid acetic 1% : ACN (90:10)

285

[11]

Acid acetic 5% : MeOH (80:20)

285

[23]

H2O : MeOH (9:1)

285

[17]

H2O : MeOH (9:1)

285

[35]

Dd acid acetic 1% : ACN (95:5)

284

[33]

B: ACN: acid percloric (100:0,1)

(125x4mm,5µm)
3

Mật ong, nước giải

C18 (5µm)

khát
4

Đường

RP-18 LiChcrosphere
(250x4mm; 10µm)
C18

5

Thực phẩm
(150x3,9mm; 4µm)

6

Thực phẩm

C18
(250x4,6mm;5µm)

9


7

Mật ong

8

Thực phẩm

9

Glucose

10

Thực phẩm

11

Thực phẩm

Synergy Fusion
(75x4,6mm; 4µm)
Star PR-18
(250x4,6mm;5µm)

HPX-87H
(300x7,8mm)
XBP-C18
(250x4,6mm;5µm)
ODS
(250x4,6mm;5µm)

A: H2O : ACN (70:30)

263**

[36]

H2O:MeOH (92:8)

284

[8]

Acid H2SO4 5Mm

-

[37]

MeOH:H2O (5:95)

284

[38]

-

[28]

B: ACN 100%

Natri acetat 0,04M : MeOH (70:30)

Ghi chú: **: sau khi dẫn xuất hóa

10


Bảng 1.4 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
STT

Cột sắc ký

Khí

CTNĐ

TLTK

Lúc đầu 37oC, giữ 2 phút, sau đó tăng 30 oC/phút đến 100 oC, rồi

[22]

mang

Nhiệt độ tiêm 250oC,

1

DB5
(50mx0,2mm;0,33µm)

-

tăng đến 250 oC với tốc độ 8 oC/phút, giữ 5 phút
Nhiệt độ tiêm 250oC.
2

ZB-Wax
60mx0,32mm;0,5 µm)

-

Nhiệt độ ban đầu 150oC, sau tăng 4oC/phút đế 240oC, giữ 40

[13]

phút.

3

SPB-5
(60mx0,32mm;1,0µm)

Nhiệt độ tiêm 290oC.

He

(30mx0,25mm;0,25
µm)

[10]

tốc độ 3oC/phút, giữ trong 5 phút.
Nhiệt độ tiêm 250oC.

HP-5MS
4

Nhiệt độ ban đầu 40oC giữ trong 5 phút, sau tăng đến 200oC với

He

Nhiệt độ ban đầu 50oC, giữ trong 2 phút, sau đó tăng đến 250oC
với tốc độ 10oC/phút giữ trong 5 phút.
11

[18]


Nhiệt độ ban đầu 50oC giữ trong 1 phút, tăng 25oC/phút đến
5

DB5

He

150oC, sau đó tăng 20oC/phút đến 170oC, sau đó tăng 80oC/phút

[27]

đến 250oC rồi giữ trong 3 phút.
Nhiệt độ tiêm 250oC.
6

HP-5MS

He

Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 2 phút, sau tăng đến 300oC với

[30]**

tốc độ 12oC/phút rồi giữ trong 2 phút.
Nhiệt độ tiêm 280oC.

DB-5MS
7

He
(30m x 0,25mm)

Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 1 phút, sau đó tăng 7oC/phút
đến 110oC, sau tăng 20oC/phút đến 300oC rồi giữ 10 phút.

Ghi chú:** có dẫn xuất trước khi sắc ký khối phổ

12

[32]**


Trên thực tế phương pháp đo quang được ứng dụng đầu tiên trong khi
xác định 5-HMF trong các chế phẩm. Tại Việt Nam, trong chuyên luận
glucose cũng như TCVN năm 2012 về an toàn vệ sinh thực phẩm cũng có quy
trình định lượng 5-HMF bằng phương pháp đo quang với thuốc thử ptoluidin[3]. Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị ảnh hưởng nhiều bởi sự có
mặt của các chất khác trong nền mẫu. Do đó phương pháp này có độ chính
xác và chọn lọc không cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng được sử dụng để xác định
trực tiếp 5-HMF trong các chế phẩm. Tuy nhiên, trong đề tài này các mẫu
được pha loãng rồi tiến hành sắc ký trực tiếp nên sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi
nền mẫu phức tạp.
Từ đó dẫn đến yêu cầu cần phải có một phương pháp có độ nhạy cao,
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, phương pháp không bị ảnh
hưởng khi có mặt các chất khác trong nền mẫu, đặc biệt là những chất có
vòng furan. Phương pháp LC/MS và GC/MS đều đáp ứng được yêu cầu đó.
Trong 2 phương pháp này thì phương pháp GC/MS có ưu việt hơn, đặc biệt
sử dụng Detector khối phổ hai lần (MS/MS) với độ chọn lọc và đặc hiệu cao.
1.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
1.2.1. Đại cương về sắc ký khí
Sắc ký khí là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân
tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Trong đó pha động là một
chất khí, thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình
rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký khí, pha động không tương tác với chất phân
tích mà chỉ làm chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột, mẫu được tách

do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc
kết hợp cả hai cơ chế này.
Sơ đồ thiết bị sắc ký khí:

13


Hình 1.4. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
* Khí mang:
Các loại khí mang sử dụng trong GC-MS cần phải đảm bảo trơ, sạch và
không được tương tác với các chất phân tích. Thường sử dụng khí heli, hydro,
argon và nitơ.
* Buồng tiêm mẫu:
Trước khi vào cột phân tích, mẫu thường ở dạng lỏng, cho vào buồng
bay hơi rồi được dòng khí mang đưa vào cột. Có 3 cách tiêm mẫu chính: tiêm
mẫu chia dòng, tiêm mẫu không chia dòng và tiêm mẫu trực tiếp.
* Cột tách:
Cột là bộ phận trung tâm của hệ thống sắc ký. Trong sắc ký khí có hai
loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Chương trình nhiệt độ của sắc ký khí là
thông số quan trọng cần kiểm soát chính xác.
* Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí
Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất
khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa chọn pha
tĩnh thích hợp. Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm dựa vào tính
phân cực của nó, bao gồm: nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm
phân cực trung bình và nhóm phân cực cao.

14

1.2.2. Detector khối phổ
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử
của các hợp chất hóa học bằng việc phân tích các ion phân tử theo tỷ số giữa
khối lượng và diện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm
hay bớt điện tích của chúng (loại bỏ electron, proton hóa ...) [4].
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion
sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại
thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp thông tin để định tính
(khối lượng phân tử, nhận dạng các chất), xác định cấu trúc và định lượng các
chất [1].

Hình 1.5. Detector khối phổ [1]
* Cấu tạo:
Gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa, bộ phận phân tích khối và bộ phận
phát hiện.
- Nguồn ion hóa có vai trò ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở
trạng thái khí hoặc hơi [1].Trong GC-MS thường sử dụng kỹ thuật ion hóa
trên cơ sở va đập điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI).

15


- Bộ phân tích khối (Mass analyzer): Có vai trò tách các ion có trị số m/z
khác nhau thành từng phần riêng biệt. Có thể chia bộ phận phân tích khối
thành 4 loại [1], [4]:
+ Bộ phân tích từ: Gồm thiết bị khối phổ hội tụ đơn và thiết bị khối phổ
hội tụ kép.
+ Bộ phân tích tứ cực: gồm bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực
chập ba và bẫy ion kiểu tứ cực.

Bộ tứ cực: Gồm có 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có
một khoảng không giữa 4 cực để các ion bay qua. Dòng điện một chiều (và
điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực.
Bẫy ion tứ cực: Hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực,
chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy
Bộ tứ cực chập ba: Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau:
Q1, Q2 và Q3. Trong đó, Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích. Q1 sẽ tách các ion;
một số ion chọn lọc từ đây vào Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền
ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nito, argon, heli. Nhờ va
chạm này, năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng
bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con. Các ion con mới hình
thành được dẫn tới Q3 tách riêng và đến detector. Kỹ thuật này được gọi là
khối phổ hai lần.
- Bộ phận phát hiện (Mass detection): Thường có hai loại nhân electron
và
nhân quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu và khuếch
đại để đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
* Một số kỹ thuật ghi phổ
Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:

16