LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
---------

BÙI THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI
TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
ENZYME

LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2014
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
---------

BÙI THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE
TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH
CỦA ENZYME
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60. 42. 01. 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT

LỜI CẢM ƠN
HÀ NỘI, NĂM 2014
2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy
giáo, cô giáo đã và đang giảng dạy tại bộ môn Di truyền học – Trường Đại Học Sư
Phạm Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em học tập và hoàn thành khóa
học.
Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Công
Hoạt và TS. Phạm Thị Tâm, là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trợ về tài chính cũng như phương pháp từ đề
tài cấp Nhà nước mã số KC06.15/11-15. Em xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Sinh,
Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đặc biệt là tập thể cán bộ, học
viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã chia sẻ khó
khăn, giúp đỡ em để em thực hiện được các nội dung của đề tài.
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài em không tránh khỏi được những
sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn bỏ qua và đóng góp ý
kiến để em hoàn thiện hơn.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh
động viên và giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học này.

Hà Nội, tháng 9 năm 2014
Tác giả luận văn

Bùi Thị Thu Hằng

3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A
AMP

: Aeromonas
: Ampicillin

bp

: Bazơ pair

BSA

: Bovine Serum Albumin

BLAST

: Basis Local Aligment Search Tool

EDTA

: Ethyllene diamine tetra acetic acid

EtBr

: Ethidium Bromide

LB

: Lubria – Bertani

OD

: Optical density

PBS

: Phosphate buffer

PCR

: Polymerase Chain Reactions

IPTG

: Isopropyl β-D- thiogalactoside

kD

: Kilo dalton

kb

: Kilo bazơ

RE

: Restriction enzyme

TAE

: Tris - acetate - EDTA

UV

: Ultra violet

4


MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI.......................................................................................1
2. MỤC TIÊU ..........................................................................................................2
2.1. Mục tiêu chung..................................................................................................................................2
2.2. Mục tiêu cụ thể..................................................................................................................................2

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................2
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU....................................................2
4.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................................................3

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI................................................................................3
PHẦN II. NỘI DUNG.......................................................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................ 3
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase.....................................................................................................3
2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase.......................................................................7

3. Tình hình thực tế................................................................................................................................10
4. Các thành phần thủy phân từ da cá ..................................................................................................12
5. Biến nạp.............................................................................................................................................13
6. Vector biểu hiện.................................................................................................................................13
7. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm.................................................................................................................15
...................................................................................................................................................... 17
...................................................................................................................................................... 17
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................................18

1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị..................................................................................18
1.1. Vật liệu............................................................................................................................................18
1.2. Hóa chất..........................................................................................................................................20
1.3. Thiết bị............................................................................................................................................21

2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................22
2.1. Phương pháp điện di trên gel agarose...........................................................................................22
2.2. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 23
2.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose..................................................................................24
2.4. Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm......................................24
2.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn.........................................................................................25
2.6. Phương pháp nối gen......................................................................................................................26
2.7. Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ................................................27
2.8. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli..............................................................28
2.9. Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3).....................29
2.10. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+.......................................................................30
2.11. Phương pháp điện di gel SDS-PAGE...........................................................................................31

5

2.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase...........................................................................................33
2.13. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô ...............................33
2.14. Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase..........................................................................33
2.15. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn...................................................................................................34
2.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh khối và
hoạt tính enzyme gelatinase...................................................................................................................35
2.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase................35
2.18. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase......................36
2.19. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase..............36
2.20. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu.........................................................................................36
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................................36

1. Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21..................36
1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A.................................................................................36
1.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ...................................................................40
1.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp.............................................................42

2. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase...................44
2.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase.................44
2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của
chủng vi khuẩn tái tổ hợp.......................................................................................................................47
2.3. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ.......................................................................................................51
2.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH...............................................................................................................53
2.5. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy.......................................................................................55
2.6. Ảnh hưởng các ion kim loại............................................................................................................57

3. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp ......................................................58
3.1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột...............................................................................58
3.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp..........................................................................60
3.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp......................................................................63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................................................. 66

1. KẾT LUẬN........................................................................................................66
2. KIẾN NGHỊ.......................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................... 68

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Thành phần acid amin của gelatin..…………………................................ 5

6


Bảng 2. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase ..................................... 7
Bảng 3. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase ..................................... 13
Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn các bon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt
tính enzyme tái tổ hợp ……………………............................................................. 49
Bảng 5. Ảnh hưởng của các ion bổ sung đến khả năng phát triển sinh khối và hoạt
tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32/GelE ............................................. 59
Bảng 6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase
……………………………………………………………...................................... 65

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ (Sđ)
Sđ 1. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase (GelE) …................................................... 17
Sđ 2. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen GelE .......18
Sđ 3. Xác định điều kiện tăng sinh của chủng vi khuẩn TTH pET 32a +/GelE ....... 18

DANH MỤC CÁC BỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phân giải gelatin......................60
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng phân giải gelatin.....................61
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme

gelatinase ......................................................................................................................
............ 66
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme
gelatinase.................................................................................................................. 67

DANH MỤC CÁC HÌNH
7


Hình 1. Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin ...........................................................4
Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A ..................................................................................6
Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B ..................................................................................6
Hình 3. Hình thái A. hydrophila……………………………………………………………8
Hình 4. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila…………………………………………………...9
Hình 5. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa............................................10
Hình 6. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas……………...…………………………….11
Hình 7. Sơ đồ pET32a+ dùng trong biểu hiện gen ...................................................19
Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank ...............38
Hình 1.2. Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET32 a(+) cắt bằng các enzyme
giới hạn Bam HI và Xho I .......................................................................................39
Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa
gelatinase.................................................................................................................. 40
Hình 1.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và
XhoI ..........................................................................................................................41
Hình 1.5. Kết quả biến nạp vector pET32a/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) và
nuôi trên môi trường LBAmp .....................................................................................42
Hình 1.6. Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE ..........43
Hình 1.7. Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE .............................44
Hình 1.8. Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli
BL21/pET 32-GelE .................................................................................................45

Hình 2.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21 ............................46
Hình 2.2. Mức độ biểu hiện protein GelE ở các nồng độ IPTG cảm ứng ................47
Hình 2.3. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nồng độ IPTG cảm ứng …………....47
Hình 2.4. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến khả năng sinh trưởng của chủng E.coli
BL21- pET32/GelE ..................................................................................................50
Hình 2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli
BL21- pET32/GelE ..................................................................................................50

8


Hình 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32/GelE ........................................................................................51
Hình 2.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli
BL21- pET32/GelE ..................................................................................................52
Hình 2.8. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nhiệt độ nuôi cấy ..............................53
Hình 2.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32/GelE ........................................................................................53
Hình 2.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32/GelE ........................................................................................54
Hình 2.11. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32/GelE ..................................................................................................55
Hình 2.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32/GelE ..................................................................................................55
Hình 2.13. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị pH khác nhau ......................56
Hình 2.14. Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến khả năng sinh trưởng của sinh
khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE .....................................................................57
Hình 2.15. Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase của sinh khối
chủng E.coli BL21- pET32/GelE .............................................................................57
Hình 2.16. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị OD khác nhau .................... 58

Hình 3.1. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin ở 370C …………………60
Hình 3.2. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí......................... 61
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase ............................ 62
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase …… 63
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase .................................... 64

9


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào
nhiều ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất
thành sản phẩm nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản
ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản
ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn đối với con người và thiên nhiên.
Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất
enzyme tái tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông
nghiệp. Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có
chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn
chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ
hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen”. Đề tài nghiên cứu công nghệ
sản xuất enzyme protease và lipase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụng
trong công nghệ thuộc da và sản xuất chất tẩy rửa. Đề tài “Nghiên cứu sản xuất
enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng
dụng sản xuất nước chấm”.
Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác
dụng có thể thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn
gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không
vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong

ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas,
Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các
liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên
nguồn gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một
số loại vi khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như
Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả

1


không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn
tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn.
Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành
công nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng
enzyme cần thiết sẽ không đáp ứng đủ. Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp,
để từ đó sản xuất enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp
phần quan trong trong việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn.
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo
gelatinase tái tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.
2. MỤC TIÊU
2.1. Mục tiêu chung
Chế tạo được gelatinase tái tổ hợp và đánh giá được đặc tính của gelatinase
tái tổ hợp.
2.2. Mục tiêu cụ thể
1. Chế tạo được enzyme tái tổ hợp gelatinase
2. Xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3. Xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp, bao gồm: đặc tính
vật lý, hóa học của enzyme.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Nghiên cứu tạo chủng biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3. Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp.
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1. Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp.
4.2. Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp)
được tách dòng từ 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; và A.hydrophila C4.1.1.

2


4.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng
9/2014.
-

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Sinh học
Viện Đại Học Mở Hà Nội.

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
- Hệ thống hóa được các kỹ thuật trong công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp nói
chung và trong công nghệ tạo gelatinase tái tổ hợp nói riêng.
- Đưa ra các điều kiện để chế tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong xử lý
phụ phẩm chế biến cá da trơn.

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase
1.1. Gelatin

3


Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của
bò, lợn, cá. Trong tự nhiên, gelatin đóng vai trò như một nguồn nitơ giàu dinh
dưỡng, rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin tạo ra peptide và acid
amin để xây dựng cấu trúc cơ thể của chúng. Hiện nay, gelatin có nguồn gốc từ da
cá đang được xác định là nguồn cung cấp chính do nó giải quyết vấn đề xử lý chất
thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng. Gelatin được thu nhận từ sự biến tính
nhiệt phân Collagen có trong da, xương, mô liên kết của động vật, là một loại
protein phổ biến trong giới động vật. Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40 oC)
và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ở điều kiện bình thường có dạng sệt. Theo
Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân Collagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O



C102H151N31O39 (gelatin)

Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin
thiết yếu, hàm lượng các acid amin glycelin, hydroxyproline đặc biệt cao, chiếm
khoảng 50% tổng số acid amin có trong gelatin (Hình 1).

Hình 1. Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin
Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:
Bảng 1. Thành phần acid amin của gelatin
STT
1

Loại acid amin
Alanine

Tỉ lệ (% )
8.6 - 10.7

4


2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Arginine
Aspartic acid

Cysteine
Glutamic acid
Glycine
Hydroxylysine
Hydroxyproline
Isoleucine
Leucin
Lysine
Methionin
Histidine
Phenylalanine
Proline
Serine
Threonine
Tyrosine
Valine

8.3 - 9.1
6.2 - 6.
0.1
11.3 - 11.7
26.4 - 30.5
1.04
13.5
1.36
3.1 - 3.34
4.1 - 5.2 4
0.8 - 0.92
0.85 - 1.0
2.1 - 2.56

16.2 - 18.0
2.9 - 4.13
2.2
0.44 - 0.91
2.5 - 2.8 2,519

1.2. Gelatinase
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn
và động vật bậc cao. Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase,
xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và
peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone. Hoạt tính của enzyme
không chỉ phụ thuộc vào hoạt lực của nó mà còn phụ thuộc nhiều vào các tác nhân
môi trường mà nó xúc tác. Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc ngoại
bào như elastin, collagen và gelatin.
Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A
và gelatinase B (hình 2a, 2b). Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là
collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích
thước là 501bp. Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92
kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là
615bp. Enzyme này chủ yếu được sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạch
cầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng. Chức năng chính của
gelatinase là phối hợp với các MMPs khác để chỉnh sửa các mô sinh dưỡng, hỗ trợ

5


sự phát triển của phôi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng,
chữa lành vết thương, tham gia hình thành xương.
Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư, gelatinase 92
kDa được sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, còn trong chẩn

đoán, gelatinase là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u. Đối với
lĩnh vực sản xuất thực phẩm, gelatinase cùng với colagentinase là những men

tiêu hoá protit gân, bạc nhạc và protit liên kết thành những mạch peptit và
acid amin.

Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A

Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B

Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lượng phân tử là 72 kDa,
với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn 2+, hoạt động chính của enzyme này là thủy
phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn hơn và các acid
amin các chủng sản sinh gelatinase (bảng 1)
Bảng 2. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
Tên loài
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Clostridium perfringens
Corynebacterium sp
Proteus spp
Pseudomonas aeruginosa

Hoạt tính Gelatinase
+
+
+
+
+
+

6


Pseudomonas fluorescens

+

Serratia plymuthica
Serratia liquefaciens
Serratia rubidaea
Peudomonas anguilliseptica

+
+
+
+

2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
2.1. Vi khuẩn Aeromonas hyrophila
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadacea
Giống: Aeromonas
Loài: A.hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích
thước chiều rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng không
có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC).
A. hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn.

Trong một số điều kiện sinh trưởng nhất định một số tế bào có thể có tiên mao ở
một bên. Chúng được xếp vào nhóm sinh vật dị dưỡng. Loài này chủ yếu được tìm
thấy trong các vùng khí hậu nhiệt đới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái
Lan, Úc... và Việt Nam. Chúng phân bố nhiều trong các vùng nước ngọt, nước lợ,
mặn, ở các cửa sông... ngoài ra còn có thể bắt gặp loài này trong các nguồn nước có
chứa clo và các hợp chất khác có hay không có clo. Vi khuẩn này phổ biến hơn
trong môi trường nuôi cá nước ngọt. Nó được tìm thấy cả trong tầng nước đứng và
lớp trên cùng của lớp trầm tích (Hazen 1979). Cho tới những năm 1950, người ta
mới phân lập được loài này trên người và 1 số động vật. A.hydrophila là loài được
biết đến nhiều nhất trong 6 loài thuộc Aeromonas. Nó có thể tiêu hóa các vật liệu
như gelatin và hemoglobin. Nó có khả năng thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt

7


của môi trường như: có thể sống được trong môi trường có chứa clo, bị làm lạnh,
hay nhiệt độ thấp, vì vậy loài này rất khó bị tiêu diệt.

Hình 3. Hình thái A. hydrophila
A. hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ
trên cá. Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ mà nó kí sinh, A. hydrophila đi theo các
mạch máu để đến với các tổ chức kí sinh đầu tiên, A. hydrophila có thể kí sinh ở
bất cứ vị trí nào mà nó bắt gặp. Khi kí sinh nó tăng sinh rất nhanh và sản sinh ra độc
tố Aerolysin Cytotoxic Enterotoxin (ACE), là loại độc tố có thể phá hoại tổ chức
mô. Nó là nguyên nhân gây sự hư thối trên thực phẩm tươi sống bao gồm cả cá và
hải sản (Rustigan và Stuart, 1943; Amend và Fender, 1976; Daskalov, 2006). Tất
cả các loài A. hydrophila, A. caviae, A. sobria đều được xem là tác nhân gây bệnh
cơ hội, nghĩa là chúng chỉ gây nhiễm khi hệ miễn dịch của kí chủ bị suy yếu.

Hình 4. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila

8


2.2. Vi khuẩn Pseudomonas
Phân loại khoa học
Giới (Domain): Bacteria
Ngành (phylum): proteobacteria
Lớp (class): Gramma proteobacteria
Bộ (ordo) : Pseudomonadales
Họ (familia): Pseudomonadaceae
Chi (genus): Pseudomonas
Migula(1894)
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans ,
Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn
Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên
mao) và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh
hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Chúng thường sinh ra
sắc tố, các sắc tố này thường biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gây
tổn thương hoặc làm mất hoạt tính sinh lý bình thường của các tế bào biểu mô trong
đường hô hấp.

Hình 5. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi trường. Khả năng
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều
môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây, trên và trong các động vật. Trong số

9

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong
công nghệ sinh học.

Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là
Protease. Một số đề tài nghiên cứu về Protease của loại vi khuẩn này, kết quả cho
thấy enzyme Protease có hoạt tính cao trong canh cấy, và có các đặc tính khác nhau,
áp dụng có hiệu quả trong thực tế như đặc tính bền trong dung môi, không bị tác
động bởi các ion kim loại, bền với chất tẩy rửa. Bên cạnh đó chúng còn có khả năng
tiết ra enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp,
dược phẩm, mỹ phẩm.
Ở Cá, Pseudomonas thường gây nhiễm khuẩn huyết liên quan đến các stress,
các thương tổn da, vẩy do các tác nhân cơ học, nuôi với mật độ cao, dinh dưỡng
kém, hàm lượng ôxy giảm. Chúng xâm nhập vào cơ thể cá qua các thương tổn ở
mang, da. Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá
bống tượng, cá tai tượng...gây nên những dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng đốm
nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng. Bề mặt cơ thể có thể
chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn.

Hình 6. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas
3. Tình hình thực tế
Theo báo cáo của Viện Nuôi trồng thủy sản II, sáu tháng đầu năm 2010,
Đồng bằng sông Cửu Long đã xuất khẩu trên 300.000 tấn cá tra philê với kim
ngạch hơn 640 triệu đô la Mỹ. Dự kiến cả năm các doanh nghiệp sẽ xuất 600.000

10


tấn cá tra, kim ngạch đạt ít nhất 1,2 tỉ đô la Mỹ. Hiện các tỉnh/thành phố vùng Đồng

bằng Sông Cửu Long có 3.749 héc ta nuôi cá tra, trong đó Đồng Tháp, An Giang
với 2.340 héc ta. Do có ưu điểm như dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên tiềm năng
nuôi cá tra vẫn còn khá lớn. Việc phát triển nuôi cá tra sẽ làm tăng sản lượng cá
nuôi nước ngọt trong cả nước, tăng thêm lượng thủy sản xuất khẩu và góp phần
phát triển ổn định nghề nuôi.
Tuy nhiên, so với năm 2009, trong những tháng qua, giá cá tra trên thị
trường quốc tế giảm từ 2,28 đô la Mỹ xuống còn 2,13 đôla Mỹ/kg, đã gây khó khăn
không ít cho các doanh nghiệp xuất khẩu. Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan
tâm hơn tới việc tăng doanh thu từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn,
các mặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử
dụng cho phế phẩm. Mặt khác, nếu không tận thu lượng phụ phẩm sau chế biến này
sẽ gây thất thoát lãng phí lớn trong sản xuất và ô nhiễm môi trường. Trong khi đó,
chúng ta lại hoàn toàn có thể tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủy
phân có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sản
xuất nông nghiệp… đáp ứng được một lượng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các
sản phẩm chống lão hóa, các sản phẩm làm đẹp, dược phẩm, thực phẩm chức năng,
thức ăn nuôi trồng thủy sản hay các sản phẩm sử dụng trong nông nghiệp.
Thành phần chủ yếu của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý. Da
chứa 85% collagen, một loại protein có 19 acid amin, trong đó có 8 acid amin
không thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hoàn chỉnh, trong đó
axit amin glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lượng acid amin
trong collagen. Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành acid amin, enzyme
gelatinase được coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an toàn và ít
gây ô nhiễm môi trường.
Như trên đã nói, hàng năm tại các nhà máy chế biến lượng da cá thải ra rất
lớn. Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng Tháp
là công ty đầu tiên trong nước xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra/ cá
ba sa với công xuất 1000 tấn/ năm. Theo dự báo kết quả kinh doanh nhà máy sản

11

xuất collagen của công ty này, ngay trong năm đầu hoạt động - năm 2012, lợi nhuận
sau thuế có thể đạt xấp xỉ 1,1 triệu USD, hay tỉ suất lợi nhuận trên doanh thu là
khoảng 15%.
Từ collagen trong da cá, theo nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn,
2009, hiệu suất chiết tách gelatin từ da cá tra/ cá basa đạt 16%, nguồn gelatin này
đạt các tiêu chuẩn dược điển Việt Nam III, hoàn toàn an toàn đối với vật nuôi và
con người có thể sử dụng trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Như vậy, việc sản xuất acid amin từ da cá tra/ cá ba sa để sử dụng trong
nghành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là một vấn đề khả thi và là một hướng đi
đúng đắn nhằm khai thác hiệu quả và triệt để hơn nghề nuôi cá tra vốn đang phát
triển rất mạnh.
4. Các thành phần thủy phân từ da cá
Trên thực tế, thị phần của gelatin có nguồn gốc từ bò hoặc lợn đang dần giảm
do chi phí sản xuất cao, do dịch bệnh tai xanh ở lợn, xốp não, lở mồm long móng ở
bò (Jongjareonrak và cộng sự, 2006). Hơn nữa, chỉ có gelatin trong da cá mới được
chấp nhận ở các quốc gia Hồi Giáo.
Hiện nay, trên thế giới, gelatin có nguồn gốc từ da cá được sản xuất từ cá
tuyết, cá rô phi đen (Oreochromis mossambicus), cá rô phi đỏ (Oreochromis
nilotica), cá rô sông Nile (Lates niloticus), cá hồng (Priacanthus macracanthus), cá
mập, cá đối,... ( Cheow và cộng sự, 2007).
Theo nghiên cứu của Panida và cộng sự, 2008, trong da cá rô phi sông Nile
có chứa 89,4% gelatin. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của các tác giả Go´ mezGuille´n và cộng sự, 2005 cho thấy: thủy phân gelatin từ da cá đã thu được 4 loại
acid amin chính, hàm lượng các acid amin này tương đương với các thành phần
trong gelatin từ da lợn (đã được thương mại hóa) (bảng 3).
Bảng 3. Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nước lạnh,
nước ấm và bì lợn (thành phần trong 1000g)
Loại acid amin

Da cá

Da cá

tuyếta

Alaska

Hakea

Megrima

Cá rô
phic

12

Bì lợnd


Alanine
Glycine
Hydroxyproline
Proline

96
344
50
106

pollockb
108
358
55
95

119
331
59
114

123
350
60
115

123
347
79
119

112
330
91
132

Gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc acid. Tuy nhiên,
các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu acid hoặc base,
đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường. Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch
base hoặc acid để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng

phân của các acid amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của acid amin. Vì
vậy, công nghệ enzyme được lựa chọn như giải pháp tối ưu (Waldner và cộng sự,
1997).
5. Biến nạp
Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Thông tin của
tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử ADN mạch kép vòng tròn đơn được gọi là
genophore, hay "nhiễm sắc thể". Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số
vi khuẩn có ADN tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi
nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote. Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêm
plasmid là phân tử ADN vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập.
Biến nạp được nghiên cứu kỹ nhất ở các chủng vi khuẩn Streptococcus
pneumonice, Baccilus subtilis, Haemophilus influenzae và một số nhóm vi khuẩn
khác.
6. Vector biểu hiện
6.1. Vector biểu hiện
Vector biểu hiện gen là những vector được thiết kế dùng để biểu hiện một tính
trạng hay tạo ra một loại protein. Vector biểu hiện mang tất cả các đặc điểm của
vector tách dòng như:
-

Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin) để có khả năng tự sao chép trong tế

bào chủ.
- Phải có trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.

13


- Có gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu…) cho phép
dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận.

- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn. Các vị trí
cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector
ban đầu.
- Có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN tối đa,
đồng thời dễ xâm nhập vào tế bào chủ, sao chép nhanh và hiệu quả.
Ngoài ra, để vector biểu hiện có thể biểu hiện được các gen trong cơ thể vật
chủ thì chúng cần có thêm các đặc điểm sau:
- Có chứa trình tự mã hóa gen chỉ thị (marker) để đảm bảo duy trì vector trong
tế bào.
- Có chứa promoter mạnh cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen
đã được tạo dòng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vị trí bám của ribosome được bố trí thích
hợp và có codon khởi đầu AUG
- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong tế bào một hướng chính xác với
promoter.
6.2. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn E.coli
Theo Baneyx (1999), vi khuẩn E.coli là một trong những vật chủ được sử
dụng rộng rãi để tạo dòng và biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh
vật khác. Hiện nay, việc tạo dòng và biểu hiện gen trong vi khuẩn E. coli được ứng
dụng rất nhiều tại Việt Nam cũng như trên thế giới.
E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí, kỵ khí tùy tiện, thường gặp
trong đường ruột, phát triển dễ dàng trong các môi trường nuôi cấy thông thường,
nhiệt độ tối ưu là 370C. E.coli có 1 NST nằm trong thể nhân, là một chuỗi ADN trần
với khoảng 4.106 cặp base. E.coli có quá trình biểu hiện gen gồm quá trình phiên
mã và giải mã xảy ra đồng thời. Sau khi mARN được tổng hợp sẽ được sử dụng
ngay để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sau phiên mã vì E.coli không có
các intron. Do sự đơn giản và tiện lợi đó mà E.coli là loại tế bào biểu hiện gen rộng

14

rãi nhất hiện nay thông qua quá trình sử dụng các plasmid đặc thù cho các loại sản
phẩm (protein ngoại lai) mà ta cần quan tâm.
Vi khuẩn E.coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có
nhiều ưu điểm:
-

Dễ nuôi, không đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, thiết bị, dụng cụ đơn
giản, rẻ tiền góp phần hạ giá thành sản phẩm.

-

Trong ứng dụng là dòng E.coli đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid
tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen đó. E.coli
dễ dàng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc cả Prokaryota và Eukaryota.

-

E.coli chứa một số promotor mạnh, có khả năng biểu hiện mạnh.

-

E.coli có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái
tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm
protein tái tổ hợp. Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50mg/l – 500mg/l.

-

Cấu trúc bộ gen của E.coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá
đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử

dụng E.coli.

-

Dòng tế bào E.coli được trong sản xuất tương đối an toàn, không có hoạt tính
gây bệnh, ít gây bệnh ở người và động vật.

7. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

15


Sản phẩm tách dòng gen Gel E/A
được tinh sạch và xác định trình tự
pET32a+

Cắt bằng BamHI
và XhoI

Cắt bằng BamHI và XhoI

Tinh sạch gen GelE/A và pET32a+

Nối GelE/A vào pET32a+
Chuyển plasmid TTH vào E.coli JM109

Tách plasmid

PCR kiểm tra

Chuyển plasmid TTH vào E. coli BL21

Tinh sạch protein TTH

16

Điện di SDS-PAGE

PCR kiểm tra