Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ trên ng ời tình nguyện

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của
rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ
trên ngời tình nguyện

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Kim Huyền
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội

5918
28/6/2006

Năm 2005


Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của
rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ
trên ngời tình nguyện

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Kim Huyền
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội
Cấp quản lý:
Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2003 đến tháng 12/2005
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng

Trong đó: kinh phí sự nghiệp khoa học 300 triệu đồng

Năm 2005


Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

1. Tên đề tài:
Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của rifampicin từ
hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ trên ngời tình nguyện
2. Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Kim Huyền
3. Đơn vị chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội
4. Cấp quản lý:
Bộ Y tế
5. Danh sách những ngời thực hiện chính
- PGS.TS Hoàng Thị Kim Huyền, Bộ môn Dợc lâm sàng, trờng ĐHDHN
- ThS. Lê Thị Luyến
- ThS Nguyễn Thị Liên Hơng
- ThS. Bùi Đức Lập
- ThS. Phan Quỳnh Lan
- ThS. Phạm Thị Thuý Vân
6. Đề tài nhánh: Không có
7. Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2003 đến tháng 12/2005


Những chữ viết tắt
AUC

-

Diện tích dới đờng cong nồng độ - thời gian
(Area Under the Curve of Concentration versus Time)

ATS

-

Hội lồng ngực Mỹ (American Thoracic Society)

CDC

-

Trung tâm phòng chống bệnh tật Mỹ
(Center for Diseases Control and Prevention)

Cmax

-

Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tơng

CTCLQG

-

Chơng trình chống lao quốc gia

DOTS

-

Hoá trị liệu ngắn ngày có giám sát trực tiếp
(Directly Observed Therapy Short course)

E, EMB

-

Ethambutol

FDA

-

Cơ quan quản lý Thực phẩm Dợc phẩm Mỹ
(Food And Drug Administration)

FDC

-

Thuốc viên hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination)

IDSA

-

Hội bệnh nhiễm trùng Mỹ (Infectious Diseases Society of America)

H, INH

-

Isoniazid

HPLC

-

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IUATLD

-

Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế
(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease)

R, RMP

-

Rifampicin

S, SM

-

Streptomycin

T1/2

-

Thời gian bán thải của thuốc

Tmax

-

Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong huyết tơng kể từ khi đa
thuốc

WHO

-

Tổ chức y tế thế giới
(World Health Organization)

Z, PZA

-

Pyrazinamide


Mục lục

Phần A- Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài
1. Kết quả nổi bật
2. áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng nghiên cứu đã đợc phê
duyệt
4. Các ý kiến đề xuất

Trang
1
1
4
4

Phần B- Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu

4
5

1. Đặt vấn đề

5

2. Tổng quan
2.1. Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều
2.2. Sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều
2.3. Phơng pháp định lợng RMP trong huyết tơng bằng HPLC
3. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tợng nghiên cứu
3.2. Vật liệu và phơng tiện nghiên cứu
3.3. Phơng pháp nghiên cứu

4. Kết quả nghiên cứu
4.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng RMP trong huyết tơng
4.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng RMP trong huyết tơng
4.1.2. Thẩm định phơng pháp định lợng
4.2. Sinh khả dụng của RMP trên ngời tình nguyện
4.2.1. Đặc điểm của nhóm ngời tình nguyện
4.2.2. Nồng độ RMP trong huyết tơng và các thông số dợc động học của
RMP trên ngời tình nguyện
4.2.3. Đánh giá sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm hỗn hợp và đơn lẻ
5. Bàn luận
5.1. Phơng pháp định lợng RMP trong huyết tơng
5.1.1. Phơng pháp tủa protein huyết tơng và chiết rifampicin
5.1.2. Chơng trình sắc ký
5.2. Đánh giá sinh khả dụng của RMP
5.2.1. Một số thông số dợc động học của RMP khi uống RMP đơn độc
5.1.2. Những thay đổi chỉ số Cmax và AUC khi uống RMP INH PZA đồng
thời
5.1.3. So sánh sinh khả dụng của RMP viên hỗn hợp và RMP INH PZA đơn
lẻ

7
7
8
9
13
13
13
15
21
21

21
22
27
27
27
31
37
37
37
38
38
38
39
41


6. Kết luận và đề xuất

45

Tài liệu tham khảo

47

Phụ lục
Phụ lục 1 - Phiếu thu thập số liệu ngời tình nguyện
Phụ lục 2 - Phiếu theo dõi sức khoẻ ngời tình nguyện
Phụ lục 3 - Bảng theo dõi thời điểm lấy mẫu máu ngời tình nguyện
Phụ lục 4 - Đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu
Phụ lục 5 - Sắc ký đồ của rifampicin

Phần A. Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài
1. Kết quả nổi bật của đề tài
a/ Đóng góp mới của đề tài
- Xây dựng và hoàn chỉnh đợc quy trình định lợng rifampicin trong huyết
tơng ngời từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ, làm tiền đề cho việc kiểm tra chất
lợng thuốc có chứa rifampicin. Điều này còn giúp cho việc theo dõi nồng độ một
thuốc chống lao hàng đầu (rifampicin) trong điều trị khi cần thiết.
Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình định lợng nồng độ thuốc trong huyết
tơng vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị (máy HPLC) cùng với chuyên gia có
kinh nghiệm về kiểm nghiệm; nhng định lợng nồng độ rifampicin trong huyết
tơng còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết tơng để định lợng rifampicin luôn có
nhiều thuốc chống lao khác cùng đợc uống đồng thời. Với nhiều khó khăn trên, ở
thời điểm hiện nay tại Việt nam, ngời nghiên cứu phải có nhiều nỗ lực để vợt qua.
Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP nói riêng và
thuốc chống lao trong viên FDC nói chung sẽ giúp ích cho chơng trình chống lao
quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao FDC đảm bảo chất lợng. Đồng
thời giúp các nhà sản xuất thuốc trong nớc trong việc sản xuất chống lao FDC đảm
bảo sinh khả dụng của RMP cũng nh các thành phần khác. Ngoài ra, đối với cộng
đồng, việc đảm bảo chất lợng thuốc chống lao góp phần điều trị bệnh lao thành
công và giảm nguy cơ xuất hiện kháng thuốc, điều đó có ý nghĩa lớn trong thực tiễn
Việt nam hiện nay.
- Đã đánh giá đợc tơng đơng sinh học (Bioequivalance) của rifampicin từ
viên FDC hiện chơng trình chống lao Quốc gia đang sử dụng (Combikits) so với
viên rifampicin khi dùng đơn độc và rifampicin trong phối hợp 3 viên riêng rẽ RHZ.
Nhờ nghiên cứu này chúng tôi phát hiện đợc sự giảm sinh khả dụng của rifampicin
trong chế phẩm thuốc chống lao dới dạng viên hỗn hợp cố định liều (Fixed dose
combination - FDC) - dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng
1 chế phẩm, đúng nh nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, từ đó có đợc

đề xuất về việc đa tiêu chuẩn đánh giá sinh khả dụng in vivo rifampicin của các
dạng viên FDC khi kiểm tra chất lợng thuốc điều trị lao.
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng FDC có độ hoà
tan của RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn
về sinh khả dụng.[13, 15], có thể chế phẩm này đảm bảo sinh khả dụng nhng chế
phẩm khác thì sinh khả dụng kém.[20]

1


Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhng cho đến nay, những
thông tin nghiên cứu về yếu tố ảnh hởng đến sinh khả dụng của RMP và những
thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP đợc
công bố rất ít. Những thông tin đầy đủ về việc sử dụng tá dợc, thay đổi quy trình
bào chế vẫn đợc giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công
bố. Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đa ra giải pháp đảm
bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm FDC.
Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc
chống lao dạng FDC có chất lợng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên
sử dụng để điều trị bệnh lao.
Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao
dạng FDC bắt buộc phải đợc đánh giá sinh khả dụng của RMP trớc khi sử dụng
điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế
phẩm này dờng nh ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong
nớc. [14, 31]
Chơng trình chống lao quốc gia (CTCLQG) ở nớc ta cũng đã sử dụng các
thuốc chống lao dạng viên hỗn hợp trong điều trị bệnh lao từ nhiều năm nay và các
chuyên gia đầu ngành lao cũng rất quan tâm đến chất lợng thuốc chống lao của
những dạng bào chế này. Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt nam cha có 1 nghiên cứu
nào tiến hành đánh giá sinh khả dụng của rifampicin (RMP) trong các chế phẩm hỗn

hợp, vì vậy, nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên hỗn hợp là cần thiết.
b/ Kết quả cụ thể
1. Về phơng pháp định lợng RMP trong huyết tơng ngời bằng HPLC:
Phơng pháp định lợng RMP huyết tơng bằng HPLC do chúng tôi xây dựng
đơn giản, dễ tiến hành, có độ đúng, độ chính xác cao, có tính chọn lọc và khoảng
tuyến tính rộng.
Phơng pháp chiết RMP có hiệu suất xấp xỉ 100% với độ lệch chuẩn tơng đối
< 3,5% chứng tỏ phơng pháp có độ đúng cao, có thể áp dụng trong thực nghiệm
xác định nồng độ rifampicin trong huyết tơng. Phơng pháp có độ chính xác cao
với RSD < 1%. Pic rifampicin ở nồng độ 0,2 àg/ml xác định, không trùng với pic
khác, tái hiện, sai khác trung bình khi nghiên cứu độ chính xác là 7,71% (không quá
20% theo quy định của FDA). Kết quả thực nghiệm cho thấy trong huyết tơng
ngời, rifampicin ổn định sau 3 tháng bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ - 40OC.
2. Về nồng độ RMP trong máu của các dạng chế phẩm nghiên cứu:
Việc uống đồng thời RMP với INH và PZA có ảnh hởng tới nồng độ RMP.
2


Cmax của RMP đạt đợc trong huyết tơng bị giảm đi 31,24% và AUC giảm
25,94% khi uống RMP-INH-PZA đồng thời so với uống RMP đơn độc.
Nồng độ RMP cao nhất đạt đợc trong huyết tơng ngời tình nguyện khi
uống viên hỗn hợp Combikits là 6,52 1,84 àg/ml, thấp hơn so với uống viên đơn lẻ
đối chiếu (10,44 2,01àg/ml) và thấp hơn phạm vi điều trị.
Thời gian đạt nồng độ Cmax của rifampicin trong huyết tơng khi uống viên
hỗn hợp Combikits lớn hơn so với viên đơn lẻ, ở phần lớn cá thể đạt Tmax ở 3h,
trong khi ở viên đơn lẻ là 1h
3. Sinh khả dụng tơng đối của RMP trong viên hỗn hợp Combikits đang sử
dụng hiện nay thấp, chỉ đạt 64,95% so với viên đơn lẻ (46% 77% với khoảng tin
cậy 90%).
c/ Hiệu quả về đào tạo

- Đã đào tạo đợc 1 nghiên cứu sinh, 1 thạc sĩ và 2 dợc sĩ đại học.
- Đã nâng cao đợc năng lực nghiên cứu, đặc biệt trong lĩnh vực đánh giá sinh
khả dụng và tơng đơng sinh học cho đội ngũ cán bộ giảng dạy của Bộ môn Dợc
lâm sàng.
- Đã tạo đợc sự hợp tác trong đào tạo và nghiên cứu khoa học với Viện Lao và
Bệnh phổi Trung ơng, Bệnh viện Lao Hà nội và gây đợc sự chú ý của các giáo s
đầu ngành Lao.
d/ Hiệu quả về kinh tế
- Đề xuất với Bộ Y tế đa tiêu chuẩn về đánh giá sinh khả dụng của RMP
trong các dạng chế phẩm FDC khi cho phép chế phẩm lu hành hoặc đấu thầu, tránh
tình trạng đấu thầu phải những sản phẩm kém chất lợng nh hiện nay gây lãng phí.
e/ Hiệu quả về Xã hội:
- Việc phát hiện giảm sinh khả dụng RMP của thuốc Combikits từ đề tài này
đã đem lại lợi ích cho xã hội, tránh tình trạng điều trị kém hiệu quả. Đặc biệt nếu sử
dụng những dạng chế phẩm có nồng độ thấp sẽ dẫn đến tình trạng tạo ra các chủng
vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt nguy hiểm là kháng RMP.
f/ Các hiệu quả khác
- Giúp cho các cơ sở kiểm nghiệm một phơng pháp định lợng RMP từ huyết
tơng ngời có độ ổn định và độ chính xác cao; một quy trình đánh giá sinh khả
dụng và tơng đơng sinh học của RMP.

3


2. áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
- Giúp cho các nhà bào chế trong nớc rút kinh nghiệm nhằm cải tiến quy trình
bào chế thuốc chống lao dạng viên FDC.
- Giúp cho các nhà điều trị thấy rõ vai trò của đánh giá sinh khả dụng của
thuốc.
3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng nghiên cứu đã đợc phê

duyệt
a/ Luôn hoàn thành đúng tiến độ
b/ Đã đạt đợc mục tiêu nghiên cứu đề ra
+ Đánh giá tơng đơng sinh học của rifampicin trong viên hỗn hợp cố
định liều (FDC) hiện đợc CTCLQG đang sử dụng.
+ Rút ra kết luận về chất lợng của rifampicin trong viên FDC để đóng
góp ý kiến cho CTCLQG trong lựa chọn thuốc điều trị.
c/ Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến:
- Phơng pháp chiết xuất và định lợng RMP từ huyết tơng ngời.
- Chất lợng của sản phẩm thử: Combikits.
d/ Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
- Sử dụng hợp lý, tiết kiệm.
4. Các ý kiến đề xuất
Từ những kết quả nghiên cứu trên đây chúng tôi đa ra những đề xuất và kiến
nghị sau:
1. Cần chú ý tới tiêu chuẩn về sinh khả dụng của rifampicin khi đấu thầu mua
thuốc chống lao cũng nh việc nghiên cứu bào chế thuốc chống lao dạng viên hỗn
hợp để đảm bảo bệnh nhân đợc sử dụng thuốc chống lao đảm bảo chất lợng.
2. Có thể sử dụng phơng pháp định lợng RMP huyết tơng để giám sát nồng
độ điều trị những trờng hợp bệnh nhân lao tái trị do đặc điểm giao động giữa các cá
thể về nồng độ RMP trong huyết tơng.

4


Phần B. Nội dung báo cáo
chi tiết kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề
Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều (Fixed dose combination - FDC) là dạng

thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng 1 chế phẩm. Sử dụng
thuốc chống lao dạng FDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và cho thầy thuốc:
đảm bảo vấn đề tuân thủ điều trị của bệnh nhân dễ dàng hơn, thày thuốc kê đơn đơn
giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị đơn trị liệu dẫn tới tình
trạng kháng thuốc. Vì những lợi ích trên WHO/IUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc
chống lao dạng FDC trong chơng trình chống lao của tất cả các quốc gia. Thuốc
chống lao hỗn hợp RMP - INH và RMP - INH- PZA đã đợc sử dụng rộng rãi từ
những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới.
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng FDC có độ hoà
tan của RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn
về sinh khả dụng.[21], [23], có thể chế phẩm này đảm bảo sinh khả dụng nhng chế
phẩm khác thì sinh khả dụng kém.[33] Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng
FDC có sinh khả dụng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém, nguy cơ thất bại
điều trị và sẽ gia tăng các chủng vi khuẩn lao kháng RMP (không còn lợi ích ngăn
chặn tình trạng kháng thuốc). [45]
Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc
chống lao dạng FDC có chất lợng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên
sử dụng để điều trị bệnh lao.
Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao
dạng FDC bắt buộc phải đợc đánh giá sinh khả dụng của RMP trớc khi sử dụng
điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế
phẩm này dờng nh ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong
nớc. [22], [45]
Chơng trình chống lao quốc gia CTCLQG ở nớc ta cũng đã sử dụng các
thuốc chống lao dạng viên hỗn hợp trong điều trị bệnh lao từ nhiều năm nay và các
chuyên gia đầu ngành lao cũng rất quan tâm đến chất lợng thuốc chống lao của
những dạng bào chế này. Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt nam cha có 1 nghiên cứu
nào tiến hành đánh giá sinh khả dụng của rifampicin (RMP) trong các chế phẩm hỗn
hợp, vì vậy, nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên hỗn hợp là cần thiết.
5

Mục tiêu nghiên cứu:
1. Đánh giá tơng đơng sinh học của rifampicin trong viên hỗn hợp cố định
liều (FDC) hiện đang đợc CTCLQG sử dụng.
2. Rút ra kết luận về chất lợng của rifampicin trong viên FDC để đóng góp ý
kiến cho CTCLQG trong lựa chọn thuốc điều trị.

6


2. Tổng quan
2.1. thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều
2.1.1. Sự ra đời của thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều
Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination - FDC) là
dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng 1 chế phẩm. Những
chế phẩm hỗn hợp đầu tiên gồm 2 thành phần (2-FDC) trong đó có isoniazid (INH)
là: INH - PAS, INH- thiacetazon, ra đời ngay sau khi có isoniazid (năm 1952). Khi
có sự ra đời của ethambutol (EMB) và rifampicin (RMP) thì có dạng hỗn hợp INH EMB, INH - RMP, trong các chế phẩm phối hợp 2 thuốc (2-FDC) đợc sử dụng
rộng rãi nhất từ khi ra đời đến nay là hỗn hợp RMP-INH. Hãng Hoechs Marion
Rousel đã đa ra thị trờng chế phẩm hỗn hợp có chứa 3 thuốc RMP- INH- PZA (3FDC) đầu tiên năm 1988, dạng viên hỗn hợp 4 thuốc RMP - INH- PZA- EMB (4FDC) đầu tiên vào năm 1997, cùng thời điểm đó Novatis đa ra viên hỗn hợp 3
thuốc RMP - INH- PZA dành cho trẻ em. [44]
Thuốc chống lao hỗn hợp RMP - INH và RMP - INH- PZA đã đợc sử dụng
rộng rãi từ những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới. Đến nay,
các chế phẩm hỗn hợp chứa 2, 3, hoặc 4 thành phần đợc sử dụng rộng rãi ở nhiều
quốc gia trên thế giới.
2.1.2. Lợi ích của việc sử dụng thuốc chống lao dạng FDC
Sử dụng thuốc chống lao dạng FDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và
cho thầy thuốc: đảm bảo vấn đề tuân thủ điều trị của bệnh nhân dễ dàng hơn, thày
thuốc kê đơn đơn giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị đơn trị

liệu dẫn tới tình trạng kháng thuốc, ngoài ra còn có những lợi ích khác trong thực
tiễn. Đối với thầy thuốc, phác đồ điều trị lao cũng trở nên đơn giản hơn, việc kê đơn
thuốc dễ dàng hơn, giảm những sai sót về tính liều thuốc và tên thuốc khi kê đơn,
việc hớng dẫn bệnh nhân dùng thuốc cũng thuận tiện hơn.
Bệnh nhân dễ tuân thủ điều trị hơn vì số viên thuốc cần phải uống cho một
ngày giảm đi. Chính điều này đã dẫn tới WHO/IUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc
chống lao dạng FDC trong chơng trình chống lao của tất cả các quốc gia.
2.1.3. Chất lợng của thuốc chống lao dạng FDC
Vấn đề lớn nhất gặp phải trong sử dụng thuốc chống lao dạng FDC là phải đảm
bảo rằng viên FDC phải có chất lợng tốt. Chất lợng của thuốc chống lao phụ thuộc
vào quá trình sản xuất: tuân thủ chặt chẽ GMP và các tiêu chuẩn dợc điển. Điểm
7


đặc biệt là dù độ hoà tan của RMP trong viên FDC tốt cũng không đảm bảo rằng
RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng.[21], [23] Những nghiên cứu
trên thế giới cho thấy rằng trong thuốc chống lao dạng FDC, có thể chế phẩm này
đảm bảo sinh khả dụng tốt nhng chế phẩm khác lại có sinh khả dụng kém.[33]
Những yếu tố ảnh hởng đến sinh khả dụng của RMP cho đến nay đã đợc biết đến
nhng cũng cha thật đầy đủ. Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng FDC có
chất lợng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém và sẽ tạo ra tình trạng kháng
thuốc (không còn lợi ích ngăn chặn tình trạng kháng thuốc). [45]
2.2. Sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống lao hỗn
hợp cố định liều
2.2.1. Lý do cần nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên FDC
Ngay từ thời kỳ đầu mới ra đời của các chế phẩm hỗn hợp RMP - INH,
Acocella và cộng sự đã nghiên cứu so sánh nồng độ các thuốc chống lao đạt đợc
trong huyết tơng ngời tình nguyện sau khi uống viên hỗn hợp và riêng lẻ[6]. Năm
1988, trong hội thảo của IUATLD tại Dubrovnik, tiến sĩ Acocella G. (Trờng Đại
học Pavia, Italy) đã báo cáo kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên

FDC cho thấy sinh khả dụng của RMP đặc biệt là dạng 3-FDC rất kém. Những
nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng cùng là dạng thuốc chống lao FDC nhng một
số chế phẩm đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng còn chế phẩm khác thì không. [21]
Năm 1989, Acocella đã công bố trên tạp chí của Hiệp hội bài lao và bệnh phổi
quốc tế về kết quả nghiên cứu về sinh khả dụng của RMP trong một số chế phẩm
thuốc chống lao (4 chế phẩm RMP đơn lẻ, 4 chế phẩm hỗn hợp RMP - INH, 4 chế
phẩm hỗn hợp RMP - INH- PZA) so sánh với các chế phẩm chuẩn đơn lẻ RMP,
INH, PZA. Chỉ có 1 chế phẩm RMP đơn lẻ đợc sản xuất ở châu âu, còn lại các chế
phẩm thử nghiệm trong nghiên cứu này đợc sản xuất và sử dụng ở các nớc châu
á. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy: 4 chế phẩm RMP đơn lẻ đều đạt tiêu chuẩn về
sinh khả dụng, trong khi đó 3 chế phẩm hỗn hợp RMP - INH có 1 chế phẩm nồng
độ RMP trong huyết tơng đạt đợc sau khi uống là rất thấp (giảm 50% so với chế
phẩm chuẩn), 4 chế phẩm FDC 3 thành phần RMP - INH - PZA đều có sinh khả
dụng thấp. [6]
Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc
chống lao dạng FDC có chất lợng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên
sử dụng để điều trị bệnh lao. Sau khuyến cáo trên 5 năm, Pillai và cộng sự (1999) đã
trình bày kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống
lao dạng FDC trên thị trờng thế giới trong tình trạng đáng lo ngại, trong10 chế
8


phẩm hỗn hợp thuốc chống lao FDC lu hành trên thị trờng thế giới có 7 chế phẩm
FDC có sinh khả dụng của RMP kém so với chế phẩm RMP chuẩn đơn lẻ. [33]
Năm 1999, trong Hội thảo của WHO tổ chức tại Geneva, G. Ellard và B.
Fourie đã trình bày những thông tin nghiên cứu về chất lợng của thuốc chống lao
dạng FDC của nhiều tác giả khác và cũng cho thấy sinh khả dụng của RMP ở những
chế phẩm khác nhau có mặt trên thị trờng thế giới trong nhiều năm qua có những
chế phẩm đạt sinh khả dụng, những chế phẩm khác lại rất kém.[21]
Đứng trớc thực trạng trên, năm 1999, WHO đã quy định sinh khả dụng của

RMP trong tất cả các chế phẩm thuốc chống lao dạng FDC bắt buộc phải đợc đánh
giá, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế phẩm này dờng
nh ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong nớc. [22], [45]
Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhng cho đến nay, những
thông tin nghiên cứu về yếu tố ảnh hởng đến sinh khả dụng của RMP và những
thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP đợc
công bố rất ít. Những thông tin đầy đủ về việc sử dụng tá dợc, thay đổi quy trình
bào chế vẫn đợc giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công
bố. Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đa ra giải pháp đảm
bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm FDC.
2.2.2. Vấn đề đánh giá sinh khả dụng của RMP trong viên FDC tại Việt Nam
Thực hiện quy trình đánh giá sinh khả dụng và tơng đơng sinh học của một
chế phẩm thuốc nói chung, đặc biệt là thuốc chống lao dạng FDC ở Việt Nam hiện
nay cũng gặp khó khăn ở nhiều khía cạnh. Về mặt tài chính, cần có kinh phí không
nhỏ chi phí cho ngời tình nguyện khoẻ mạnh tham gia thử nghiệm và cho quy trình
định lợng nồng độ thuốc trong huyết tơng. Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình
định lợng nồng độ thuốc trong huyết tơng vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị
(máy HPLC) cùng với chuyên gia có kinh nghiệm về kiểm nghiệm; nhng định
lợng nồng độ rifampicin trong huyết tơng còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết
tơng để định lợng rifampicin luôn có nhiều thuốc chống lao khác cùng đợc uống
đồng thời. Về mặt thủ tục: do tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên ngời tình
nguyện khoẻ mạnh nên phải đợc Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học
thông qua và cho phép thực hiện.
Với nhiều khó khăn trên, ở thời điểm hiện nay tại Việt nam, ngời nghiên cứu
phải có nhiều nỗ lực để vợt qua. Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh
khả dụng của RMP nói riêng và thuốc chống lao trong viên FDC nói chung sẽ giúp
ích cho chơng trình chống lao quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao
FDC đảm bảo chất lợng. Đồng thời giúp các nhà sản xuất thuốc trong nớc trong
9

việc sản xuất chống lao FDC đảm bảo sinh khả dụng của RMP cũng nh các thành
phần khác. Ngoài ra, đối với cộng đồng, việc đảm bảo chất lợng thuốc chống lao
góp phần điều trị bệnh lao thành công và giảm nguy cơ xuất hiện kháng thuốc, điều
đó có ý nghĩa lớn trong thực tiễn Việt nam hiện nay.
2.3. Phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết
tơng bằng HPLC
Để đánh giá sinh khả dụng của RMP, cần xây dựng đợc phơng pháp định
lợng RMP huyết tơng. Có nhiều phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết
tơng nh phơng pháp đo quang, phơng pháp sinh học, phơng pháp sắc ký, trong
đó, phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phơng pháp phổ biến hơn cả
do có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận
đợc.
2.3.1. Phơng pháp chiết rifampicin từ huyết tơng
Để chiết hoạt chất từ huyết tơng phục vụ cho định lợng thuốc trong huyết
tơng bằng HPCL thờng sử dụng các phơng pháp sau:
-

Phơng pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi. Một số
hỗn hợp dung môi đã đợc nghiên cứu để chiết rifampicin bao gồm
dichloromethan - diethylether, tỉ lệ 2:3 (v/v) [46], diethylether: diclomethane, tỉ lệ
2:1 (v/v) [41], hỗn hợp butanol - chloroform, tỉ lệ 3:7 (v:v) [17].
- Phơng pháp chiết lỏng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt chất.
Mẫu đợc bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó đợc rửa giải bằng hệ dung môi
thích hợp để tách hoạt chất. [39]
- Tủa protein. Phơng pháp tủa protein huyết tơng là phơng pháp đơn giản hơn
cả. Một số dung môi để tủa protein huyết tơng đã đợc nghiên cứu bao gồm
acetonitril [17], [24] (tỉ lệ huyết tơng: acetonitril = 1:1,5 hoặc 1:1); methanol. [30]
2.3.2. Chơng trình sắc ký

Tại Việt Nam, đã có những nghiên cứu về phơng pháp định lợng rifampicin
trong chế phẩm bào chế [4]. Trong chế phẩm bào chế, qui trình chiết và phơng pháp
định lợng thờng đơn giản hơn định lợng trong huyết tơng do tạp (các tá dợc)
thờng có bản chất là chất vô cơ và hàm lợng trong thuốc thờng đã đợc dự đoán
trớc.
Trên thế giới, có nhiều chơng trình sắc ký đợc sử dụng để tách rifampicin ra
khỏi huyết tơng.

10


Bảng 2.1: Một số chơng trình HPLC định lợng rifampicin trong huyết tơng
Tài
liệu
tham
khảo

Cột sắc ký

Pha động

[46]

LiChrosorb RP 8
(250 x 4,6 mm I.D.,
5 àm, Merck)
Tiền cột: C8 (30 àm,
50 mm x 4,6 mm
I.D.)

A: Đệm phosphat
nồng độ 10 mM (pH
3,5)
B: Acetonitril / đệm
phosphat (2:3)

Spherisorb C 8 (250
x 4,6 mm I.D., 5
àm, Phase Sep,
USA)
Tiền cột: C8 (30 àm,
50 mm x 4,6 mm
I.D.)
àBondapak C 18 (30
cm x 3,9 mm, 10
àm)
Spherisorb C 8 (250
x 4,6 mm I.D., 5
àm, Supelco,
Bellafonte, PA,
USA)
Tiền cột: C8
Nova Pack C18 (250
mm x 4 mm, 4 àm)

A: Acetonitril
B: Đệm phosphat
nồng độ 5 mM (pH
3,5)

[41]

[17]

[39]

[30]

Detector
UV
(nm)

Thể
tích
tiêm
(àl)

Thời
gian
lu
(phút)

215

25

9,3

280

20

11,9

2

254

20

7

2

270

60

3,9

1

254

-

6,4

Lu lợng dòng
(ml/phút)

Methanol - 0,05 M
ammonium formate
(65:35)
Acetonitrile- 0,1%
acid trifluoroacetic
(80:20)

Methanol- dung dịch
0,01 M Natri
phosphat pH 5,2
(65:35)

0-5 phút : B tăng
từ 10% - 80%
Từ 5 phút :
- A: 20%
- B: 80%
Tốc độ: 1,5
ml/phút
0-5 phút: A tăng
từ 6-90%
5-12 phút:
- A: 90%
- 10%
Tốc độ: 2 ml/phút

2.3.3. Độ ổn định của rifampicin trong huyết tơng
Rifampicin dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ thờng. Le Guellec và cộng sự [17] tại
phòng thí nghiệm dợc lý và độc tính lâm sàng, CHU Bretonneau, Tours, Pháp tiến

hành nghiên cứu độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tơng kết quả cho thấy
rifampicin bị phân huỷ nhanh chóng ở nhiệt độ thờng (25OC) tới 54% trong vòng 8
giờ, thêm acid ascorbic có thể kéo dài độ ổn định của rifampicin tới 12 giờ.
Rifampicin ở nồng độ thấp bị phân huỷ nhanh hơn. Tuy nhiên, ở nhiệt độ -20OC,
rifampicin ổn định hơn. Rifampicin trong huyết tơng bệnh nhân uống rifampicin
thể hiện độ ổn định cao hơn, có thể do ở điều kiện in vivo, các phân tử rifampicin ổn
định hơn.

11


Một số nghiên cứu về độ ổn định của rifampicin huyết tơng đợc tóm tắt ở
bảng 2.2.
Bảng 2.2: Kết quả các nghiên cứu độ ổn định của rifampicin
Tài liệu
tham

Mẫu bảo quản

khảo
[46]

Mẫu huyết tơng

[46]

Mẫu sau khi chiết

[41]

Mẫu rifampicin tự tạo
trong huyết tơng

[41]
[17]

Điều kiện

Nhiệt độ

Thời gian

bảo quản

bảo quản

ổn định

Thêm acid
ascorbic

- 20OC

6 tháng

- 20OC

1 đêm

- 20OC

6 tháng

- 20OC

6 tháng

- 80OC

12 tháng

Bảo quản
bằng acid
ascorbic

Mẫu huyết tơng bệnh
nhân uống rifampicin
Mẫu huyết tơng bệnh
nhân uống rifampicin

Nh vậy, các tác giả đa ra các kết quả nghiên cứu khác nhau, do đó việc tiến
hành nghiên cứu độ ổn định của rifampicin trong mẫu giả và trong mẫu huyết tơng
bệnh nhân uống thuốc là cần thiết.
2.3.4. Các chỉ tiêu thẩm định phơng pháp định lợng
Thẩm định phơng pháp phân tích là xác nhận độ tin cậy của phép đo hoạt chất
trong môi trờng đã cho bằng thực nghiệm.
Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, hàm
đáp ứng, giới hạn định lợng và độ ổn định của mẫu. Thẩm định phơng pháp theo
hớng dẫn của ASEAN, FDA-US về xây dựng các phơng pháp phân tích sinh học.
[9], [11], [12], [40]

12


3. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tợng nghiên cứu
Ngời tình nguyện khoẻ mạnh (12 ngời), lựa chọn theo các tiêu chuẩn sau:
3.1.1.Tiêu chuẩn lựa chọn
-

Tuổi 18 - 55, không phân biệt giới
Cân nặng 45 - 55 kg
Đợc xác định là khoẻ mạnh dựa trên các dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng.
Chức năng gan, thận, huyết học bình thờng; biểu hiện bằng các chỉ số xét
nghiệm sinh hoá máu (ASAT, ALAT, bilirubin toàn phần, ure, creatinin), các
chỉ số huyết học (số lợng hồng cầu, số lợng bạch cầu, công thức bạch cầu,
hemoglobin), xét nghiệm nớc tiểu (protein, glucose, hồng cầu, bạch cầu)
trong giới hạn bình thờng.
- Có cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu
3.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ:
-

Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú
Tiền sử dị ứng với các thuốc thử nghiệm.
Tiền sử bị động kinh.
Suy gan-thận.
Nghiện rợu, ma tuý, thuốc lá
HBsAg (+)
HIV(+)

3.2. vật liệu và phơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Thuốc nghiên cứu
- Thuốc viên hỗn hợp đang sử dụng trong CTCLQG: biệt dợc Combikit bao
gồm 1 viên 2-FDC (rifampicin-isoniazid) + 1 viên pyrazinamid trong cùng 1 vỉ
(RH+Z), hạn sử dụng 01/ 06 của hãng Lyka labs /ấn độ
- Thuốc chuẩn đối chiếu: rifampicin (R), isoniazid (H), pyrazinamid (Z) đều ở
dạng viên nén. Hàm lợng, tên thơng mại, nguồn gốc, hạn sử dụng, số viên uống
cho mỗi liều đơn nh trong bảng 3.1.

13


Bảng 3.1. Thuốc sử dụng trong nghiên cứu
Thuốc

Tên hoạt chất/
Hàm lợng

Thuốc
nghiên
cứu

Rifampicin 150 mg

Thuốc
đối
chứng

Isoniazid 100 mg

Biệt dợc

Hãng SX/
Nớc SX

Số lô/
Hạn sử dụng
(RH)179G/2774A

Combikit

Lyka labs /ấn độ

Pyrazinamid 500 mg

(Z)179G/2423A
Exp 01/2006

Rifampicin 150 mg

Eremfat 150

Fatol Arneimittel/
Đức

Isoniazid 100 mg

Rimifonđ

Lafal

laboratoires/ Pháp

Pyrazinamid 500 mg

PZA-CIBAđ

Novatis/
Bangladesh

001051
Exp 05/2005
C 122
Exp 04/2008
344M0401
Exp 04/2006

* Đặc điểm của chế phẩm chứa RMP nghiên cứu
Các thuốc sử dụng trong nghiên cứu này không phải là những chế phẩm mới,
đây là những thuốc đang sử dụng điều trị cho bệnh nhân. Đặc điểm về hàm lợng và
độ hoà tan của chế phẩm chứa RMP đơn lẻ và hỗn hợp đã đợc thu thập trớc khi
tiến hành thử nghiệm. Dựa trên phiếu kiểm nghiệm lô hàng khi nhập khẩu của
Trung tâm kiểm định quốc gia (VINACONTROL) cho thấy chế phẩm hỗn hợp chứa
RMP trong thử nghiệm đạt các tiêu chuẩn về hàm lợng (99,7% so với trên nhãn),
độ hoà tan đã đợc đánh giá đạt. Riêng chế phẩm đối chiếu (RMP đơn lẻ) đợc đặt
mua từ nớc ngoài và đã đợc nhà sản xuất kiểm nghiệm lô hàng (hàm lợng RMP
trong chế phẩm 101,7% so với trên nhãn)
Sự khác biệt về hàm lợng RMP của các chế phẩm chứa RMP là không đáng
kể (2%) so với hàm lợng thực ghi trên nhãn.
Những chế phẩm chứa RMP trong nghiên cứu này đạt tiêu chuẩn về hàm
lợng và độ hoà tan.

3.2.2. Máy móc thiết bị
-

Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Spectra System Thermo Finigan
Máy li tâm: Hermle Z200A (Đức)
Máy lắc siêu âm
Cân phân tích: Presia XB220A (Thuỵ Sỹ) với độ chính xác 0,1mg
Tủ lạnh sâu - 40OC
Máy đo pH
14


-

Máy lọc
Các dụng cụ thí nghiệm khác: pipet tự động, pipet thuỷ tinh chính xác, các
dụng cụ thủy tinh thí nghiệm.
3.2.3. Hoá chất thí nghiệm
-

Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid chuẩn quốc tế.
Methanol dùng cho HPLC
Acetonitril dùng cho HPLC
Kali dihydrophosphat: loại tinh khiết phân tích

3.3. Phơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết
tơng
3.3.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết tơng.
Có nhiều phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết tơng, chúng tôi

chọn phơng pháp sác ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do phơng pháp này có độ
chính xác cao, thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận đợc. Phơng pháp
chiết rifampicin và chơng trình sắc ký đợc nghiên cứu nh sau:
Phơng pháp chiết: Mẫu rifampicin chuẩn trong huyết tơng đợc nghiên cứu
chiết với các loại dung môi khác nhau để tìm ra dung môi có hiệu suất chiết cao.
Chơng trình sắc ký
Cột sắc ký:
Khảo sát khả năng tách và định lợng rifampicin trong huyết tơng trên cột
phù hợp, có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích
Pha động
Tiến hành khảo sát nhiều hệ pha động khác nhau dựa vào các nghiên cứu trớc
và độ tan của rifampicin trong dung môi với các tỉ lệ khác nhau để tìm ra hệ pha
động có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích và có thời gian lu hợp lý.
Bớc sóng
Tiến hành quét phổ rifampicin, tìm bớc sóng hấp thụ để xác định bớc sóng
phân tích.
Lu lợng dòng
Thay đổi lu lợng dòng từ 0,7 đến 1,5 ml/phút để tìm lu lợng dòng thích
hợp, có thể tách riêng pic của rifampicin ra khỏi pic tạp và thời gian phân tích hợp
lý.

15


Thể tích tiêm
Thử với một số thể tích tiêm từ 20 - 50 àl để tìm thể tích tiêm cho diện tích pic
phù hợp.
3.3.1.2. Thẩm định phơng pháp định lợng
Sau khi xác định đợc phơng pháp định lợng rifampicin chúng tôi tiến hành
thẩm định phơng pháp theo các chỉ tiêu sau:

Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu huyết tơng trắng (huyết tơng không có rifampicin), mẫu
chuẩn (huyết tơng trắng + rifampicin nồng độ 10 àg/ml), mẫu chuẩn (mẫu huyết
tơng có chứa rifampicin, isoniazid, pyrazinamid) và mẫu thử (mẫu huyết tơng
bệnh nhân 2 giờ sau khi uống hỗn hợp rifampicin, isoniazid, pyrazinamid).
Các mẫu đợc xử lý, chạy sắc ký, so sánh sắc đồ của mẫu huyết tơng trắng,
mẫu chuẩn rifampicin trong huyết tơng và mẫu huyết tơng bệnh nhân uống hỗn
hợp R-H-Z để xác định tính đặc hiệu của phơng pháp.
Độ đúng: Xác định bằng phơng pháp thêm.
Pha 10 mẫu rifampicin trong huyết tơng với nồng độ 8 àg/ml, 5 mẫu đầu
thêm chính xác vào mỗi mẫu 4 àg, 5 mẫu sau thêm vào mỗi mẫu 8 àg. Tiến hành xử
lý, chạy sắc ký, tính tỉ lệ tìm lại rifampicin từ diện tích pic theo công thức sau:
Tổng lợng RMP - Lợng RMP ban đầu
% rifampicin tìm lại =

x 100%
Lợng RMP thêm vào

Độ chính xác
Pha mẫu chuẩn với nồng độ 8 àg/ml, tiến hành xử lý mẫu, chạy sắc ký mẫu 5
lần. Đánh giá độ chính xác qua kết quả đo đợc.
Hàm đáp ứng
Pha dãy nồng độ rifampicin chuẩn trong huyết tơng từ 1 đến 30 àg/ml, tiến
hành xử lý mẫu, chạy sắc ký. Nghiên cứu sự phụ thuộc của diện tích pic thu đợc
với nồng độ rifampicin. Sự phụ thuộc là tuyến tính chặt khi hệ số tuyến tính r gần 1.
Giới hạn định lợng
Từ mẫu huyết tơng có nồng độ 1àg/ml, pha loãng nhiều lần để đợc các nồng
độ nhỏ hơn (0,5 àg/ml, 0,2 àg/ml; 0,1 àg/ml), mỗi nồng độ 5 mẫu. Tiến hành xử lý
mẫu và chạy sắc ký. Xác định nồng độ là giới hạn định lợng thấp nhất khi:
16

- Đáp ứng pic tại giới hạn định lợng thấp nhất 5 lần so với đáp ứng pic
tơng ứng ở mẫu trắng (nếu có)
- Pic của chất phân tích tại giới hạn định lợng thấp nhất có tính xác định,
phân biệt, tái hiện với độ chính xác có hệ số biến thiên không quá 20%.
Độ ổn định của mẫu phân tích
Mẫu huyết tơng bệnh nhân uống rifampicin đợc bảo quản trong ống nghiệm
nhựa, nút kín, ở nhiệt độ - 40OC trong khoảng thời gian 3 tháng. Tại thời điểm một
tháng, hai tháng, ba tháng, mẫu đợc lấy ra phân tích tìm hàm lợng còn lại sau thời
gian bảo quản để xác định độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tơng.
3.3.2. Nghiên cứu sinh khả dụng của RMP
3.3.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu ngẫu nhiên, liều đơn, so sánh chéo ba, ba giai đoạn trên ngời tình
nguyện.
Thiết kế nghiên cứu ngẫu nhiên:
Ngời tình nguyện đợc bố trí ngẫu nhiên thành 3 nhóm thử nghiệm nh
sau:
- 12 ngời tình nguyện đợc mã hoá từ A đến M.
- Chuẩn bị 12 phiếu bốc thăm: 4 phiếu đề nhóm 1, 4 phiếu đề nhóm 2, 4 phiếu
đề nhóm 3.
- Cho ngời tình nguyện bốc thăm để phân ngẫu nhiên 12 ngời thành 3 nhóm
- Kết quả:
Nhóm 1: gồm 4 ngời tình nguyện có mã A, D, E, F.
Nhóm 2: gồm 4 ngời tình nguyện có mã B, C, K, L.
Nhóm 3: gồm 4 ngời tình nguyện có mã G, H, I, M.
Thiết kế nghiên cứu chéo ba, ba giai đoạn:
Mỗi ngời tình nguyện đều trải qua 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn uống một trong
các thuốc sau:
- Rifampicin đơn độc (R)

- Rifampicin- isoniazid- pyrazinamid 3 loại riêng rẽ (R-H-Z).
- Viên Combikit (RH+Z)

17


Trình tự các giai đoạn thử nghiệm của các nhóm nh sau:
Bảng 3.2. Bố trí các giai đoạn thử nghiệm theo từng nhóm
Giai đoạn

Giai đoạn I

Giai đoạn II

Giai đoạn III

Nhóm 1

R

RH +Z

R-H-Z

Nhóm 2

RH+Z

R-H-Z

R

Nhóm 3

R-H-Z

R

RH +Z

Mỗi giai đoạn thử nghiệm cách nhau một tuần. Số viên thuốc cho mỗi liều đơn
nh trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số viên thuốc cho mỗi liều
Tên thơng mại
1
2
3
4

Combikitđ
Eremfatđ 150
Rimifonđ
PZA-CIBAđ

Thành phần

Số viên

RH-Z
R

H
Z

3-3
3
2
3

3.3.2.2. Mô tả phơng pháp tiến hành
Trớc khi tiến hành nghiên cứu, đề cơng chi tiết đã đợc thông qua tại Hội
đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của Trờng Đại học Dợc Hà Nội xem
xét, chấp thuận và cho phép tiến hành. (Phụ lục 7)
Các dữ liệu thu đợc trên ngời tình nguyện đợc ghi vào 1 phiếu theo mẫu.
(Phụ lục 1)
Lựa chọn ngời tình nguyện:
-

Ngời khoẻ mạnh tình nguyện tham gia thử nghiệm đợc thăm khám lâm sàng,
làm xét nghiệm cần thiết (sinh hoá, huyết học, nớc tiểu, HIV, HBV) để lựa
chọn đối tợng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu. Những đối tợng đủ tiêu chuẩn có ký
cam kết tình nguyện mới thu nhận vào nghiên cứu.

Địa điểm khám lâm sàng, uống thuốc và lấy mẫu máu:
-

Địa điểm khám lâm sàng, làm xét nghiệm, uống thuốc, lấy máu và theo dõi
trong quá trình thử nghiệm tại Bệnh viện Việt Nam - Cuba.

-

Theo dõi, lấy máu và xử trí cấp cứu các tình huống bất thờng trong quá trình
thử nghiệm do bác sĩ và y tá đảm nhận.

18


Cho ngời tình nguyện uống thuốc:
-

Cho uống thuốc là ngời của nhóm nghiên cứu.

-

Ngày trớc khi uống thuốc, ăn tối muộn nhất vào lúc 18h. Sáng hôm sau nhịn ăn
sáng. Thuốc đợc uống lúc 7h với 200 ml nớc (nớc tinh khiết đóng chai).
Đợc ăn nhẹ lúc 9h. ăn tra vào lúc 11h sau khi lấy mẫu máu giờ thứ 4.

Tiến hành lấy mẫu máu:
Mẫu đợc lấy nh sau: 0h (trớc khi uống thuốc), 30', 45, 60', 90', 2h, 2h30, 3h,
4h, 8h, 12h, 24h.
-

Số lợng máu của mỗi mẫu là 5 ml, máu tĩnh mạch, chống đông bằng heparin;
trong vòng 15 phút sau khi lấy máu, ly tâm để tách huyết tơng. Mỗi mẫu máu
tách thành 2 mẫu huyết tơng (1ml/mẫu), 1 mẫu để phân tích nồng độ
rifampicin, mẫu còn lại để dự trữ sau khi phân tích số liệu, nếu nghi ngờ có thể
phân tích lại.

-

Huyết tơng tách ra cho vào ống nghiệm bằng nhựa, nút kín, dán nhãn có mã
hoá mẫu, bảo quản trong tủ lạnh sâu - 40oC cho đến khi định lợng. Thời gian
bảo quản mẫu tối đa 1 tháng.

Phân tích định lợng nồng độ RMP bằng phơng pháp HPLC
Sử dụng phơng pháp định lợng RMP huyết tơng đã đợc xây dựng và thẩm
định phơng pháp để định lợng RMP trong các mẫu huyết tơng.
Đánh giá tơng đơng sinh học của RMP từ viên Combikit:
Từ nồng độ đo đợc, xây dựng đờng cong nồng độ - thời gian của mỗi dạng
chế phẩm.
Tính các thông số dợc động học của mỗi dạng chế phẩm (AUCt, AUC0-,
Cmax, Tmax, T1/2 ).
So sánh AUCt, AUC0-, Cmax, Tmax, T1/2 của RMP từ viên Combikit với
dạng uống đơn lẻ và uống 3 viên phối hợp R-H-Z.
3.3.3. Phơng pháp thống kê, xử lý số liệu
3.3.3.1. Tính các thông số dợc động học
Sử dụng phần mềm chuyên dụng WINNOLIN 2.1 để tính toán các thông số
dợc động học RMP dựa trên các số liệu đo đợc từ thực nghiệm. Các thông số dợc
động học chính cần xác định là:
- Cmax - Nồng độ tối đa của RMP/ huyết tơng
19