Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng poly(acid lacticcoglycolic) bao polyethylen glycol

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VĂN MINH
MÃ SINH VIÊN: 1101337

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT SỬ DỤNG
POLY(ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)
BAO POLYETHYLEN GLYCOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NÔI

PHẠM VĂN MINH
MÃ SINH VIÊN: 1101337

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU
PHÂN NANO ARTESUNAT SỬ
DỤNG POLY(ACID LACTIC-COGLYCOLIC) BAO POLYETHYLEN
GLYCOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
2. ThS. Hoàng Thị Hương
Nơi thực hiện:
1. Viện Công Nghệ Dược phẩm Quốc gia

2. Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đối với PGS.TS. Nguyễn
Ngọc Chiến, người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng, giúp đỡ
tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Hoàng Thị Hương, người chị đã hỗ trợ,
hướng dẫn tôi trong quá trình làm thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Hồ Hoàng Nhân, Th.S Bùi Thị Lan Phương,
DS. Bùi Thị Vân, những người anh, người chị đã dìu dắt và chỉ bảo tôi trong suốt thời
gian qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên thuộc
Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế
đã tạo điều kiên về thiết bị, máy móc, dụng cụ, hóa chất và cả thời gian giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo và các Phòng ban
khác, các thầy cô và cán bộ công nhân viên trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy bảo,
tạo điều kiện cho tôi được học tập rèn luyện để hoàn thành khóa học tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân đã luôn bên cạnh
ủng hộ động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 06 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Văn Minh

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1
TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1. VÀI NÉT VỀ TIỂU PHÂN NANO POLYME ...................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm .............................................................................................................. 2
1.1.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme........................................... 3
1.1.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch ....................................... 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ ARTESUNAT ...................................................................................... 5
1.2.1. Công thức .............................................................................................................. 5
1.2.2. Tính chất lý hóa, định tính, định lượng ................................................................. 5
1.2.3. Dược động học ...................................................................................................... 6
1.2.4. Tác dụng dược lý ................................................................................................... 6
1.3. VÀI NÉT VỀ CHẤT MANG PLGA ................................................................................. 7
1.3.1. Cấu trúc ................................................................................................................. 7
1.3.2. Tính chất và ứng dụng ........................................................................................... 8
1.3.3. Một số hạn chế khi sử dụng PLGA ....................................................................... 8
1.4. VÀI NÉT VỀ CHẤT MANG PEG .................................................................................... 8
1.4.1. Cấu trúc, tính chất ................................................................................................. 8
1.4.2. Ứng dụng ............................................................................................................... 9
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ARTESUNAT VÀ HỆ NANO SỬ DỤNG PLGA VÀ PEG ......... 10
1.5.1. Một số nghiên cứu bào chế hệ nano artesunat .................................................... 10
1.5.2. Một sô nghiên cứu bào chế tiểu phân nano sử dụng kết hợp 2 polyme PLGA và
PEG ……….…………………………………………………………………………11


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 14

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .................................................................................... 14
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................... 14
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................................ 15
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU............................................................................................ 15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA-PEG ................ 16
2.3.2. Các phương pháp đánh giá .................................................................................. 17
2.3.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu ................................................ 23
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 24
3.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ART BẰNG HPLC .................... 24
3.1.1. Độ tuyến tính ....................................................................................................... 24
3.1.2. Độ đặc hiệu.......................................................................................................... 24
3.1.3. Độ ổn định hệ thống ............................................................................................ 25
3.2. KẾT QUẢ BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ART-PLGA-PEG .......................................... 26
3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế ...... 26
3.2.2. Thiết kế thí nghiệm và xây dựng công thức bào chế tối ưu ................................ 30
3.2.3. Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ........................ 35
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 41
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ART

Artesunat

ACN

Acetonitril

DC

Dược chất

DCM

Dicloromethan

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DHA

Dihydroartemisinin

EE

Encapsulation Efficiency (hiệu suất mang thuốc)

FT-IR

Fourier Transform Infrared Spectroscopy
(phổ hồng ngoại biến đổi)

HC

Hữu cơ

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)
HPLC

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

KLPT

Khối lượng phân tử

KTTP

Kích thước tiểu phân

LC

Drug loading capacity (khả năng nạp thuốc)

PDI

Polydispersity index (chỉ số đa phân tán)

PEG

Polyethylen glycol

PEO

Polyethylen oxid

PGA

Poly acid glycolic

PLA

Poly acid lactic

PLGA

Poly (acid lactic-co-glycolic)

PPO

Polypropylen oxid

PVA

Polyvinyl alcol


SEM

Scanning Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử quét)

XPS

X-Ray Photoelectron Spectroscopy (Phổ huỳnh quang tia X)

CT

Công thức


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng ............................................... 14
Bảng 2.2. Thành phần của mẫu thử............................................................................... 18
Bảng 2.3. Thành phần của các mẫu trắng tá dược ........................................................ 19
Bảng 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART .................................... 24
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống .................................................... 25
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG .......................................................................................... 26
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG ................................................................................. 28
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính của tiểu phân nano ARTPLGA-PEG ................................................................................................... 29
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG ................................................................................. 30
Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ..................................................... 31
Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa .............................. 31
Bảng 3.9. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 ........................................ 34
Bảng 3.10.Một số đặc tính tiểu phân nano bào chế theo công thức tối ưu .................... 35

Bảng 3.11. Độ ổn định của KTTP nano ART-PLGA-PEG trong các điều kiện ly tâm
khác nhau ...................................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang................................................ 2
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của artesunat...................................................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA ................................................. 7
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của PEG .............................................................................. 9
Hình 1.5. Tiểu phân nano PLGA được bao PEG .......................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG .......................... 17
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART.......... 24
Hình 3.2. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ HC/nước đến
KTTP nano ART-PLGA-PEG ...................................................................... 32
Hình 3.3. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ PLGA-PEG đến
PDI nano ART-PLGA-PEG ......................................................................... 32
Hình 3.4. Mặt đáp thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ HC/nước đến
KTTP nano ART-PLGA-PEG ...................................................................... 33
Hình 3.5. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ DC/polyme tới
khả năng nạp thuốc của nano ART-PLGA-PEG .......................................... 34
Hình 3.6. Hình ảnh chụp SEM của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ......................... 36
Hình 3.7. Ảnh hưởng của các tá dược bảo vệ đến độ ổn định KTTP nano trong thử
nghiệm đông đá-rã đông ............................................................................... 38
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích lũy ART từ hệ tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA ........................................................... 40
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ........................... 17

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART ........... 24
Hình 3.2. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ

HC/nước đến

KTTP nano ART-PLGA-PEG ............................................................................ 32


Hình 3.3. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ PLGA-PEG đến
PDI nano ART-PLGA-PEG ................................................................................ 32
Hình 3.4. Mặt đáp thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ HC/nước đến
KTTP nano ART-PLGA-PEG ............................................................................ 33
Hình 3.5. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ

DC/polyme

tới khả năng nạp thuốc của nano ART-PLGA-PEG ........................................... 34
Hình 3.6. Hình ảnh chụp SEM của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG .......................... 36
Hình 3.7. Ảnh hưởng của các tá dược bảo vệ đến độ ổn định KTTP nano trong thử
nghiệm đông đá-rã đông ..................................................................................... 38
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích lũy ART từ hệ tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA.................................................................. 40


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artesunat (ART) cũng như các dẫn chất khác của artemisinin không chỉ được sử
dụng rộng rãi trong điều trị bệnh sốt rét, mà còn có tác dụng chống ung thư trên một số
dòng tế bào như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt,… [11], [16],
[26]. Nhằm tăng hiệu quả chống ung thư của các dược chất, công nghệ nano với việc

sử dụng các chất mang polyme đã và đang được nghiên cứu [6], [7], [10],…
Poly(acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một polyme có khả năng phân hủy sinh
học, một chất mang thuốc, giúp được bảo vệ dược chất khỏi tác dụng của enzyme, kéo
dài thời gian giải phóng dược chất, và có thể bào chế dưới dạng tiểu phân nano. Tuy
nhiên nano polyme PLGA vẫn có hạn chế như khả năng bị bắt giữ bởi hệ thống thực
bào của cơ thể, tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [24], [27], [36]. Do đó,
polyethylen glycol (PEG) là một polyme thân nước được sử dụng để làm thay đổi đặc
tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA. Chuỗi PEG đóng vai trò như một đám mây thân
nước, làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do
đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của hệ nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các
khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [10], [12], [23],…
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng poly
(acid lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Xây dựng được công thức bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng poly (acid
lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol.
2. Đánh giá được một số đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat bào chế được.


2

TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về tiểu phân nano polyme
1.1.1. Khái niệm
Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích hoặc
phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm, tại đó thuốc được hòa tan, bẫy, bao gói
hoặc phân tán đều trong cốt của tiểu phân nano. Tùy theo phương pháp bào chế mà thu
được siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules). Siêu vi nang có cấu
trúc nhân vỏ như vi nang, còn siêu vi cầu có cấu trúc cốt (matrix) đồng nhất như vi cầu
[4], [31].

Hình 1.1. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang
Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá mang
dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược chất và
hướng dược chất tới đích tác dụng.
Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [4]:
-

Hệ cốt: tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme, siêu vi cầu, tiểu
phân lipid rắn;

-

Hệ màng bao: polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất, siêu vi nang,
liposome, micell, dendrime, ống carbon,…

-

Hệ liên kết: polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết hóa
học.


3

1.1.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Dựa theo quy trình bào chế, có thể chia các phương pháp bào chế nano
polyme làm 2 loại: một giai đoạn và hai giai đoạn.
Phương pháp một giai đoạn dựa trên sự kết tủa của polyme từ một dung
dịch hoặc dựa trên sự kết tập tự phát của các đại phân tử để hình thành các nanogel
hoặc các phức hợp của các chất đa điện phân (polyelectrolyte).
Phương pháp 2 giai đoạn bao gồm giai đoạn đầu chung cho các phương pháp là bào

chế một nhũ tương và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân nano. Giai
đoạn 2 có thể được thực hiện dựa trên phản ứng polyme hoá các monome hoặc các quá
trình kết tủa, gel hoá của các polyme [45].
Các polyme được sử dụng có thể là polyme tự nhiên, các polyme tổng hợp, có sẵn
hoặc tạo thành từ các monome. Tuy nhiên, do các polyme tạo thành từ phản ứng
polyme hoá thường ít phân huỷ sinh học, các monome tồn dư và chất diện hoạt được
dùng với lượng lớn có thể gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [45]. Do vậy,
hiện nay các nghiên cứu sử dụng chủ yếu các polyme có sẵn như các Eudragit và đặc
biệt là các polyme phân huỷ sinh học như PLGA, polylactic acid (PLA),
polycaprolacton (PCL)… [4], [29]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu sử dụng kết hợp các
polyme tổng hợp và polyme thiên nhiên (alginat, chitosan,…) do các ưu điểm của
polyme thiên nhiên như: giá thành thấp, ổn định, an toàn, tương thích với nhiều dược
chất, ít dùng dung môi hữu cơ trong quá trình bào chế [25].
Các phương pháp sau thường được sử dụng trong điều chế tiểu phân nano polyme
từ các polyme tổng hợp có sẵn [4], [29], [45]:
-

Nhũ hoá bốc hơi dung môi.

-

Tự nhũ hoá do khuếch tán dung môi.

-

Thay thế dung môi.

-

Nhũ hoá khuếch tán dung môi.

-

Hoá muối.


4

-

Sử dụng dung môi siêu tới hạn

-

Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ

1.1.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch
Sau khi tiêm tĩnh mạch, sự phân bố của tiểu phân nano có thể xảy ra theo 2 hướng
đó là thanh thải bằng thực bào và phân bố đến cơ qua tổ chức [4].
1.1.3.1. Thanh thải bằng thực bào
Hệ thống thực bào trong cơ thể coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành thanh
thải theo cơ chế bảo vệ của cơ thể. Các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 500 nm dễ bị
thanh thải hơn cả. Sau khi thực bào, tiểu phân được đưa về gan, lách…
Như vậy có thể lợi dụng cơ chế thực bào để chủ động đưa thuốc tới gan, lách,
phổi…và tăng cường ái lực với receptor trên thực bào đơn nhân bằng các ligand có ái
lực. Mặt khác, tổ chức u, viêm là những nơi có quá trình thực bào xảy ra mạnh nhất, trở
thành cơ quan đích của tiểu phân.
Các biện pháp để tránh thực bào, tăng cường phân bố đến các tổ chức:


Ngụy trang tiểu phân nhằm tránh sự nhận diện của tế bào lympho: bao tiểu phân
với các polyme thân nước như PEG, khi đó PEG liên kết đồng hóa trị với các
tiểu phân thân nước như nano albumin, nano PLGA… kéo dài thời gian bán thải



Biến tính bề mặt tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tạo ra cấu trúc cồng
kềnh hoặc bao chất diện hoạt.



Bao tiểu phân bằng các tác nhân phân giải màng lysosome.

1.1.3.2. Phân bố đến cơ quan, tổ chức
Các tiểu phân không bị thực bào dễ dàng đi qua thành mạch mao quản để phân bố
tiếp đến các cơ quan, tổ chức trong cơ thể đặc biệt là các tổ chức u, viêm do tính thấm
tăng lên. Các tiểu phân nhỏ hơn 250 nm (một số nghiên cứu cho là 200 nm) dễ qua
thành mạch, tránh được thực bào [28], [48].
Sau khi qua thành mạch, tùy theo cấu trúc và kích thước, hệ nano được phân bố ở 3
mức độ khác nhau:


5

-

Tới cơ quan đích: gan, lách, phổi…

-

Tới nhóm tế bào đặc biệt (viêm, ung thư, đại thực bào…)

-

Tới nội bào: Do có kích thước ở mức độ phân tử, nhỏ hơn khe hở liên bào và nhiều
liên kết lỏng lẻo trên màng tế bào nên hệ nano có khả năng xuyên qua màng tế bào
vào nội bào. Nếu kích thước lớn hơn, hệ được vận chuyển bằng cơ chế thực bào
hoặc tương hợp với màng tế bào (liposome).

1.2. Tổng quan về artesunat
1.2.1. Công thức
CH 3
H

H3C
O

O

H

O

H

O

CH 3
OCOCH 2 CH 2 COOH

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của artesunat


Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR)-decahydro-3,6,9trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano (4,3-j)-1,2-benzodioxepin-10-ol, hydrogen
succinat.



Công thức phân tử: C19H28O8



Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [1], [42].

1.2.2. Tính chất lý hóa, định tính, định lượng
- Tính chất lý hóa: ART là tinh thể hoặc bột kết tinh trắng. Rất khó tan trong
nước (khoảng 52,6 mg/L ở 25°C), dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong aceton
và ethanol 96% [1], [42]. Artesunat rất dễ bị thủy phân do có nhóm chức lacton và
ester (muối natri của ester hemisuccinat của artemisinin). Tốc độ thủy phân phụ thuộc
vào nhiệt độ, độ ẩm và mức độ kiềm. Do có nhóm carboxylic trong phân tử nên
artesunat có tính acid yếu với pKa ~ 4,35 [1], [42].


6

- Định tính: Phương pháp đo quang, phổ hồng ngoại [1], phương pháp tạo màu
[1], phương pháp sắc ký, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [43].
- Định lượng: Phương pháp đo quang của sản phẩm thủy phân trong môi trường
kiềm ở bước sóng 289 nm, phương pháp HPLC với detector UV bước sóng 216 nm,
phương pháp HPLC với detector điện hóa, phương pháp chuẩn độ acid ‒kiềm [3],

phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ.
1.2.3. Dược động học
Sau khi sử dụng artesunat (ART) bị thủy phân nhanh chóng thành chất chuyển
hóa có hoạt tính là dihydroartemisinin (DHA). Vì vậy, nồng độ ART trong máu rất
thấp. Thời gian bán thải khi tiêm tĩnh mạch của ART là khoảng 2,3 đến 4,3 phút, của
DHA là 40 đến 64 phút [38].
Dữ liệu dược động học nồng độ trong huyết tương ở dạng không liên kết của
artesunat hoặc dihydroartemisinin cần được diễn giải một cách thận trọng vì thuốc tích
tụ chọn lọc trong ký sinh trùng (KST). Trong thí nghiệm in vitro, sự tích tụ của
dihydroartemisinin trong hồng cầu nhiễm KST sốt rét cao hơn 300 lần so với nồng độ
trong huyết tương [42].
1.2.4. Tác dụng dược lý
ART có hoạt tính diệt ký sinh trùng sốt rét gấp 5 lần artemisinin. ART không có
tác dụng diệt giao bào và không tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu, hơn nữa thời
gian tác dụng ngắn nên không dùng làm thuốc dự phòng và không dùng chống tái phát
[2]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu gần đây cho thấy tác dụng chống ung thư của
ART trên nhiều dòng tế bào như tế bào biểu mô, tế bào phổi, thận, bạch cầu,… [11],
[16], [26].
Efferth và cộng sự (2001) đã chứng minh tác dụng chống ung thư của ART trên
55 dòng tế bào ung thư ở người được thiết kế bởi chương trình nghiên cứu các liệu
pháp điều trị của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ. Kết quả cho thấy ART có tác dụng
mạnh nhất với dòng tế bào ung thư bạch cầu và đại tràng với giá trị GI50 là 1,11 ±


7

0,56µM và 2,13 ± 0,74µM tương ứng. Dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ cho
giá trị GI50 cao nhất (25,62 ± 14,95µM) cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với ART. Giá
trị GI50 trung bình có được ở các dòng tế bào ung thư hắc tố da melamona, ung thư vú,
buồng trứng, tuyến tiền liệt, hệ thần kinh trung ương và thận. So sánh với một số thuốc

chuẩn khác đang dùng để điều trị ung thư cho thấy ART có hiệu quả cao và độc tính
thấp hơn [16].
Trong một báo cáo khác về điều trị ung thư thanh quản ở người, bệnh nhân được
tiêm và uống ART trong thời gian 9 tháng. Kết quả đã làm giảm tới 70% kích thước
khối u sau 2 tháng điều trị [37].
Cơ chế kháng ung thư của ART vẫn đang được NC với nhiều giả thuyết được
đưa ra như: gây hiện tượng chết rụng và hoại tử tế bào, ức chế sự hình thành mạch máu
và làm giảm sự biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch máu, gây phá hủy
AND, ngăn chặn con đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin linh động, ức chế sự xâm
lấn và di căn của khối u, ức chế chu kỳ tế bào [16], [47].
1.3. Vài nét về chất mang PLGA
1.3.1. Cấu trúc
Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng
phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau, dime
vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic. Các PLGA khác nhau bởi
tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA 75:25 chứa
75% acid lactic và 25% acid glycolic [24], [27].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA


8

1.3.2. Tính chất và ứng dụng
PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có khả năng
kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với
nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng trong liệu
pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư. PLGA phân hủy sinh học bằng thủy
phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic. Cả hai được chuyển hóa qua
chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc tính thấp [24], [27].

Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA (poly
acid glycolic). Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và thủy
phân chậm hơn. Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất. Ngoài ra, sự phân
hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh,
hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng dược
chất, loại dược chất [24].
1.3.3. Một số hạn chế khi sử dụng PLGA
Khi sử dụng PLGA làm chất mang, sự giải phóng dược chất trải qua hai giai đoạn,
trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình hòa tan và
ăn mòn ở bề mặt [24], [32]. Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt giữ bởi hệ
thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu quả
điều trị và tăng tác dụng phụ [24], [27], [36]. Do đó, nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi
các đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA đã được thực hiện như bao tiểu
phân với polyme thân nước (PEG, chitosan) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu
phân thân nước có khả năng tuần hoàn trong máu lâu hơn và bị tích lũy ở gan ở mức độ
tối thiểu [10], [12], [23], [24], [33], [36].
1.4. Vài nét về chất mang PEG
1.4.1. Cấu trúc, tính chất
Polyethylen glycol (PEG) còn có tên gọi khác là Macrogols có công thức như sau:


9

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của PEG
Các PEG khác nhau về KLPT và có nhiều tính chất lý hóa như tỷ trọng, độ nhớt,
pH, thể chất, điểm đông đặc, điểm nóng chảy khác nhau. PEG 200-600 thường thể
lỏng, PEG có KLPT lớn hơn 1000 thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Tất cả các PEG
đều tan trong nước và có thể trộn lẫn theo bất kỳ tỷ lệ nào với các PEG khác (nếu cần
thiết sau tan chảy). Dung dịch nước của các PEG có KLPT lớn có thể ở dạng gel. Các
PEG dạng lỏng tan trong aceton, alcol, benzen, glycerin. Các PEG rắn tan trong aceton,

dicloromethan, ethanol 95%, methanol [34].
1.4.2. Ứng dụng
PEG được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều dạng bào chế như dạng tiêm, dạng
thuốc dùng ngoài da, nhãn khoa, uống, trực tràng [34].
PEG là một polyme thân nước có khả năng kiểm soát giải phóng dược chất. Công
nghệ PEG hóa góp phần tăng độ hòa tan, độ ổn định, giảm sự kết tụ tiểu phân, giảm
thực bào, kéo dài thời gian lưu trong hệ tuần hoàn. PEG thường kết hợp với PLGA để
đạt được các hiệu quả như trên [10], [12],[24], [33], [36]. Nhóm cuối của PEG có thể
thay đổi thành nhóm aldehyd, amin, carboxylic hoặc methyl làm thay đổi điện tích bề
mặt chất mang tiểu phân nano. PEG thân nước định hướng phía pha nước ngoại của
micell tạo lớp áo bao xung quanh tiểu phân có tác dụng như một rào cản làm giảm
tương tác với các phân tử khác nên làm tăng độ ổn định [24].


10

Hình 1.5. Tiểu phân nano PLGA được bao PEG [24]
1.5. Một số nghiên cứu về artesunat và hệ nano sử dụng PLGA và PEG
1.5.1. Một số nghiên cứu bào chế hệ nano artesunat
Nhằm làm tăng sinh khả dụng và tác dụng chống sốt rét cũng như hướng mục
tiêuđiều trị ung thư, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu bào chế
và đánh giá đặc tính lý hóa, tác dụng sinh học các hệ nano của artemisinin và dẫn chất
trong đó có artesunat.
Với mục đích sử dụng chất mang PLGA bào chế hệ nano chứa ART có tác dụng
chống ung thư in vitro trên một số dòng tế bào ung thư người, Nguyễn Hạnh Thủy,
Nguyễn Ngọc Chiến và cộng sự (năm 2014) đã sử dụng phương pháp bốc hơi dung
môi từ nhũ tương dầu/nước. Tiểu phân nano thu được có KT khoảng 170nm, phân bố
KT hẹp, hiệu suất mang thuốc cao nhất đạt 83,4%, kéo dài thời gian giải phóng đến 48
giờ, ổn định sau 1 tháng bảo quản khi được đông khô với manitol ở tỷ lệ 5% (kl/tt) và
ban đầu cho thấy có tác dụng kháng lại các dòng tế bào ung thư trên mô hình in vitro

như dòng tế bào ung thư biểu mô SCC7, tế bào ung thư phổi người A549 và tế bào ung
thư vú người MCF-7 [32].
Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu trên, Hồ Hoàng Nhân và cộng sự (năm 2015)
đã tiến hành tối ưu hóa công thức và đánh giá các đặc điểm của tiểu phân nano ARTPLGA bao chitosan (CS). Hỗn dịch nano ART-PLGA sau khi tạo thành được thêm vào
dung dịch CS trong acid acetic 1% (tt/tt), trong điều kiện có khuấy từ. Tiến hành tối ưu
hóa với các biến đầu vào là tỷ lệ CS/PLGA, nhiệt độ phối hợp, pH của dung dịch CS;


11

các biến đầu ra là KTTP, PDI, thế zeta. Kết quả cho công thức tối ưu với tỷ lệ
CS/PLGA là 0,4, nhiệt độ là 21,5°C, pH dung dịch CS là 3,2. Các tiểu phân nano ARTPLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu có KTTP khoảng 190 nm, thế zeta chuyển từ
âm sang dương (36,2 ± 1,04 mV), hiệu suất mang thuốc 77,30%, khả năng nạp thuốc
19,97%. Về khả năng giải phóng dược chất in vitro, nano ART-PLGA-CS có khả năng
hạn chế sự giải phóng dược chất ồ ạt trong 24 giờ đầu, có thể do CS làm thay đổi vị trí
ART trên bề mặt tiểu phân nano, giảm sự rò rỉ ART, hoặc do tương tác ion giữa ART
và CS. Kết quả đánh giá độc tính trên tế bào MCF-7 và A549 cho thấy tiểu phân nano
ART-PLGA-CS có khả năng bị hấp thu bởi các tế bào này cao hơn, nghĩa là độc tính
trên tế bào ung thư lớn hơn so với tiểu phân nano ART-PLGA [21].
Với mục đích cải thiện tác dụng trên tế bào ung thư vú của ART, Trần Tuấn Hiệp
và cộng sự (năm 2015, năm 2016) đã tiến hành bào chế nano ART sử dụng chất mang
lipid bằng kỹ thuật đồng nhất nóng và siêu âm. Công thức bào chế tối ưu cho KTTP
117,5 ± 6,1 nm, thế zeta 19,47 ± 0,9 mV, hiệu suất mang thuốc là 92,93 ± 1,47%. Nano
lipid ART cho thấy sự tăng hấp thu trên các tế bào ung thư vú MCF-7, MDAMB-231.
Độc tính in vitro trên các tế bào ung thư vú của nano lipid ART cao hơn so với dạng
ART tự do đã được ghi nhận [39], [41].
Xiao X.-C. và Hong Z.-G. (2010) sử dụng phương pháp kết tủa do thay đổi dung
môi để bào chế siêu vi nang gelatin chứa ART. Ảnh hưởng của các yếu tố như bản chất
dung môi hữu cơ, nồng độ formaldehyd, lượng ART hòa tan, nhiệt độ hòa tan, nhiệt độ
ủ, tỷ lệ gelatin/ART tới các đặc tính siêu vi nang đã được nghiên cứu và xác định.

Phương pháp được đánh giá là đơn giản, KT siêu vi nang đạt khoảng 76 nm, đồng thời
tăng khả năng hòa tan của ART [46].
1.5.2. Một số nghiên cứu bào chế tiểu phân nano sử dụng kết hợp hai polyme
PLGA và PEG
Một trong những biện pháp nhằm khắc phục những hạn chế khi sử dụng PLGA là
bao tiểu phân nano với PEG.


12

Zhiqing W. và cộng sự (năm 2007) đã tiến hành nghiên cứu bào chế và đánh giá in
vitro tiểu phân nano arsenic trioxid (ATO) sử dụng chất mang PLGA-PEG bằng
phương pháp nhũ hóa và khuếch tán dung môi. Kết quả cho thấy KTTP trung bình
120,8 nm; thế zeta -10,73 mV; hiệu suất bao gói 73,60%; tỷ lệ nạp thuốc 1,36%; hình
thái tiểu phân gần hình cầu, không có sự kết tập hoặc bám dính. Nghiên cứu giải phóng
in vitro cho thấy hệ nano ATO-PLGA-PEG có khả năng giải phóng nhiều hơn 26 ngày,
theo phương trình Higuchi (% dược chất giải phóng = 6,3979t1/2 + 3,1529, r2 = 0,9518).
Việc duy trì giải phóng chủ yếu phụ thuộc vào sự khuếch tán dược chất và sự ăn mòn
cốt copolyme, chính điều này làm cho quá trình giải phóng chậm hơn. Điều này chứng
minh PEG đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất.
Nghiên cứu in vitro về tỷ lệ bắt giữ tiểu phân nano bởi đại thực bào ở màng bụng chuột
bằng sử dụng chất đánh dấu rhodamin B cho thấy tỷ lệ bị bắt giữ của nano ATO-PLGA
là 62%, nano ATO-PLGA-PEG không chứa Tween 80 là 24%, nano ATO-PLGA-PEG
chứa Tween 80 là 17% thấp hơn 3,7 lần. Kết quả này có thể do chuỗi PEG đóng vai trò
như một đám mây thân nước và làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta của tiểu phân nano
nên làm giảm tương tác với các thành phần sinh học, giảm hoạt hóa bổ thể, giảm sự
tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào. Ngoài ra, chất diện hoạt không ion hóa như
Tween 80 cũng làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta, do đó làm giảm sự bắt giữ bởi các
đại thực bào [48].
Với mục đích cải thiện chỉ số điều trị và giảm các tác dụng không mong muốn của

paclitaxel sử dụng chất mang Cremophor®EL, Danhier F. và cộng sự (năm 2009) đã
tiến hành bào chế nano Paclitaxel-PLGA-PEG bằng phương pháp nhũ hóa đơn giản và
keo tụ nano. Kết quả, KTTP sử dụng phương pháp keo tụ nano nhỏ hơn so với phương
pháp nhũ hóa đơn giản (112 nm với 190 nm), chỉ số phân bố kích thước tiểu phân của 2
phương pháp đều nhỏ (PDI < 0,2), hiệu suất bao gói của phương pháp keo tụ cao hơn
phương pháp nhũ hóa đơn giản (70% và 37%). Nghiên cứu tác dụng chống ung thư in


13

vivo trên tế bào ung thư cổ tử cung cho thấy hệ nano Paclitaxel-PLGA-PEG ức chế sự
phát triển của khối u tốt hơn khi so sánh với Taxol [12].
Arunkumar R. và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu bào chế nano sử dụng
PLGA-PEG nhằm làm tăng độ tan, sinh khả dụng và tác dụng chống ung thư của
Lutein. Tiểu phân nano Lutein-PLGA-PEG được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm nhũ
tương đơn – bốc hơi dung môi. PLGA (10 mg/mL), lutein (2 mg/mL), PEG (4 mg/mL)
được hòa tan trong 2,5 mL DCM. Nhũ tương nano lutein được hình thành bằng cách
thêm từ từ pha hữu cơ vào 15 mL pha nước có chứa chất diện hoạt PVA (0,5-2,0%),
siêu âm trong 10 phút. Bốc hơi dung môi bằng khuấy từ 600 vòng/phút để tạo thành
nano Lutein-PLGA-PEG dưới dạng hỗn dịch trong nước. Hỗn dịch được ly tâm ở
12000 g trong 1 giờ. Phần cắn được rửa 3 lần với nước cất để loại bỏ chất hoạt động bề
mặt, đông khô thu sản phẩm. KTTP từ 80-500 nm, trung bình 200 nm; độ tan trong
nước tăng 735 lần so với lutein; khả năng kiểm soát giải phóng bền vững 66% trong 72
giờ. Phân tích phổ FT-IR cho thấy không có sự tương tác hóa học giữa lutein, PLGA
và PEG, có thể là lực tương tác yếu giữa các phân tử như liên kết hydro [7].
Qua các nội dung ở trên có thể thấy ở Việt Nam, việc áp dụng các dạng thuốc có
kích thước nano nói chung cũng như dạng nano của artemisinin và dẫn chất nói riêng
vẫn còn hạn chế. Đặc biệt là các hệ nano có những đặc tính cải biến bề mặt. Thiết kế hệ
thống phân phối thuốc nano có thay đổi đặc tính bề mặt giúp kéo dài thời gian tuần
hoàn trong máu, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích, thông qua tương tác

tĩnh điện với màng tế bào ung thư, hoặc thông qua đáp ứng pH, hoặc các thụ thể folat
[18], [40]… Do đó, mục đích chính của nghiên cứu này là tạo ra các tiểu phân nano
polyme ART-PLGA-PEG có đặc tính bề mặt thay đổi nhờ sử dụng polyme thân nước
PEG, đồng thời qua đó đánh giá một số đặc tính hóa lý cơ bản và khả năng kiểm soát
giải phóng dược chất của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG.


14

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng
STT Tên nguyên liệu
1
2

3

5

Artesunat (ART)
Artesunat chuẩn (số lô 0313012.04,
hàm lượng 99,38%)
Poly (acid lactic-co-glycolic ) 50:50,
KLPT 7000-17000 Dalton
PLGA-mPEG (PLGA Mn 1200018000, PEG Mn 2000)

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Sao Kim

DĐVN IV

Viện KN thuốc
trung ương

DĐVN IV

Evonik (Đức)

Nhà sản xuất

Sigma Aldrich

Nhà sản xuất

6

Dicloromethan (DCM)

Trung Quốc

USP 38-NF 33

7

Acetonitril (ACN)

Merck (Đức)

Tinh khiết HPLC

8

Tween 80

Trung Quốc

USP 38-NF 33

9

Acid phosphoric

Trung Quốc

USP 38-NF 33

10

Nước tinh khiết

Việt Nam

DĐVN IV

11

Manitol

Pháp

EP 8.0

12

D(+) trehalose dihydrat

Mỹ

USP 38-NF 33

13

Sucrose

Mỹ

USP 38-NF 33

14

Fructose

Pháp

EP 8.0

15

Lactose

Pháp

EP 8.0

16

Kali dihydrophosphat

Merck (Đức)

Tinh khiết HPLC


15

2.1.2. Thiết bị


Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90
Malvern (Anh)



Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc)



Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Hoa Kỳ)



Máy ly tâm lạnh Hermle Labortechnik GmbH (Đức)



Máy siêu âm Sonics & Materials, Inc.(Mỹ)



Máy lọc nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh)



Máy đo pH Eutech instrument pH 510



Màng thẩm tích 10000 Dalton



Ống ly tâm chứa màng siêu lọc (MWCO 10000 Dalton, Millipore, Merck, Mỹ)



Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ)



Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản)



Máy lắc Vortex Mixter (Đức)



Kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản)



Cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thuỷ tinh khác



Một số thiết bị, dụng cụ khác.

2.2.


Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như tỷ lệ PLGA/PLGA-PEG, tỷ lên

pha hữu cơ/nước, tỷ lệ chất diện hoạt, tỷ lên DC/Polyme đến đặc tính tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG.



Sử dụng thuật toán để thiết kế thí nghiệm, phân tích sự ảnh hưởng của các thành
phần trong công thức và lựa chọn công thức tối ưu.



Đánh giá một số đặc tính của của hệ tiểu phân nano bào chế được từ công thức
tối ưu.