Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất Nhydroxypropenamid mang khung 3spiro1,3dioxolan2oxoindolin hoặc 3spiro1,3ditholan2oxoindolin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

------  ------

PHẠM THỊ HẢO
Mã sinh viên: 1101150

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

------  ------

PHẠM THỊ HẢO
Mã sinh viên: 1101150

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
DS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rât nhiều cố
gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn
chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS Nguyễn
Hải Nam và DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà
Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian
thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã
luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, các anh chị, các
bạn và các em trong nhóm tổng hợp tại bộ môn Hóa Dược đã luôn động viên khích
lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2016
Người viết

Phạm Thị Hảo


MỤC LỤC
Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH LỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

2

1.1. HISTON DEACETYLASE

2

1.1.1. Khái niệm histon deacetylase

2

1.1.2. Phân loại các HDAC:

2

1.1.3. Cơ chế tác động của HDAC đến ung thư

3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

3

1.2.1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

3

1.2.2. Phân loại các chất ức chế HDAC

4

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

5

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI

6

1.3.1. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC

6

1.3.2. Các hướng nghiên cứu dựa trên cấu trúc của SAHA

8

1.3.2.1. Thay đổi nhóm khoá hoạt động

8

1.3.2.2. Thay đổi cầu nối

10

1.3.2.3 Thay đổi cả phần cầu nối và nhóm khóa hoạt động

12

1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC
13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

15

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

15


2.1.1. Hóa chất

15

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

15

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

16

2.2.1. Tổng hợp hóa học

16

2.2.2. Đánh giá tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được

16

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16

2.3.1. Tổng hợp hóa học

16

2.3.2. Thử tác dụng sinh học

17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

21

3.1. HÓA HỌC

21

3.1.1. Tổng hợp hóa học

21

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

29

3.1.3. Xác định cấu trúc

30

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

35

3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

35

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

36

3.3. BÀN LUẬN

37

3.3.1. Hóa học

37

3.3.1.1. Tổng hợp hóa học

37

3.3.2. Tác dụng sinh học

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

44

I. KẾT LUẬN

44

1.1. Về tống hợp và khẳng định cấu trúc

44

1.2. Về hoạt tính sinh học

44

II. KIẾN NGHỊ

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân 13C (Carbon nuclear magnetic
resonance)

1

H-NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân 1H (proton nuclear magnetic
resonance)

DCM

: Dicloromethan

DMF

: Dimethyl formamid

HDAC

: Histon deacetylase

IR

: Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

HCG

: Nhóm khóa hoạt động (Hydrohobic capping group)

HYL-

: Vùng cầu nối sơ nước (Hydrophobic linker)

ZBG

: Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group)

T°nc

: Nhiệt độ nóng chảy

TLC

: Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA

: Trichostatin A

TsOH

: Acid p-toluensulfonic

IC50

: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại HDAC

3

Bảng 1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC

4

Bảng 1.3. Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic được thiết kế, tổng hợp
trong nước

14

Bảng 2.1. Pha mẫu thí nghiệm định lượng HDAC2 Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp của các acid hydroxamic từ ester

29

Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất

30

Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-d

31

Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất IVa-d

32

Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-d

32

Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-d

34

Bảng 3.7: Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu IC50 HDAC của các dẫn chất IVa-d

36

Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất IVa-d

37

Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính của các acid hydroxamic có khung 3hydroxyimino-2-oxoindolin và 3-methoxyimino-2-oxoindolin

40

Bảng 3.10: Kết quả thử hoạt tính của các acid hydroxamic mang cầu nối
heptanamid

41

Bảng 3.11: Kết quả thử hoạt tính của các dẫn chất N-hydroxypropenamid mang
khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin khác

41


DANH LỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mô tả hoạt động của HDAC

2

Hình 1.2. Mô hình chất ức chế HDAC

6

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của acid hydroxamic mang khung indol amid

8

Hình 1.4. Các acid hydroxamic mang khung 2,4'-diaminobiphenyl hoặc
phenylthiazol

8

Hình 1.5. Acid hydroxamic mang khung phenylalanin

9

Hình 1.6. Acid hydroxamic mang nhân quinolin

10

Hình 1.7. Acid hydroxamic mang khung 3-phenyl-N-hydroxy-2-propenamid

11

Hinh 1.8 Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic chứa nhân
3-piperidin-3-ylindol

11

Hình 1.9. Acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl pyrrolyl

12

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học và kết quả thử hoạt tính sinh học của các acid
hydroxamic mang nhân purin

12

Hình 1.11. Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu tại bộ môn Hóa
Dược

13

Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-c

35

Hình 3.2: Hình ảnh 3D của các khung cấu trúc

42


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung

21

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa

21

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa

22

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất IVa

23

Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất IVb

25

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất IVc

26

Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất IVd

28


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ khi histon deacetylase (HDAC) được chứng minh là có liên quan mật
thiết đến chu trình tế bào và sự phát triển của tế bào ung thư, các enzym này đã trở
thành mục tiêu đầy hứa hẹn cho sự phát triển thuốc chống ung thư. Acid
suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®) là chất ức chế histon deacetylase đầu
tiên được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều
trị u lympho da tế bào lympho T. Sau đó, các thuốc nhóm ức chế HDAC liên tục ra

đời và cho đến gân đây FDA đã cấp phép cho panobinostat (Farydak) với chỉ định
điều trị u tủy.
Trên nền tảng đó, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học
Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất định hướng ức
chế HDAC cho kết quả khả quan. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khi thiết kế
nhóm nhận diện bề mặt của các acid hydroxamic bằng vòng thơm như 3spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin thu được nhiều hợp chất rất triển vọng [25]. Bên
cạnh đó, việc thay cầu nối mạch thẳng của acid hydroxamic bằng cầu nối có chứa
nhân thơm cũng thu được một số ứng viên có hoạt tính kháng ung thư cao hơn, đồng
thời có tác dụng chọn lọc trên HDAC [16, 21]. Dựa trên cơ sở này, chúng tôi tiếp tục
thiết kế các dẫn chất mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin, đồng thời khảo
sát hợp chất mang khung 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin với cầu nối 3-phenyl-2propenamid và tiến hành đề tài: “Tổng hợp và thử độc tính tế bào của một số dẫn
chất N-hydroxypropenamid mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin
hoặc 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin” với hai mục tiêu:
1.

Tổng

hợp

N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'-

yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid cùng 2 dẫn chất và N-hydroxy-3-(4-((2'oxospiro[[1,3]dithiolan-2,3'-indolin]-1'-yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế HDAC của
các chất tổng hợp được.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE

Nhiễm sắc thể (NST) được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc là nucleosom. Mỗi
nucleosom gồm 147 cặp base nitơ của ADN quấn quanh một lõi octamer histon hình
đĩa chứa 4 cặp histon (H2A, H2B, H3 và H4) [3, 23].
Khi đầu amin của histon tích điện dương tương tác với phần phosphat mang
điện âm trên phân tử ADN làm đóng xoắn NST gây ức chế dịch mã và tổng hợp
protein, do đó ức chế biểu hiện gen. Việc tích điện dương mạnh hay yếu phụ thuộc
vào quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon thông qua hoạt động của
hai enzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) [14].
1.1.1. Khái niệm histon deacetylase
Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm
acetyl từ -N acetyl lysine amino acid của histon, làm cho các protein histon và ADN
quấn chặt chẽ hơn. Nó có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase - enzym xúc
tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến -amino của lysin ở đầu N của
histon [3, 29].

Hình 1.1. Mô tả hoạt động của HDAC
1.1.2. Phân loại các HDAC:
Cho đến nay, có 18 enzym HDAC của người đã được phát hiện và được phân
thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng của chúng với các HDAC của nấm men [3, 14,
23, 39].


3

Nhóm

Enzym

Bảng 1.1. Phân loại HDAC
Gen của nấm

Đặc điểm

men liên quan
I

HDAC1, 2, 3, 8

RPD3

- Được gọi là những

II

HDAC4, 5, 6, 7, 9, 10

hda1

HDAC “kinh điển”;

IV

HDAC11

III

SIRT1-7

- Phụ thuộc Zn2+
Sir2

- Phụ thuộc NAD+

1.1.3. Cơ chế tác động của HDAC đến ung thư
Các enzym HDAC điều hòa các biểu hiện và hoạt động của nhiều protein liên
quan đến cả sự bắt đầu cũng như quá trình tiến triển của ung thư [13]. Bằng cách loại
bỏ nhóm acetyl khỏi histon, các HDAC gây ổn định và đóng xoắn ADN, từ đó ức chế
quá trình phiên mã [28]. Ngoài ra HDAC còn tác động lên các protein khác không
phải histon mà tham gia vào phiên mã, từ đó ức chế chu trình tế bào. Đồng thời, các
HDAC còn khởi động sự hình thành ung thư bằng sự ức chế biệt hóa tế bào và ức chế
sự chết tế bào theo chương trình. Sau khi khối u đã hình thành, HDAC còn tham gia
điều hòa các gen liên quan đến sự phát triển của ung thư bằng cách thúc đẩy sự hình
thành mạch, cho phép khối u phát triển; tăng cường xâm lấn, giảm bám dính và tăng
di chuyển tế bào, từ đó thúc đẩy sự di căn của khối u [17, 19, 28, 39].
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1.2.1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC tác động lên tế bào ung thư theo 4 cơ chế chủ yếu:
- Kìm hãm sự tăng trưởng tế bào
- Kích hoạt các con đường nội sinh và ngoại sinh gây chết tế bào theo chương
trình
- Phá hủy sự phân chia tế bào
- Gây thoái hóa và tự tiêu tế bào
Ngoài ra, các HDAC còn có nhiều cơ chế chống ung thư khác như: hoạt hóa
protein phosphatase 1, bất hoạt HSP90 chaperonin (protein có vai trò quan trọng trong
quá trình truyền tín hiệu và cân bằng nội mô tế bào) [8, 13, 38, 39].


4

1.2.2. Phân loại các chất ức chế HDAC

Dựa vào cấu trúc hóa học, hiện nay các chất ức chế HDAC được chia thành 6
nhóm [38, 40].
STT
1

Bảng1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC
Nhóm chất ức chế
Một số đại diện
HDAC
Acid hydroxamic

2

Acid carboxylic

3

Aminobenzamid


5

4

Peptide vòng

5

Epoxyketones

6

Các phân tử lai

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc các chất ức chế HDAC gồm 3 phần chính:
- Nhóm khóa hoạt động (Hydrohobic capping group - HCG): là các vòng thơm
hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện bề mặt amino acid.
- Vùng cầu nối sơ nước (Hydrophobic linker - HYL): gồm các hydrocacbon
mạch thẳng hoặc vòng, no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Van der Waals với
kênh enzym.
- Nhóm gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid hydroxamic,
các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton... Nhóm này tham gia
tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC [11, 33, 36].
Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy có nhóm gắn kẽm, cầu nối
và một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong một túi enzym làm lấp đầy khoảng


6

trống trong lòng kênh enzym. Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với
phần vành trên bề mặt miệng túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt có khả năng liên kết
với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp
phần cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC. Trên cơ sở đó, việc thiết
kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc này [4].

Hình 1.2. Mô hình chất ức chế HDAC
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC

Hầu hết các chất ức chế HDAC đều có cấu trúc chung bao gồm 3 phần nhóm
hoạt động bề mặt, cầu nối carbon và vùng gắn kim loại đều ảnh hưởng đến hoạt tính
của chất.
-

Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động:


7

Nhóm khóa hoạt động liên quan tới hiệu lực của enzyme HDAC, nhóm này có
thể là các aryl hoặc vòng thơm khác. Các nghiên cứu cho thấy vòng thơm lớn có tác
dụng tốt hơn vòng thơm nhỏ. Các cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn cho tác
dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I.
Trichostatin A (TSA) là một trong những hydroxamat thiên nhiên đầu tiên
được phát hiện với khả năng ức chế HDAC ở IC50 nhỏ hơn 10 nM đồng thời ức chế
chọn lọc các HDAC nhóm IIa gấp 300 lần. Từ đó có thể thấy sự có mặt của nhóm thế
ở nhóm khóa hoạt động trong công thức của TSA có thể cho tác dụng ức chế HDAC
tốt hơn đáng kể [23].
-

Ảnh hưởng của nhóm gắn kẽm:

Trong cấu trúc acid hydroxamic thì nhóm gắn kẽm chính là nhóm chức acid
hydroxamic và là phần quan trọng quyết định khả năng ức chế HDAC. Khi so sánh
ba thuốc trên lâm sàng: vorinostat, entinostat và acid valproic tương ứng là
hydroxamat, benzamid và carboxylat, kết quả giá trị IC50 thay đổi đáng kể lần lượt
là: 0,110-0,370 mM, 2 mM và 50 mM. Từ đó cho thấy nhóm chức hydroxamic rất
phù hợp với tác dụng ức chế HDAC [23]. Nhiều nghiên cứu phân tích cấu trúc của
nhóm gắn kẽm cũng giải thích cho tác dụng ức chế mạnh HDAC của các acid

hydroxamic [7, 34].
-

Ảnh hưởng của cầu nối sơ nước:

Trong khi nhóm khóa hoạt động và nhóm gắn kẽm đã được nghiên cứu và thay
đổi nhiều thì gần đây một số nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của cầu nối đối với
hoạt tính ức chế HDAC. Các nghiên cứu với những chất có cấu trúc tương tự SAHA,
khi gắn các nhóm thế kỵ nước và vị trí C2, C3 ở vùng cầu nối sẽ làm giảm hoạt tính
ức chế của các acid hydroxamic, với giá trị IC50 ở khoảng mM. Tuy nhiên chất tương
tự SAHA có gắn nhóm ethyl ở vị trí C3 cho thấy tác dụng chọn lọc gấp 12 lần trên
HDAC6 so với trên HDAC3. Từ cơ sở đó có thể đưa ra giả thiết rằng nhóm thế gắn
ở vị trí gần nhóm hoạt động có thể làm tăng khả năng ức chế chọn lọc với HDAC.
Kết quả tương tự cũng thu được khi gắn nhóm thế vào vị trí C6: các dẫn chất 6-methyl
và phenyl cho giá trị IC50 giảm 4 lần so với SAHA. Ngoài ra, nhóm 2-ethylhexyl gắn


8

vào vị trí C6 còn thể hiện hoạt tính ức chế mạnh ở khoảng nM. Ngược lại, thế nhóm
phenyl ở C3 cho hoạt tính giảm 10 lần so với SAHA [9].
Từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động, cầu nối sơ nước
và nhóm gắn kẽm tới việc ức chế HDAC, đã có nhiều công trình trên thế giới tạo ra
các dẫn chất mới dựa trên cấu trúc của SAHA và thu được kết quả rất khả quan
1.3.2. Các hướng nghiên cứu dựa trên cấu trúc của SAHA
1.3.2.1. Thay đổi nhóm khoá hoạt động
Nhiều nghiên cứu đã chứng mình được vai trò quan trọng của nhóm khóa hoạt
động đối với tác dụng chọn lọc trên các HDAC. Trên cơ sở này, việc thay đổi nhóm
này từ cấu trúc chung của các acid hydroxamic là một hướng nghiên cứu đầy triển
vọng.

- Năm 2003, một loạt các acid hydroxamic mang khung indol amid được tổng
hợp bởi Yujia Dai và cộng sự. Những chất này đã thể hiện hoạt tính ức chế HDAC
mạnh và tác dụng chống tăng sinh trên 2 dòng tế bào ung thư tổ chức xơ và ung thư
mô mềm vú [10].

1
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của acid hydroxamic mang khung indol amid
- Năm 2008, Dr. Alan P. Kozikowski và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp acid
hydroxamic mang cấu trúc độc đáo, trong đó nhóm 2,4'-diaminobiphenyl hoặc
phenylthiazol được gắn một cách thích hợp với gốc acid amin tạo nên nhóm nhận
diện bề mặt có đặc tính khác biệt [18].

Hình 1.4. Các acid hydroxamic mang khung 2,4'-diaminobiphenyl hoặc
phenylthiazol


9

Kết quả thử hoạt tính sinh học đã chỉ ra tác dụng vượt trội của các chất trên so
với các acid hydroxamic mang các amino acid ban đầu, các hợp chất này cũng có tác
dụng ức chế mạnh HDAC và có thể ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư tuyến
tụy.
- Cũng năm 2008, nhóm nghiên cứu khác của Đức gồm Stefan Schäfer và cộng
sự đã tổng hợp các acid hydroxamic mang khung phenylalanin và thử hoạt tính của
chúng trên HDAC1 và HDAC6. Các nghiên cứu về liên quan cấu trúc – tác dụng của
biarylalanin ức chế HDAC cho thấy chúng khả năng ức chế chọn lọc HDAC1 và
HDAC6. Hơn nữa, nghiên cứu còn chi ra các thành phần cấu trúc góp phần tăng tính
chọn lọc như: cầu nối carbon và nhóm thế 3 dị vòng, nhưng hợp chất chọn lọc nhất
là hợp chất trung gian với cấu trúc bromophenylalanin [31]. Như vậy, nhóm khóa
hoạt động chứa nhiều dị vòng hoặc có nhóm thế halogen có thể làm tăng tính chọn

lọc trên HDAC.

Hình 1.5. Acid hydroxamic mang khung phenylalanin
- Tiếp tục nghiên cứu về nhóm khóa hoạt động mới, năm 2015, Lei Wang và
cộng sự đã công bố dãy acid hydroxamic mang nhân quinolin. Kết quả nghiên cứu
chỉ ra rằng, acid hydroxamic có cầu nối là mạch thẳng 5 carbon đồng thời gắn nhóm
thế brom trên nhân quinolin của nhóm khóa hoạt động cho hoạt tính ức chế HDAC
và chống tăng sinh tế bào mạnh gấp 2 lần SAHA [36].


10

Hình 1.6. Acid hydroxamic mang nhân quinolin
1.3.2.2. Thay đổi cầu nối
Thay đổi cầu nối trong khung cấu trúc kinh điển là một trong những hướng
nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic mới hiện nay. Các acid hydroxamic có thể
giữ cầu nối carbon mạch thẳng với 5-6 carbon như của SAHA, hoặc có thể mang cấu
trúc khác bằng cách gắn thêm các nhóm thế như methyl, ω-alkoxy, β- lactam [9, 32]
hoặc thay thế cầu nối mạch thẳng bằng cầu nối có chứa nhân thơm tương tự PXD101 - một acid hydroxamic đang được thử nghiệm lâm sàng.
- Watkin C.J và cộng sự đã công bố dãy acid hydroxamic mang cầu nối
phenylpropenamid có tác dụng ức chế HDAC mạnh [37], với PXD-101 là một trong
số đó đã được chứng minh khả năng ức chế HDAC gấp 10 lần SAHA với giá trị IC50
= 27 nM [27].

- Dae-Kee Kim và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic mang
khung 3-phenyl-N-hydroxy-2-propropenamid thế ở 4-phenyl kết hợp với nhóm nhận
diện bề mặt 4-(dimethylamino)phenyl hoặc 4-(pyrrolidin-1-yl)phenyl hoặc một số
nhóm khác cho khả năng ức chế HDAC vượt trội, đặc biệt với HDAC1 [16].

11

Hình 1.7. Acid hydroxamic mang khung 3-phenyl-N-hydroxy-2-propenamid
- Cũng sử dụng cầu nối phenylpropenamid, Young Shin Cho và cộng sự đã
tiến hành tổng hợp một dãy các acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động chứa nhân
3-piperidin-3-ylindol, sự kết hợp này đã tạo ra một cấu trúc thích hợp cho sự tương
tác với HDAC, từ đó đem lại hoạt tính sinh học cao [30].

Hinh 1.8. Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic chứa
nhân 3-piperidin-3-ylindol
Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất có cầu nối phenyl propenamid không
nhóm thế trên vòng thơm cho hiệu quả ức chế HDAC cao.
- Dựa trên khung cấu trúc cơ bản của SAHA, năm 2005, Antonello Mai và
cộng sự đã công bố dãy hợp chất acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl
pyrrolyl là những chất đầu tiên ức chế chọn lọc HDAC II (gấp 7-78 lần so với TSA
và SAHA) [21].


12

Hình 1.9. Acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl pyrrolyl
Như vậy các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất ức chế HDAC có cầu nối mang
vòng thơm có hoạt tính tăng lên đáng kể, đặc biệt acid hydroxamic mang khung
phenylpropenamid đã được chứng minh cho tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư
vú mạnh hơn SAHA [22].
1.3.2.3 Thay đổi cả phần cầu nối và nhóm khóa hoạt động
- Năm 2014, Junghua Wang và cộng sự đã phát triển dãy các acid hydroxamic
có cấu trúc nhóm khóa hoạt động chứa nhân purin. Trong nghiên cứu này, các hợp
chất có gắn 1-3 methylen vào nhân purin cho hoạt tính rất thấp. Tuy nhiên, khi gắn
thêm vòng thơm vào vị trí C2 của nhân purin thì hiệu lực ức chế HDAC tăng đến 60

lần [35].

Chất

IC50 (µmol/L)
HDAC1&2

HDAC1

HDAC6

HDAC8

5r

0.075

0.035

0.0026

0.15

SAHA

0.14

0.051

0.032

0.23

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học và kết quả thử hoạt tính sinh học của các acid
hydroxamic mang nhân purin


13

Kết quả thử thử hoạt tính sinh học cho thấy tác dụng ức chế HDAC 1 và 2 của
những chất này tốt hơn so với SAHA (IC50= 0,14 mmol/L), đặc biệt chúng có tác
dụng tốt chống tăng sinh tế bào khối u, bao gồm MDA-MB231, KG1, PC3 và U937.
1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG
NƯỚC
Cùng với xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược
- Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng sinh
học của một số acid hydroxamic mới hướng ức chế histon deacetylase bằng cách thay
đổi nhóm khóa hoạt động và cầu nối dựa trên cấu trúc của SAHA (hình 1.11) [24].

Hình 1.11. Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu tại bộ môn
Hóa Dược
Kết quả cho thấy nhiều chất tổng hợp được có tác dụng rất tốt khi thử khả năng
ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư [24, 25]
(bảng 1.3). Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt
động và phenylpropenamid làm cầu nối đã tạo ra các chất đầy triển vọng.


14

Bảng 1.3. Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic được thiết kế, tổng

hợp trong nước
Độc tính tế bào IC502 (μM)/ dòng tế bào
Tác dụng
Hợp
ức chế
R
HDAC1
chất
SW620
PC3
AsPC-1
2
(IC50 μM)
7-Cl
0,144
0,065
0,098
0,095
10h
5-Br
0.120
1,408
0,928
0,633
12d
5-Cl
0.199
1,100
0,880
0,820

13c
0,201
3,136
2,879
3,227
SAHA

Ghi chú: 1 Nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC; 2Nồng độ gây ra sự giảm 50%
số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%.

Các kết quả trên đã tạo nền tảng cho khóa luận phát triển hướng nghiên cứu
bằng cách kết hợp cầu nối phenyl propenamid mới nhóm khóa hoạt động mang khung
3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin. Kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong các phần
tiếp theo của khóa luận.


15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
- Các isatin:

- Methyl 3-(4-(bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat

+ Isatin

- Ethylen glycol

+ 5-Cloroisatin

- Hydroxylamin hydroclorid

+ 7-Cloroisatin

- Sắt (III) clorid

- Acid p-toluensulfonic

- Ethylen dithiol

Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF),
tetrahydrofuran (THF), dicloromethan (DCM), methanol, aceton, ethyl acetat, toluen,
natri hydroxyd, natri sulfat khan, kali carbonat, acid hydrocloric, nước muối bão hoà,
nước cất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn
hồi lưu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-210.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.
- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm.
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy Melting point Apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy đo phổ hồng ngoại: Agilent 660 FTIR, Bộ môn Hóa Dược – trường Đại
học Dược Hà Nội.

- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap


16

- Máy sắc ký khối phổ phân giải cao: LTQ Orbitrap XLTM, Khoa Hóa - trường
Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500 MHz, Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 4 dẫn chất:
 N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((5'-cloro-2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop -2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((7'-cloro-2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dithiolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
- Kiểm tra độ tinh khiết
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
2.2.2. Đánh giá tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được
- Thử tác dụng ức chế HDAC.
- Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư
biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3), ung thư tuyến tụy (AsPC-1).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để
tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế.
- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy.