Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------***------

Nguyễn Trung Hiếu

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE KHÁNG
VIRUS PHỔ RỘNG TRÊN CÂY THUỐC LÁ BẰNG
CÔNG NGHỆ RNAi
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Lê Văn Sơn
TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội – 2015
1


MỞ ĐẦU
 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị
kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia trên thế
giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá góp phần tạo công ăn việc làm và thu nhập
cho nhiều đối tượng lao động. Ngoài ra, cây thuốc lá còn được sử dụng làm nguyên
liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực
vật từ hạt. Hơn nữa, với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai tốt, thuốc
lá còn được xem là cây mô hình trong nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản như:

nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở thực vật; nghiên cứu vai trò, chức năng của
gene và protein cũng như làm đối tượng để tiếp nhận gene ngoại lai.
Thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt là các bệnh
do virus gây nên. Cho tới nay, hơn 2000 loại virus gây hại trên thực vật đã được
phát hiện và nghiên cứu, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới
năng suất và chất lượng cây trồng như: bệnh khảm lá chủ yếu là do Tobaco mosaic
virus (TMV) và Cucumber mosaic virus (CMV) gây nên; bệnh xoăn đọt vàng lá,
héo ngọn do virus héo đốm cà chua Tomato spotted wilt (TSWV) và Tomato
yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên. Các virus này gây thiệt hại nghiêm
trọng tới năng suất cây trồng có thể lên tới 95% thậm chí là 100%, làm ảnh hưởng
lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia và trong đó có Việt Nam [3].
Bệnh do virus gây ra không có biện pháp diệt trừ mà chỉ có thể phòng bệnh.
Các biện pháp truyền thống đã được áp dụng để phòng ngừa, hạn chế sự lây lan của virus
như: loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, trồng luân canh giữa các cây trồng,
vệ sinh đồng ruộng... đều không mang lại hiệu quả cao mà còn đòi hỏi nhiều thời gian,
công sức và ảnh hưởng xấu tới môi trường. Việc tìm ra các biện pháp để ngăn chặn sự phát
triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn cấp bách.

2


Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng dụng
sinh học phân tử trong chọn tạo giống cây trồng kháng virus, trong đó, công nghệ
RNA interference (RNAi) là một giải pháp hữu hiệu nhất thông qua việc sử dụng
các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh như gene mã hóa protein vỏ (coat protein,
CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để chuyển vào cây trồng tạo cây
trồng chuyển gene kháng lại chính virus đó. Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công
trong việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo ra giống cây trồng chuyển gene kháng
virus gây bệnh như kiểm soát virus Y ở khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV
(Rice yellow mottle virus) vào cây lúa [34]; kháng virus khảm dưa chuột (CMV)

[11][26], virus khảm thuốc lá (TMV) [12]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình đã
công bố chỉ là chuyển đơn gene hoặc gene kép để tạo cây trồng kháng một hoặc
hai loài virus nhất định, cây trồng vẫn có thể bị nhiễm các loài virus khác. Trên cơ
sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng
virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi”.


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Thiết kế được cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây bệnh hại trên
cây thuốc lá hiện nay.
- Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang các cấu trúc gene đa đoạn.
- Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc gene chuyển.


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus
- Sử dụng các trình tự gene CP của các virus để thiết kế mồi đặc hiệu.
- Ghép nối các đoạn gene.
- Xác định trình tự gene
2. Thiết kế vector RNAi
- Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP của 4 loại virus.

- Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II) bằng kỹ
thuật Gateway.
- Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A. tumefaciens
3


3. Chuyển gene vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A. tumefaciens

- Chuyển gene
- Phân tích cây chuyển gene
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ

1.1.1. Lịch sử phát triển của cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana tabacum và Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ châu
Mỹ, là cây nhiệt đới và á nhiệt đới, có hương vị đặc trưng và được người bản địa
sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo và dùng làm thuốc chữa bệnh [6]. Khi
Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dương, ông đã phát hiện người bản
xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là Tabaccos. Các thông tin về sự
phân bố rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác nhau đã được một số tác giả đưa ra
[13].
Thuốc lá bắt đầu được trồng ở châu Âu vào khoảng những năm 1496 - 1498
do nhà truyền đạo người Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ về. Andre Teve mang hạt
từ Braxin về trồng ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha năm 1556 [9]. Thuốc lá được du
nhập vào trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản từ giữa thế kỷ thứ XVI, ở Ấn Độ vào
khoảng năm 1605. Từ đó, các nước này đã trở thành các nhà sản xuất thuốc lá lớn,
phục vụ cho tiêu dùng nội địa và thị trường thuốc lá thế giới.
Ở Việt Nam, thuốc lá đã được du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh
Tông, nhưng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá mới chính thức được phát
triển tại Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) và ở một số tỉnh miền bắc với
giống ban đầu là Virginia Bland Cash [10].
1.1.2. Phân loại và nguồn gốc
Thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, bộ hoa mõm sói
4

Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35]. Chi Nicotiana có khoảng
50-70 loài, đa số là cây dại, căn cứ vào hì nh thái, màu sắc của hoa người ta phân
chia thành 4 loại chính:
Loài Nicotiana tabacum L. Có hoa màu hồng, đỏ tươi hoặc đỏ thẫm là loài
phổ biến nhất chiếm 90% diện tí ch thuốc lá trên thế giới, hầu hết các giống thuốc
lá sợi vàng thuộc loại này.
Loài Nicotiana rustica L. Có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích, hầu hết
các giống thuốc lá sợi nâu và sợi đen thuộc loại này, thường dùng để nhai, ngửi,
làm thuốc xì gà.
Loài Nicotiana petunioide L. Có hoa màu trắng
, phớt hồng hay tí m
, thường có trong
vườn thực vật học phục vụ nguồn dự trữ gene cho lai
, íttacó
̣ o trong sản xuất
.
Loài Nicotiana polidieide L. Có hoa màu trắng, trong thực tế cũng có í t
trong sản sản xuất, chỉ có trong vườn thực vật học của một số nước.
Các giống thuốc lá sợi vàng có chất lượng cao là Virginia gold, Virginia
blond cash, Virginia bright… được trồng nhiều ở Mỹ, Italia, Bungari, Trung Quốc,
Ba Lan, Đức và một số nước khác ở Nam Mỹ.
Ở Việt Nam, các giống thuốc lá sợi vàng được trồng lâu năm ở Ba Vì và Cao
Bằng, giống Trung Hoa Bài trồng ở các tỉ nh phí a Bắc, các giống C-83, K 51E,
Coker 176, K326, C9-1, Burley và Flue-Cured virginia trồng phổ biến ở Nam và Trung
bộ. Hiện nay, giống thuốc lá N. tabacum L. K326 và C9-1 được trồng phổ biến nhất
[3].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá
Thuốc lá là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm
quan trọng bậc nhất đối với nền kinh tế thế giới.Việc trồng thuốc lá không chỉ trực

tiếp tạo công ăn việc làm cho trên 33 triệu nông dân của hơn 120 quốc gia trên thế
giới mà còn đóng vai trò quan trọng cho toàn bộ nền công nghiệp thuốc lá [13]. Các
hãng sản xuất thuốc lá trên thế giới đều phải thừa nhận rằng thuốc lá đem đến cho họ
5


nguồn lợi nhuận khổng lồ. Ở một số nước như Brazil, Zimbabue, Mỹ, Cu Ba,
Bungari… thuốc lá là một mặt hàng chiến lược, cho thu nhập lớn hơn các các loại
cây trồng khác. Các số liệu thống kê đã ước tí nh khoảng ¼ sản lượng thuốc lá trên
thế giới đã đưa vào kim ngạch xuất khẩu. Ngoài ra, cây thuốc còn giải quyết nhiều
vấn đề khác như luân canh, tăng vụ, tận dụng đất đai, lao động và thu nhập cao hơn
một số cây trồng khác.
Ở Việt Nam, cây thuốc lá được trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ và
Nam Bộ. Đây là cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông
dân và thu nhập cho quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam
(Vinataba) [3] trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu của thuốc lá đạt 47,656 tỷ
đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt
192,136 triệu USD, việc làm của người lao động được bảo đảm, đời sống từng
bước được nâng cao.
Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị về mặt khoa học, thuốc
lá là một trong những cây mô hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối tượng thực
vật như: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… vì nó dễ tái sinh và chấp
nhận gene ngoại lai, có sức sinh trưởng và chống chịu tốt [40]. Trong y dược học, thuốc
lá là dược liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng như chấy, rận, ghẻ, lá khô giã đắp vào
vết thương để cầm máu [50].
1.2.

MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƯỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ

1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá

Hiện nay, năng suất và chất lượng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do bệnh
virus hoành hành. Trong đó, phổ biến và nghiêm trọng nhất là các bệnh khảm lá do
TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra; bệnh xoăn
vàng lá, héo đốm ngọn do các loài virus TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) và
TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1.1).
6


Năm 2008, theo thống kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích
thuộc Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMV và CMV là hai loài virus gây hại chủ
yếu trên cây thuốc lá ở Việt Nam. Bệnh khảm xuất hiện khá sớm với tỷ lệ thấp
(2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng, từ 18,526,5% thậm chí lên tới 100% như ở xã Lâu Thượng, tỉnh Thái Nguyên, trong đó
giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV chủ yếu là K326. Thiệt hại do virus gây ra ở
cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng [3].
Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm nói riêng hiện vẫn chưa có
loại thuốc hoá học nào có thể phòng trị được một cách hữu hiệu, do đó các biện
pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dụng các hạt giống sạch bệnh để trồng, không sử
dụng các hạt giống từ các ruộng trước đó đã bị các bệnh nói trên để làm giống cho
vụ sau. Thường xuyên vệ sinh, kiểm tra đồng ruộng để phát hiện sớm và phun
thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút mang mầm bệnh như: bọ cánh tơ, bọ
phấn trắng, rệp muội, bằng các loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan.
Bảng 1.1. Bệnh virus thường gặp trên cây thuốc lá [49]
Tên bệnh

Tên virus gây bệnh

Khảm linh lăng

Alfalfa mosaic virus (Virus khảm linh lăng)

Quăn ngọn cúc tần

Beet curly top virus (Virus gây bệnh quăn ngọn cây cúc tần)

Ngọn cây bụi

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (Virus gây biến dạng
gân thuốc lá) và Tobacco bushy top virus (Virus ngọn cây bụi
thuốc lá)

Khảm cà chua

Cucumber mosaic virus (Virus gây bệnh khảm dưa chuột)

Vàng chết hoại rau diếp

Lettuce necrotic yellows virus (virus dây bệnh vàng chết hoại
rau diếp) trên Nicotiana glutinosa

Còi cọc cây lạc

Peanut stunt virus

Bệnh hình hoa hồng

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus bây biến dạng
gân lá thuốc lá) và Tobacco mottle virus (virus gây bệnh đốm
thuốc lá)

Kỵ axit thuốc lá

Tobacco etch virus (Virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá)

Xoăn vàng lá ở cà chua

Tomato yellow leaf curl virus (Virus gây xoăn vàng lá ở cây cà

7


chua)
Khảm thuốc lá

Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) và
Satellite Tobacco mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá
vệ tinh)

Hoại tử thuốc lá

Tobacco necrosis virus (Virus gây hoại tử thuốc lá)

Bung hạt thuốc lá

Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá)

Đốm vòng thuốc lá

Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)

Sọc thuốc lá

Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá)

Còi cọc thuốc lá

Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)

Vằn gân lá thuốc lá

Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân lá thuốc
lá)

Héo đốm cà chua

Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua)

Viền gân lá

Potato virus Y (Virus Y khoai tây)

U vết thương

Wound tumor virus (Virus gây bệnh khối u vết thương)

1.2.2. Sơ lược về TMV, CMV, TYLCV, TSVV gây bệnh trên cây thuốc lá
1.2.2.1. Virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus - TMV)
Virus khảm thuốc lá TMV là virus gây bệnh khảm phổ biến trên thực vật
thuộc loài Tobamovirus và được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886) [30],
Iwanowski (1892) [25], Allard (1914) [14] và Stanley (1935) [43]. Virus khảm
thuốc lá có phổ ký chủ rộng, gây bệnh trên hơn 120 loại thực vật khác nhau, nhưng

nhiều nhất là trên cây thuốc lá. TMV lây truyền theo cách thức tiếp xúc cơ giới
thâm nhập vào trong các tế bào qua vết thương, khí khổng lá hoặc qua rễ [7]. Biểu
hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là các lá non chuyển sang màu vàng nhạt, lá nhỏ
lại, trên bề mặt xuất hiện các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm chỗ nhạt. Bên
cạnh đó, còn có các biểu hiện khác như phiến lá hơi nhăn, mặt lá không được
phẳng mà chuyển sang lồi lõm do các gân lá bị kìm hãm sinh trưởng, trong khi thịt
lá vẫn phát triển bình thường.
Dạng tiềm ẩn của bệnh ở các mức độ khác nhau, bao gồm [5]:
- Dạng tiềm ẩn toàn phần: cây hoàn toàn không có biểu hiện của triệu trứng
bệnh.
8


- Dạng tiềm ẩn cục bộ: triệu trứng bệnh xuất hiện ở phần lá non, lá ngọn
nhưng không được rõ ràng.
- Dạng tiềm ẩn tạm thời: chỉ xuất hiện ở một giai đoạn của bệnh, thường là
giai đoạn sau.
- Tiềm ẩn vĩnh viễn: bệnh không biểu hiện triệu chứng trong suốt thời gian
phát triển của cây.
Giải thích cho hiện tượng tiềm ẩn của bệnh là do thời gian ủ bệnh của virus
TMV tương đối dài, nếu cây bị nhiễm bệnh trong giai đoạn trưởng thành, TMV
không kịp biểu hiện triệu trứng của. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng sản phẩm
sau thu hoạch vẫn bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Ngoài ra, trong điều kiện nhiệt độ
cao (> 30 oC) cũng làm mất triệu chứng của bệnh.

Hình 1.1. Bệnh khảm thuốc lá do virus TMV gây ra (Nguồn: internet)

Nghiên cứu ở cấp độ phân tử, vật liệu di truyền của TMV là 1 sợi đơn RNA
đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb và chứa 4 khung đọc mở (ORF). Đầu 5’
của RNA có gắn với 7-methyl guanosine. Những khung đọc mở (ORF) gần đầu 5’

mã hóa 2 protein có trọng lượng phân tử lần lượt là 126 kDa và 183 kDa (Hình 1.2)
[20].

9


RNA đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb và chứa 4 khung đọc mở
(ORF). Đầu 5’ của RNA có gắn với 7-methyl guanosine. Những khung đọc
mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa 2 protein có trọng lượng phân tử lần lượt là
126kDa và 183kDa [18].
6,395 nt

RdRp

CP

Helicase

MP

Hình
1.2.1.2.
Sơ đồ
trúctrúc
genome
của của
TMVTMV
Hình
Sơ cấu
đồ cấu

genome

RdRp - replicase;
replicase; CP
CP--protein
proteinvỏ;
vỏ;helicase
helicase- -enzyme
enzymeliên
liênquan
quan
quá
trình duỗi
tớitới
quá
trình
duỗi xoắn;
- protein
vận chuyển.
Chiều
chiều
xoắn;
MP -MP
protein
vận chuyển.
Chiều
mũimũi
tên tên
thể thể
hiệnhiện

chiều
dịchdịch
mãmã

1.2.2.2. Virus
Viruskhảm
khảmtrên
trêncây
câydưa
dưaleo
leo(Cucumber
(Cucumbermosaic
mosaic virus,
virus, CMV)
CMV)
Bệnh
môđược
tả lầnmô
đầu
là 1916,
Bệnh khảm
khảm trên
trêncây
câydưa
dưaleo
leođược
CMV
tả tiên
lần vào
đầu năm

tiên 1916,
vào năm
mộtmột
trong
những
bệnhbệnh
virusvirus
gây gây
nên trên
là
trong
những
nên thực
trên vật
thựcđược
vật phát
đượchiện
phátsớm
hiệnnhất.
sớm nhất.
Hiện nay,
nay, có
cónhiều
nhiềudòng
dòngCMV
CMVđãđãđược
đượcmô
mô
di truyền
Hiện

tả tả
vớivới
dữ dữ
liệuliệu
di truyền
chứachứa
khoảng 60
khoảng khác
60 protein
trình tựvirus
genome
hoàn chỉnh.
protein
nhau khác
và 15nhau
trìnhvà
tự15
genome
hoànvirus
chỉnh.
Virus
thuộc
loài Cucumovirrus,
họ Bromovirus
Virus khảm
khảm dưa
dưa leo
leo (CMV)
thuộc loài
Cucumovirrus,

họ Bromovirus
và được biết
và được biết đến là virus có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài thực
đến
là virus có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài thực vật [33]. Phương
thức lan truyền của CMV thông qua vật trung gian là các loài rệp, trong đó 2 loài
!
9!
chủ
yếu là Myzus persicae và Aphis gossypii
[27].

Hình 1.3. Cây thuốc lá bị bệnh khảm do virus CMV gây ra (Nguồn: internet)

Các chủng CMV được chia thành hai nhóm I và II dựa trên các phân tích
huyết thanh [24, 46], lai acid nucleic và giải trình tự gene [32]. Giữa nhóm I và II
có mối quan hệ khá xa nhau, hệ gene của chúng chỉ có 75% nucleotide tương đồng.
10


Trong nhóm I lại được chia thành 2 phân nhóm IA và IB với độ tương đồng của
chúng lên tới 92 – 95% [33, 37]. Các chủng CMV phân nhóm IA và nhóm II xuất
hiện gần như trên toàn thế giới, trong khi các chủng thuộc phân nhóm IB lại chủ
yếu xuất hiện ở Châu Á [12].
Khi xem xét ở cấp độ tế bào và phân tử, CMV có dạng hình cầu, đường
kính khoảng 28 – 30 nm và trọng lượng phân tử từ 5,0 – 6,7.106 Da. Vật liệu di
truyền của CMV gồm 3 sợi RNA thông tin (RNA1, RNA2, RNA3) và có 5 khung
đọc mở (ORF). RNA1 gồm có 3357 nucleotide mã hoá cho protein 1a (khoảng 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình và cộng sự (2006), Báo cáo tổng kết đề tài “Thu thập và phân
lập gene virus gây bệnh ở ba cây trồng thuộc họ Cà (Solanaceae) thuốc lá,
khoai tây và cà chua nhằm xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh virus và
tạo vật liệu di truyền cho tạo giống cây kháng bệnh virus”. Báo cáo đề tài cấp
viện giai đoạn 2005 – 2006. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

11


2. Lê Trần Bình (2008), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gene kháng bệnh virus”. Báo cáo đề
tài cấp viện giai đoạn 2007 – 2008. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
3. Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008), Báo cáo theo dõi tình hình sâu
bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ, Viện
kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam
4. Chu Hoàng Hà (2010), “Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virus gây ra
bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi)” Báo cáo tổng kết đề tài. Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam
5. Trần Văn Hai (2009), Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật. Khoa Nông nghiệp, Đại
học Cần Thơ.
6. Trần Đình Long, Mai Thạch Hoành, Hoàng Tuyết Minh, Phùng Bá Tạo, Nguyễn Thị
Trâm (1997), Chọn giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa chuyên ngành Bảo vệ
thực vật. Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội.
8. Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), Giáo trình Cây công nghiệp. NXB Nông nghiệp,
Hà Nội.
9. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật gieo trồng, chế
biến cây thuốc lá, NXB Lao động Hà Nội.
10. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng,

NXB Giáo dục.
11. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình
(2008), “Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật
RNAi”. Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4A): 679-687.
12. Phạm Thị Vân , Nguyễn Minh Hùng , Hà Viết Cường , Lê Văn Sơn , Lê Trần
Bình và Chu Hoàng Hà (2009), Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kỹ
12


thuật RNAi. Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 tại Viện
Nghiên cứu Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận. Tr. 32-40.
Tiếng Anh
13. Akehurt B. C. (1981), “Tobacco”, Longman group Ltd, New York. 764pp
14. Allard, H.A. (1914), “The mosaic disease of tobacco”, US Dep. Agric. Bull. 40.
15. Avidov, H. Z. (1944), “Tobacco whitefliy in Israel”, Tel Aviv: Hassadeh (in
Hebrew), pp. 1-33
16. Baulcombe D. (2004), “RNA silencing in plants”, Nature 431(7006): 356-63
17. Chicas and Macino. (2001), “Charateristics of post- transcriptionnal gene
silencing”, EMBO 2 (11): 992-6
18. Cho, J. J., Mau, R. F. L., Mitchell, W. C., Gonsalves, D., and Yudin, L. S.
(1987), “Host list of plants susceptible to tomato spotted wilt virus (TSWV)”.
Res. Ext. Ser. Univ. Hawaii, Honolulu.
19. Cohen, S. N., Chang, A. C. Y. & Hsu, L. (1972), Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A.
69, 2110-2114.
20. Collmer, Vogt, and Zaitlin. (1983), “The H protein was comprised of a
backbone of TMV”, Virology 126:429-448.
21. Czosnek, H., Ber, R., Antignus, Y., Cohen, S., Navot, N., & Zamir, D. (1988),
Isolation of tomato yellow leaf curl virus, a geminivirus. Phytopathology 78,
508-512
22. Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, and Sonnowald U. (1996), “Systemic

acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase possible
hexose sensing in the secretory pathway”. Plant Cell 8: 793-803
23. Hull R, Davies JW (1992), “Approaches to nonconventional control of plant
virus diseases”, Crit Rev Plant Sci 11: 17-33
13


24. Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M. (1995), “Biomoleccular
and serological methods to identify strains of cucumber
mosaic cucumovirus
on tomato”, EPPO Bulletin 25: 321- 327
25. Iwanowski, D. (1892), “Concerning the mosaic disease of the tobacco plant”,
St. Petersb. Acad.Imp. Sci. Bul. 35: 67-70.
26. Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M. (2002), “The occurrence of CMV2
specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus derived doublestranded RNA is indicative of resistance to the virus”, MPMI 15(8): 8262833
27. Karen_Beth G. Scholthof (2004), “Tobacco Mosaic Virus: A Model system for
plant biology”, Annu. Rev. Phytopathol 42:13-34
28. Kormelink, R., Kitajima, E. W., De Haan, P., Zuidema, D., Peters, D., and
Goldbach, R. (1991), “The nonstructural protein (NSs) encoded by the
ambisense S RNA segment of tomato spotted wilt virus is associated with
fibrous structures in infected plant cells”, Virology 181: 459-468
29. Lazarowitz, S. G. (1992), “Geminiviruses: Genome structure and gene
function”, Crictic Rev. Plant Sci. 11: 327 - 349.
30. Mayer, A. (1886), “Concerning the mosaic disease of tobacco”. Die
Landwirtschaftliche Versuchsstationen 32:451-467. Translation published in
English as Phytopathological Classics Number 7 (1942). American
Phytopathological Society Press. St. Paul, MN.
31. Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., & Cozosnek, H. (1991),
“Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a
single genomic component”. Virology 185, 131-161.
32. Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E. and Robbins T.W.

(1990), “Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions
in Man”, Neuropsychologia, 28 (10), 10211034
14


33. Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. i. B. (1992),
“Cucumber mosaic virus”, Adv, Virus Res. 41: 281-348
34. Pinto YM, Kok RA, Baulcombe D. C. (1999), “Resistance to rice yellow
mottle virus (RYMV) in cultivated African rice varieties containing RYMV
transgenes”, Nat Biotechnol 17: 702-707
35. Reed S. M. (1993), “Use of stomatal size to distinguish between haploid and
dihaploid tobacco plants”, Tobbaco Sciences 37: 84-86.
36. RN. (1999), “Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus:
discovery mechanisms and exploitation”. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354:
659-664
37. Roossinck MJ. (2002), “Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as
deduced by phylogentic analyses”, J. Virol. 76: 3382- 3387
38. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. (1989), “Molecular Cloning: a Laboratory
Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
39. Samuel, G., J. G. Bald, and H. A. Pittman (1930), “Investigations on spotted
witl of tomatoes”. Australian Counc. Sci. Indus. Res. Bull. No. 44. 64 pp.
40. Shinichiro K, Atsuko M, Masamichi N, and Yutaka T. (2007), “Transgenic
Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus
based on RNA silencing”. Plant cell report 1283-1288.
41. Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson A. O. (1993), “Control of Plant virus
diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants”, Plant Physiol
102: 7-12
42. Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse P. M.
(2000), “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”, Nature 407: 319-20
43. Stanley, W.M. (1935), “Isolation of a crystalline protein possessing the

properties of tobacco mosaic virus”, Science 81:644-645.
15


44. Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J. (2004), “RNA interference as a new
biotechnological tool for the control of virus diseases in plants”, Virus Res.
102(1): 85-96
45. Topping J. F. (1998), “Tobacco transformation”. In Foster GD, Taylor SC
(ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance.
Humana Press, Totowa, NJ 81: 365-485.
46. Wahyuni, W.S., Dietzegen, R. G., Hanada, K., and Francki, R.I.B. (1992),
“Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II
strains of cucumber mosaic virus”, Plant Pathol. 41: 282- 297
47. Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB. (1998), “Virus resistance and gene
silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and
antisense RNA”, Proct Natl Acad Sci USA 95(23): 13959-13964.
48. Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot
M, Gafni Y. (2007), “Production of siRNA targeted against TYLCV coat
protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the
virus”, Transgenic Res. 16(3): 385-98.
Nguồn Internet
49. />50. />
16