Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

Nguyễn Hồ ng Nhung

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG
BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN
UNG THƯ VÚ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội-2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

Nguyễn Hồ ng Nhung

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG
BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN
UNG THƯ VÚ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái
TS. Đỗ Minh Hà

Hà Nội-2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối
với thầy, PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt
quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Thầy đã mở ra cho em những vấn đề
khoa học rất lý thú, hướng em vào nghiên cứu các lĩnh vực hết sức thiết thực và vô
cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Em đã
học hỏi được rất nhiều ở Thầy phong cách làm việc, cũng như phương pháp nghiên
cứu khoa học.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến TS. Đỗ Minh Hà và thầy giáo, cô giáo
trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô
giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy dìu dắt
tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đã tận tình giúp đỡ và chỉ
bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng Proteomics và
Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và
Protein, các bạn học viên cao học và các em sinh viên làm việc tại phòng, những
người đã làm cùng tôi, luôn ở bên tôi lúc thất bại hay những lúc thành công.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi của PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học KHTN,
sự giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bê ̣nh , bệnh
viện K, Hà Nội trong việc cung cấp mẫu nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Luận văn được thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí củađề tài cấp
nhà nước (mã số KC.04.10/11-15). Tôi xin chân thành cảm ơn.

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố , Mẹ người đã v ất vả nuôi con khôn
lớn và dạy con những bài học làm người đầ u tiên
, con cảm ơn ông bà, cô
chú…những người thân của con, những người luôn dành tình cảm và những lời
động viên con.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè của tôi , những người luôn ủng hộ và
giúp đỡ tôi.
Hà Nội, tháng 8 năm 2015
Học viên


Nguyễn Hồng Nhung


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribonucleic

APS

Ammonium persulfate

ARN

Acid Ribonucleic

ATP

Adenosine Triphosphate

AcN

Acetonitrile

Bp

Base pair (cặp bazơ)

cs

cộng sự

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

HCC

Ung thƣ biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma)

HPLC

Sắc

kí

lỏng

hiệu

năng

cao

(High-performance

liquid

chromatography)
MT/mt

Mitochondria (ti thể)

mtADN

ADN ti thể (mitochondrial DNA)

nADN

ADN nhân (nuclear DNA)

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction)

Smac/DIABLO

Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp của
protein gắn trong quá trình apoptosis trong điều kiện pI thấp.
(Second

mitochondria-derived

activator

of

inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)
TEA

Triethylamine

TEAA

Triethylammonium acetate

tARN

ARN vận chuyển (transfer RNA)

rARN

ARN ribosome (RNA ribosome)

caspase/direct

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu

Bảng 2

Thành phần hóa chất chạy HPLC

Bảng 3

Thành phần phản ứng PCR

Bảng 4

Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl

Bảng 5

Công thƣ́c đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm

Bảng 6

Bảng 7

Bảng 8

Bảng 9

Bảng 10

Bảng 11

Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn
400bp/100bp khác nhau
Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số lƣợng mt/ACTB khác
nhau
Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thƣ vú
và bệnh nhân u xơ vú
Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thƣ
vú
Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thƣ vú
và bệnh nhân u xơ vú bằng phƣơng pháp ImageJ
Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thƣ
vú phân tích bằng phƣơng pháp ImageJ


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Phân bố gen trên ADN ti thể

Hình 2

Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Hình 3

Chƣơng trình chạy HPLC

Hình 4

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB
Hình ảnh điện di ADN t ổng số tách chiết t ừ mô vú của bê ̣nh nhân

Hình 5

ung thƣ vú (điê ̣n di trên gel agarose

0,8% và nhuộm ethidium

bromide)
Hình 6
Hình 7
Hình 8
Hình 9
Hình 10

Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và
200_400bp
Hình ảnh điện di s

ản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel

agarose 1,7%
Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau
trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của

các mẫu khác nhau
Hình ảnh khu ẩn lạc sau khi plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli DH5α.

Hình 11

Hình ảnh điê ̣n di sau khi tách plasmid

Hình 12

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB

Hình 13

Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt

Hình 14

Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB

Hình 15

Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số hàm
lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp

Hình 16

Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số mt/ACTB.

Hình 17

Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB ở các loại mẫu

Hình 18
Hình 19

Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung
thƣ vú.
Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thƣớc khối u ở bệnh


nhân ung thƣ vú
Hình 20
Hình 21

Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ
Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích bằng
phƣơng pháp ImageJ


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Error! Bookmark not defined.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

Error! Bookmark not defined.

1.1.

TỔNG QUAN VỀ TI THỂ

Error! Bookmark not defined.

1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ti thể Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Những biến đổi ti thể và bệnh ung thƣError!

Bookmark

not

defined.
1.2.

TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÚ Error! Bookmark not defined.

1.2.1. Phân loại ung thƣ vú

Error! Bookmark not defined.

1.2.2. Các giai đoạn của ung thƣ vú

Error! Bookmark not defined.

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ

Error! Bookmark not defined.

1.3.
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ
Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ
Error! Bookmark not defined.
1.4.

CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ

Error!

Bookmark not defined.
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Error!

Bookmark not defined.
2.1. ĐỐI TƢỢNG

Error! Bookmark not defined.

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Error! Bookmark not defined.

2.1.2. Hóa chất

Error! Bookmark not defined.

2.1.3. Dụng cụ

Error! Bookmark not defined.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.

2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích
định lƣợng:
Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Định lƣợng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ
Bookmark not defined.

Error!


2.2.4. Tính toán thống kê

Error! Bookmark not defined.

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.
3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔError!

Bookmark

not

defined.
3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI Error!

Bookmark not defined.
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ
PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH IMAGEJ
Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN

Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ

Error! Bookmark not defined.

PHỤ LỤC

Error! Bookmark not defined.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Anh:
1. Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H,
Sancho M. (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial
DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and
single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685.
2. Anderson S., Bankier A. T., Barrell B. G., de Bruijn M. H. L., Coulson A.
R., Drouin J., Eperon I. C., Nierlich D. P., Roe B. A., Sanger F., Schreier P.
H., Smith A. J. H., Staden R.

& Young I. G. (1981), “Sequence and

organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465.

3. Bassam B. J., Caetano-Anollés G. and Gresshoff P. M. (1991), “Fast and
sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal. Biochem,
196 (1), pp.80-83.
4. Bianchi M., Bianchi N. and Bailliet G. (1995), “Mitochondrial DNA
mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”,
Cytogenet Cell Genet, 71, pp.99-103.
5. Carew J. and Huang P. (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mol.
Cancer, 12, pp.1-12.
6. Chester K.A., Robson L., Begent R.H., Pringle H., Primrose L., Talbot I.C.,
Macpherson A.J., Owen S.L., Boxer G., Malcolm A.D. (1990), “In situ and
slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon
shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162,
pp.309-315.
7. Dimauro S. (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci. Rep, 27 (1–3),
pp.5-9.
8. DiMauro S. and Schon E. (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human
disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26.
9. Hileman E.O., Achanta G., Huang P. (2001), “Superoxide dismutase: an
emerging target for cancer therapeutics”, Expert Opin Ther Targets, 5,
pp.697-710.


10. Hockenbery D. (2002), “A mitochondrial achilles heel in cancer?”, Cancer
Cell, 2, pp.1-2.
11. Jerónimo C., Nomoto S., Caballero O.L., Usadel H., Henrique R., VarzimG.,
OliveiraJ.,

Lopes

C.,

Fliss

MS.

Sidransky

D.

(2001),

“Mitochondrialmutations in earlystageprostatecancer and bodily fluids”,
Oncogene, 20, pp.5195-5198.
12. King MP., Attardi G. (1989), “Human cells lacking mtDNA: repopulation
with exogenous mitochondria by complementation”, Science , 246, pp.500503.
13. Kornburg H. (1987), "Tricarboxylic acid cycles," Bioessays , 7, pp. 236-238.
14. Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M. & Howell N. (1997),
“Mammalian mitochondrial genetics, heredity, heteroplasmy and disease”,
Trends Genet, 13, pp.450–455.
15. Lin C.S., Wang L.S., Tsai C.M., and Wei Y.H. (2008), “Low copy number
and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor
progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact.
Cardiovasc. Thorac. Surg., 7 (6), pp.954-958.
16. Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong
L.C., Ngan H.Y. (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA
mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer Res, 61, pp.5998-6001.
17. Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R. and Wang X. (1996) , "Induction of
apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and
cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157.
18. Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D. & Poulton J.

(1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an
mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775.
19. Modica-Napolitano J.S., Singh K.K. (2002), “Mitochondria as targets for
detection and treatment of cancer”, Exp Rev Mol Med, 4 (9), pp. 1-19.


20. Montoya J., Ojala D., Attardi G. (1981), “Distinctive features of the 5'terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290
(5806), pp.465-70.
21. Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi
M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C
Rabitti., Fazio VM., Sidransky D. (2001), “Detection of mitochondrial DNA
mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates”, Cancer Res,
61, pp.7623-7626.
22. Pinz KG. & Bogenhagen DF. (1998) “Efficient repair of abasic sites in DNA
by mitochondrial enzymes”, Mol Cell Biol, 18, pp.1257–1265.
23. Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J.K., Markowitz S.D., Trush
M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B. (1998), “Somatic mutations of the
mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291293.
24. Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M. (1992)
“Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in
benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168.
25. Shuster R.C., Rubenstein A.J. & Wallace D.C. (1988), “Mitochondrial DNA
in anucleate human blood cells” Biochem Biophys Res, 155, pp.1360-1365.
26. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers
G.M., Mangion J., Jacotot E. Costantini P., Loeffler M., Larochette N.,
Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G.
(1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing
factor” Nature, 397, pp.441-446.
27. Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H. (2002), “Mitochondrial
superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high

and low potential pathways” Free Radic Res, 36, pp.381- 387.
28. Taanman J.W., Street R. H., and L. Nw (1999), “The mitochondrial genome :
structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta,
1410 (2), pp.103-123.


29. Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J. (2002), “Comprehensive scanning of somatic
mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972976.
30. Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W. and Yuan J.
(2013), "Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer
risk" PLoS One, 8(6), e65968.
31. Wang Y, Liu V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y. (2006),
“Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer
progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91.
32. William L.D., John S.S. (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health
Sciences, pp.169-179.
33. Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005),
“Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric
cancer”, Genes Chromosomes Cancer, 44, pp.19–28.
34. Warburg O. (1956), “On the origin of cancer cells”, Science, 123, pp.309314.
35. Xia P., An H., Dang C., Radpour R., Kohler C., Fokas E., Engenhart-Cabilic
R., Holzgreve W. and Zhong X. (2009), “Decreased mitochondrial DNA
content in blood samples of patients with stage I breast cancer”, BMC
Cancer, 9, pp.454.
36. Yamada S., Nomoto S., Fujii T., Kaneko T., Takeda S., Inoue S., et al
(2006), "Correlation between copy number of mitochondrial DNA and
clinico-pathologic parameters of hepatocellular carcinoma", Eur J Surg
Oncol, 32, pp.303–7.
37. Ye C., Shu X., Wen W., Pierce L., Courtney R., Gao Y., Zheng W. and Cai
Q. (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in

sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Res. Treat,
108 (3), pp.427–34.
38. Yin P.H., Lee H.C., Chau G.Y., Wu Y.T., Li S.H., Lui W.Y., Wei Y.H., Liu
T.Y., and Chi C.W. (2004), “Alteration of the copy number and deletion of


mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma”, Br. J. Cancer, 90
(12), pp.2390–6.
39. Yu M., Zhou Y., Shi Y., Ning L., Yang Y., Wei X., N. Zhang, X. Hao, and
Niu R. (2007), “Reduced mitochondrial DNA copy number is correlated
with tumor progression and prognosis in Chinese breast cancer patients”,
IUBMB Life, 59 (7), pp. 450–457.
Tài liệu trang web
40. (20.05.2014)
41. (30/1/2015)
42. (12.05.2014)
43. />44. />