Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

t bin gen tARN và ND3 ca ADN
ty th  bi trc tràng


Nguyn Th Ngc Tú

i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: PGS.TS. Trnh Hng Thái
o v: 2012


Abstract: Tng quan v t bin Gen tARN và ND3 ca ADN ty th  bnh nhân ung
i trc tràng: Ty thi trt bin ADN ty th và b
i trc tràng. Tin hành nghiên cu: Tách chit ADN tng s t mô; 




gen 10398  3243 

 n di kim tra
sn phm PCR và sn phm ct bng enzym gii hn; Tinh s
giá các kt qu c: Kt qu t bim A3243G ca Gen tARN Ty th
bng k thut PCR-RFLP; Kt qu a Gen ND3 ADN Ty
th bng k thut PCR-RFLP.

Keywords: Sinh hc thc nghim; t bin gen; i trc tràng; Ty th; Di
truyn hc hóa sinh

Content
M U
Ty th là bào quan ph bin  các t bào nhân chun. Ty th c coi là 
ng ca t bào,  n ra quá trình chuyn hóa các hp cht hng mà
t bào có th s dc là ATP. Ngoài ra, ty th còn  trng trong nhiu quá
trình chuyn hóa apoptosis (quá trình t cht ca t bào), u khin tín hiu Calci,
u khii cht ca t bào, tng hp nhân Heme, tng hp Steroid [32]. Cho
c trên 150 bnh di truyn theo mu h khác nhau do ADN ty
th quynh. Các bnh do ri lon ADN ty th c biu hin rng, chúng có
th n ri lon quá trình mã hóa protein hon ch là nht bin do thay
i các nucleotide [57].
 lng ri lon ty th n các bnh ty th c xem
là mt trong nhng mc tiêu nghiên c n ca di truyn hc và y hc. c bi ng
nghiên cu s dng ADN ty th  t ch th sinh hc  trin nhanh chóng trong
nhin các bnh chuyn hóa him gp, lão hóa, c
tính di truyn qun th s dng các du chun di truyn ca m c này phi
k   c s quan tâm ca nhiu nhà khoa hc.
i trc tràng là mt trong các lo bin nht trên th ging hàng
th  qun  nam gi n gii. Trên th gii có khong 3,5
triu bnh nhân mc bnh này và hàng nng hp mc phát
hin [79].  Vii trm mt t l ng th hai v t l
mc bnh cng tiêu hóa, ch  dày.  c hiu qu u
tr tt thì bnh nhân cc chm càng tt. Vi s phát trin ca khoa hc, ngày
nay nghiên cu  m phân tu v t bin ADN ty th
càng góp phn vào công tác chu tr bnh có hiu qu.
Trong khuôn kh lun v tài nghiên cu:
  t bin gen tARN và ND3 ca ADN ty th  b    i trc

vi m
 Phát hin t bin gen tARN và ND 3  ADN ty th  bi

trc tràng bng k thut PCR-RFLP.
 i liên 

 t bin gen tARN và ND 3  ADN ty th vi các
m lâm sàng ca 

i trc tràng  i Vit Nam.
 c thc hin ti phòng Proteomics và Sinh hc cu trúc thuc Phòng thí nghim
Trm Công ngh Enzym và i hc Khoa hc T i hc Quc
gia Hà Ni.
- 


Ty th có cht h di truyn t lp khác vi h di truyn ca nhân
t bào. ADN ty th là phân t si kép, dc 16569bp, gm hai chui khác
nhau v thành phn nucleotide: chui nng có cha nhiu guanine, chui nh cha nhiu
cytosine. Chui nng mã hóa cho 28 gen, chui nh mã cho 9 gen trong tng s 37 gen ca h
gen ty th. Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chui polypeptide cn thit cho h thng
phosphoryl hóa oxy hóa. S gen còn li ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong s dch
mã ca ty th [10] ( 1). Các chui polypeptide còn li cn thit cho cu trúc và ch
ca ty th c ghi mã bc tng hp trong ribosome ca t bào cht.
Các nghiên cu trên ADN ty th cho thy h gen ty th có nh
bit vi h gen nhân. H gen ty th c tính di truyn theo dòng m, có t n vài
nghìn bn copy trong mt t bào. Các t bào khác nhau có s ng bn copy khác nhau, tùy
thuc vào nhu cng trong mô [60]. H gen ty th không có vùng intron và các gen
không có, hoc có rt ít các bazo không mã hóa  gia chúng. Trong nhing hp không
xut hin các codon kt thúc mà ch có s polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy
nht trong h gen ty th không tham gia mã hóa. Vùng D-c 1,1 kb cha các
yu t quan trng cho quá trình phiên mã và d a promoter phiên mã ca chui
nng và chui nh, có vùng gn vi các yu t phiên mã ADN ty th-Loop xy ra

t bin s ng ti tính toàn vn ca các chuc mã hóa trong ty th [41].


Hình 1 cu to ADN ty th i [ 75].
m ca h gen ty th o v, li phân b
gn chuc t c to ra trong quá trình phosphoryl
  t bin ca ADN ty th  nhân (khong 10 ln)
[51]. Bi ADN ty th có nhiu bn sao nên phân t b t bin có th cùng tn ti vi dng di
(wild type) không b t bin, to nên hing nht (heteroplasmy). ADN ty th
có th  dng nht (homoplasmy) khi tt c các bn sao ca genome ty th 
Trong nhing ht bin dng heteroplasmy không gây ra nhng biu hin lâm sàng hay
c nhng biu hin hóa sinh cho tt tt bin [51]. Vì vc
m ng nht ct bin ADN ty th nh ty th.

Nhm ca h gen ty th c phát hin t u nh
1988 nht biu tiên có liên quan ti các bc tìm thy [68]. Bnh ty th là
thut ng  ch mt nhóm các bnh gây ra do i trong quá trình to ATP.
c sinh ra thu ti thiu ca mô thì bnh ty th s xut hin do s
ng ca các protein tham gia vào chui phosphoryl hóa oxy hóa. S ng các phân t ADN
 ng khác nhau. Bi vy, các mô b nh
ng nhiu nht ct bin ADN ty th là h thng th   
thn, gan, ty. Các bnh c mô t khá rõ da trên các biu hin lâm sàng, hình thái và hóa
sinh, tuy vy bnh khó nhn ra bi biu hin lâm sàng ca bnh rt bii và khu bnh
din ra rt âm thc bia tr còn nh [57]. Tuy nhiên, hin nay, do tin
b cc phân t, vinh bnh ty th u kh quan. Các
nghiên cu dch t hc trong nhy bnh ty th là mt trong nhng bnh
t bin gen ph bin  i, ng ti ít nht 1 i trong qun
[22] (hình 2).

Hình 2. Các bn ri lon ADN ty th [64]
t bin ADN ty th gây ra các bnh  c phát hin.
Các bnh này có th xut hin  bt k n nào trong cui, t a bé mn
ng thành  mi la tui. Ngoài ra, nhit bic di truyn theo dòng m, bi
vy mà nhng chi có th c dùng cho nhiu th h  [57].
Các nghiên cu cho tht bin ADN ty th n tình trn kinh và tim
mt bin ty th gây bnh bao gt bit bin mn có liên quan
ti các bnh  i, hu ht trong s n h thi biên.

Mi liên quan gia s mt cha ty th vi bc Otto Warburg
lu tiên phát hin ra t nh thit rng s  ca quá trình
ng phân hiu khí trong nhiu loi mô u là do s i chui hô hp trong nhng t bào này
[70]. Theo Warburg, mt s bii ca ty th t bin ca
ADN ty th, nhng bii trong s biu hin và hong ca các ti ca chui hô
hp.
Hong ca chui hô hp ca ty th có liên quan vi s to thành các loi oxy phn
ng (Ru kin các electron b tha quá mc (ví d 
khi nhu cc do s c ch phc h enzym chui hô hc to ra
rt nhiu. S a ROS, hoc stress oxy hóa có th t bin ADN ty th 
hi các thành phn lipid và protein ni bào. H gen ty th c bit d dàng chu tác dng ca
ROS do phân b gn chui hô hp, kh g sa cha sai hng b gii hn [51]t bin ADN
ty th có th gây ra s biu hing ca các ti thuc chui vn chuyn t
c mã hóa bi ADN ty th, dn làm gi hong ca chui vn chuyn t,
gim kh  oryl hóa oxy hóa. Khi chui vn chuyn t b suy gim v chc
 n quá trình to thành ATP và ROS, làm bin ði s biu hin ca mt s
u hòa protein và quá trình tng hp nucleotide ca t bào.
y bii ca h gen ty th n b[27]. Mt s t bin ADN ty
th nh trong nhiu loi trc tràng, bung
trng, rut, gan, ty, tuyn tin lit, pht bin ADN ty th có th xut hin  vùng ghi mã
và vùng không ghi mã [19] (hình 3). n nay nhiu dng bii ADN ty th c xác

i này bao gt bim, thêm hoc mt base, ln, mt
i s ng bn sao ADN ty th.


Hình 3. Genome ty th vt bin trong các b[19]
Đột biến điểm
 t bin ADN ty th  b       i trình t
genome ty th trên 19 cng ca cùng by có
74% bt bit bin thuc vùng D-loop, phn còn
lnh trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong s t
bit bin thêm hoc mt base chim 42% thuc vùng D-Loop, còn lt bin
m thuc vùng ghi mã và không ghi mã [55].
t bin ADN ty th c tìm thy  bi tr
tht bin ADN ty th trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII
[53].
Vi bng trnh t bin ADN ty th,
  n ln là d ng nht (homoplasmy) và hu h  t bi   c
t bin này là D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA và cytochrome b, chng t
các vùng này là nhng vùng nóng có kh  t bin cao trong bng trng
[45].
Phân tích  b t bin soma 
vùng D-Loop, trong s t bin thêm hoc mt base ti v trí nucleotide 303-
309 (v trí D310) [72].
Mất đoạn
ADN ty th b mt mn lnh  
[14], i trc tràng [21]. Trong mt nghiên ct bin
mn nh (50bp) trong vùng D-Loop  4/32 (12,5%) bnh nhân  dày [17].
Thêm đoạn
t bin nh -
Loop ca ADN ty th a 1 b dày [72]. t bin này

i có 2 hon lp li k tip nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Bii v s bn sao ADN ty th c phát hin  nhiu loi b bn
sao ADN ty th  n giáp [47], i [15]i trc tràng [44].
Bing gim s bn sao ADN ty th nh thy  b[63],
u mô t bào gan [42],  ng trng [69]y bii v ng
ADN ty th có liên quan vi lo
i ta cho rng s ng bn sao ADN ty th trong b ph thuc v
trí ct bin trong b t bin trong vùng D-u khin s
nhân bn ADN ty th s làm gim s bn copy. Mt bin ADN ty th  các gen mã hóa
cho các protein ca chui phosphoryl hóa oxy hóa li có th  bt
 ng li s mt cha ty th [38].


i trc tràng hay còn gt kt (colon cancer) bao gi
i tràng là phn rut ln hình ch N bao gn rut kt lên
n xung (descending colon). Trc tràng
(rectum) là phn rut th  cha phân, ni gi i tràng và hu môn (hình 4).  
ng xy ra  n ni gii tràng và trng hai lo vi
nhau và khó có th y y ra sau vì th c
gi trc tràng [79].

Hình 4. Hình i trc tràng [76].
i trc tràng là mt trong nhng lo bin nht trên th gii hin
nay, chim t l cao th ng hc ch
th gii có khong 1 triu ca mc mi và trên na triu ca t vong. T l mc bnh không ging
c tính t l bnh nhân  c phát trin (M, Nht) cao gp 410 l
phát trin. Trên thc t, s ng bnh nhân  c 
s già hóa dân s i si trng 


phát
hin  n sau 4550 tui,  tu (khong ½ s i), tuy nhiên bnh có xu
ng tr hóa do ch  ng, sinh hot, s dng nhiu bia, thuc lá [78].

t bin gen tARN ca ADN ty th
t bim tARN ty th là t bin chim phn lt bin ty th gây ra
bnh ty tht bic phát hiu tiên là A8344G trên tRNA
Lys
và A3243G trên
tARN
Leu(UUR)
là ph bic nghiên cu nhiu nht bin rt
nhiu biu hing gây ra hi chng MELAS [31].  b gây
ra bi nht bin khác trên tARN
Leu(UUR)
t bin chng MERRF,
 nh v n kinh. Bnh này còn có th b gây ra bi m  t bin khác trên
tRNA
Lys
[56]. Ngoài ra, có th k t bin A7445G trên tARN
Ser(UCN)
n bnh
mt thính giác [54]t bin A4269G trên tRNA
Ile
gây bnh lic lit m
tin trin mãn (CPEO) [59] (hình 6).

Hình 5. Mt s t bim trên tARN ty th i [59].

 3243G trên gen MT -TL1 

Leu (UUR)




 






 nh MELAS [31].  3243






 














 c xác




 0,95- 18,4/100000  c Âu [22].  3243G












 3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNA
Leu
(UUR)
ca ADN ty th.  ng
ti quá trình tng h












 c h c

 [28].
1.3.2 
V trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong h genom ty th 


 này làm bii Threonine (alen A) thành Alanine (alen G)  u C c
ND3 ca phc h I ca chui hô hnh thoái hóa thn kinh
tunh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bng [48]. Ngoài ra trong
mt nghiên cu ca các nhà khoa hc Trung Qu

 10398AG
 [34].
A10398G là mt trong nhc s quan tâm ca nhiu nhà khoa hc bi
nó có liên quan vi vic to thành nhng khi u. Canter và cs (2005) lu tiên phát hin mi
liên quan gii bi ph n M g
không thy mi liên h nào  i M da trng. Các tác gi cho rng s a các yu
t ng có th gây ra s khác nhau gia các ti [18]. Tuy vy, trong mt s
nghiên cng là ph n M gc Phi không thy vai trò ci
vi s phát trin c[55]. Trong nghiên cu này, các tác gi i thích s khác
nhau v kt qu ca các nghiên cu này là do s khác nhau cu kin trong các khu vc
a lý khác nhau. Bai và cs (2007) khi nghiên ci ph n M gc Âu mc bnh

i chng thy rng 10398G có liên quan v 
vú [12]. Mt nghiên cc ln 10398G có liên quan vi s phát trin ung
i Ba Lan [25]. Khi nghiên ci M gc Phi
mn lit tuyi ta thy rng 10398G làm  l và m ác tính ca
bnh. Trong mt nghiên c   c tìm thy  b   n giáp [74].
Nghiên cu cnh v t
bin  bi [23]. Theo trình t ADN ty th sa li ca Cambridge, base kiu di là
A, tuy vy  nhiu qun th G li là kiu di [11]. Kt qu ca các nghiên cu v  
A10398G còn nhit lun bnh lý.
hit bin gen ty th giúp chnh
t bin ADN ty th phn ln  dng nhm
lâm sàng ca bnh ch biu hin khi t l ng nhn mt m nhnh tùy
thuc vào loi mô, t bào. Bi v ch c bnh chính xác và kp th i ta
ng s dng các k thut phân tích trc tip ADN ty th.
Phương pháp PCR-RFLP
c s dng ph bin nh t bim ca ADN
ty th là PCR- kt hp k thut PCR vi k thut   dài các
n ct gii hn ADN ty th có cht bic nhân lên bng PCR
vi cp mc hiu. Sn phc ct bi enzym gii hn thích hp. Cui cùng,
t bin s c nhn bit qua ph -RFLP giúp phát hit
bin thun li trang thit b t tin.
Phương pháp giải trình tự
 kht bii ta phnh trình t n ADN
t bin. Nguyên tc ca hu h   i trình t hi u da trên
  c Sanger và cng s công b   c g   
dideoxyribonuleotide (gi t.
Phương pháp Realtime PCR
Realtime PCR s dng phân t phát hu ghi lng ADN
c nhân lên trong phn ng PCR t l thun vi s  u hu  nh
nh s bn sao ADN ty th u có trong mu v 

nhy cao.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)
 dng ct sc ký k  sc ký l phân
tách ADN d si kép (heteroduplex) v ng si kép (homoduplex) ti nhi ti u. Các mch
c phân tách  nhi cao, sau khi h nhi xung, chúng liên kt vi nhau và hình
thành ADN d si kép cha các c d si kép này có thi
gian di chuyn khác bit so vi sng [43]. Nhiu nghiên c d
 sàng lc toàn b genome ty th, hoc mt vùng nhnh ca ADN ty th  xác
t bin ng m ng nht ca ty thnh mi quan
h gia din tích cnh sc ký có d si kép và m ng nht ca ty th
t bin ADN ty th thp ti 1% [43].

n nay các nghiên cu v t bin ADN ty th  i Vit Nam vu,
s liu còn hn ch  thng.
u gii mã genome ty th các ti Vit Nam
y mt s bii ca ADN ty th  i Vit Nam thuc vùng D-loop, các gen ND1,
ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8.
Ngoài ra, trong nghiên ct bin A3243G  bnh nhân mc bnh MELAS
(2/34 bt bin) [2].
   d  PCR-RFLP kt hp gii trình t
nh tht bin A3243G có mt  bnh nhân và m bnh nhân trong mt gia
i mc hi chng MELAS [4].
Ph di trình t trc tip ADN ty th
tách chit t máu bnh nhân mang bnh tht bin ADN ty
th, 7 trong s t bit bin nng gp nht, 2 ca còn
lt bin T14484C [8].
Nhóm nghiên cu ca Nguyn H    d   i trình t tách
nh thy nhit bin (ti 14 v trí) trên vùng D-Loop  mng
ng xuyên tip xúc vi bc x ion hóa [5].
t bin ADN ty th  bi Vit Nam, kt

qu c còn rn nay, chúng tôi ch tìm thy 1 nghiên cng bnh
[1]. Nghiên cc thc hin vi s mu hn ch (2 bnh nhân). Kt qu phân
t bit bin mn 280 bp trong vùng D-loop ca bnh nhân
i Vit Nam.
ng quan  trên, các nghiên cu tra trên th git
bin ADN ty th liên quan cht ch vi nhiu loi bnh, nht là bnh ty th và bi
vi bi tr c hiu qu u tr tt thì bnh nhân cc chn
m, càng tt. Trong khuôn kh lun hành nghiên cu nhng
bii ca các gen tARN và ND3 ca ADN ty th  bi trc tràng vi mc
i liên quan gia nhng bii này vm lâm sàng ca bnh, t 
giúp cho vic vic chu tr ca bi trc
t



Mu nghiên cu là mu mô ca bi trc ly ti v trí khi u
và v trí lân cn khi u (cách khi u khong 5-10 cm). Mu mô s dng trong nghiên cu này gm
61 mu do Khoa T bào  Gii phu bnh, bnh vin K Tam Hip  Hà Ni và Khoa Gii phu bnh, bnh
vin Vic  Hà Ni cung cp trong thi gian t tháng 8 nu s dng
c thng kê  bng 3. Mng trong ng eppendorf, vn chuyn t bnh vin v 
lng và bo qun trong t lnh sâu âm 80C cho ti khi tin hành nhng nghiên cu tip theo.

 4.
Bng 1. 

 d


Hóa cht
Hãng cung cp

M
QIA amp DNA minikit
c)
Tách ADN tng s
QIAquick Gel Extraction Kit
c)
Tinh sch ADN
Agarose
Invitrogen (M)
n di
SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide
Pharmacia (Thy
n)
Các cp mi 10398, 3243
IDT (M)
PCR
Master Mix 2X
NEB (M)
Enzyme Fastdigest® HaeIII
Enzyme Fastdigest®DdeI
Fermentas c)
RFLP

Các hóa ch base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat,
bc s d sch phân tích.

 tit bin A3243G và A10398G, chúng tôi thc hi
PCR-c ht ADN tng s c tách chit t mô u và mô lân cn u. Tin
ADN cht bic nhân lên bng PCR vi cp mc hiu. S có mt cn gen cha
t bi c kim tra bc tip theo chúng tôi thc hin ct

n gen này bng enzym gii hn thích h nhn bit bin qua ph 
khnh kt qun gen cht bic tinh sc gi trình t.
- KT QU VÀ THO LUN
3.1.              
-RFLP
3.1.1. 
S dng kit tách chit ADN QIAamp DNA Mini Kit cc), chúng tôi
c ADN t 61 cp mu mô (mu u và mu lân cn u) ca 61 b
i trc tràng. 











 c minh ha trong hình 7.

Hình 6.  ng s tách chit t mô
(

 1%, nhum ethidium bromide).
Ging 1, 3, 5: ADN tng s mu mô lân cn u
Ging 2, 4, 6: ADN tng s mu mô u

Qua hình n di trên ta thy  tng s i sáng, gn chng t

ng ADN trong mu khá cao và s u ki tin hành các thí nghim tip theo.

S dng cp mc hiu 3243 vi khuôn là ADN tng s t n gen cha v trí
3243 ADN ty th c khui bng phn ng PCR. Sn phm PCn di kim tra
trên gel agarose 1,7%, nhui tia cc tím. Kt qu c
th hihình 8.

Hình 7. n di sn phn gen 3243
(

 1,7%, nhum ethidium bromide).
Ging M100: thang chun ADN 100bp
Ging (-i chng âm
Ging 1, 3, 5: Sn phm PCR mu mô lân cn u

Ging 2, 4, 6: Sn phm PCR mu mô u

Kt qu n di cho thc sn phc 218bp, 
rõ nét và không xut hi chng t không có hing bt cc hiu. Sn
phc tip tc phân tích bng k thu t bin.
3.1.3. Kt qu n gen cha v trí 3243 ADN ty th
 t bim A3243G, chúng tôi s dhúng tôi 
tin hành x lý sn phm PCR n gen 3243 vi enzyme gii hn HaeIII. HaeIII là enzyme
endonuclease nhn bit ADN ti trình t:














 218 bp có cha hai v trí nhn bit ca
enzyme, 















 22 bp, 27 

 169 bp. 







  





 218 

 t v trí nhn bit na ca enzyme
gii hn, kt qu n gen s  22 bp, 27 bp, 72 


97 bp. Sn phm ca quá trình x lý vi enzyme cn di kim tra cùng vi sn phm
PCR trên polyacrylamide 6%, nhum ethidium bromide và qc sóng 245
nm (hình 9).

Hình 8.  3243 

 HaeIII.
(

 polyacrylamide 6%, nhum ethidium bromide).
Ging 1: Thang chun ADN 100bp
Ging 3, 5: sn phm PCR t mô u
Ging 7: sn phm PCR t mô lân cn u

Ging 2, 4: sn phm sau ct bng HaeIII t

mu mô u
Ging 6: sn phm sau ct bng HaeIII t
mu mô lân cn u

T kt qu  c trong hình chúng tôi nhn thy sn phm PCR sau khi ct bng
HaeIII trên bn di xut hi c 169 bp. 



 22 bp, 27 bp
y  các ging này không xut hit
bin hành ct enzym vi 61 cp mu, kt qu c không có t bin.
 3243G trên gen MT -TL1 
Leu (UUR)




 






 nh MELAS [31]. n nay các nghiên cu v
t bin A3243G ch tp trung vào mt s bn kinh, ting. Ch có mt nghiên cu
duy nht phát hit bin A3243G trên b
khi nghiên ct bin ADN ty th gt bin tRNA, rRNA và mt s gen ty th trên
mt s mn mt mu ut bin A3243G dng

nht (homoplasmic) [46]y có th thy rt bin A3243G là khá him gp  bnh

3.2. 
-RFLP

S dng cp mc hiu 10398 vi khuôn là ADN tng s t 
c khui bng phn ng PCR. Sn phn di kim tra
trên gel agarose 1,7%, nhui tia cc tím. Kt qu c
th hihình 10.



Hình 9. n di sn phn gen 10398
(

 1,7%, nhum ethidium bromide).
Ging M100: thang chun ADN 100bp
Ging (-i chng âm
Ging 1, 3, 5: Sn phm PCR mu mô lân cn u
Ging 2, 4, 6: Sn phm PCR mu mô u

Kt qu n di cho thc sn phc 246bp, 
rõ nét và không xut hi chng t không có hing bt cc hiu. Sn
phc tip t t bin.
3.2.2. Kt qu 
Chúng tôi  tin hành x lý sn phm PCR n gen 10398 vi enzyme gii hn DdeI.
DdeI là enzyme endonuclease nhn bit ADN ti trình t:
5
3
ng hp alen A xut hin  v trí 10398, enzyme DdeI có mt v trí nhn bin

c khui, kt qu s cc 50 

196 bp. Trng hp alen
G xut hin, s có thêm mt v trí nhn bit ca DdeI, kt qu s c
lt là 38 bp, 50 

 158 bp. Các sn phm sau cn di cùng vi sn phm PCR
trên gel polyacrylamide 6%, nhum Ethidium bromide c sóng 245
nm (hình 11).

Hình 10.  10398 


(

 polyacrylamide 6%, nhum ethidium bromide).
T kt qu c trong hình chúng tôi nhn thy sn phm PCR sau khi ct bng DdeI
trên bn di  ging s 6 xut hiy  gi

 10398A.
Mt khác  các ging s 2, 4 sn phm PCR sau khi ct xut hi58bp, 50bp, 38bp.
ng mu mang alen G  v n hành ct enzym vi 61 cp mu
 28 cp mu mang alen A  v trí 10398 và 33 cp mu mang
alen G  v trí này.

S dng k thu t bin A10398G  mt s cp
m khnh kt qun hành tinh sch sn phm PCR. Sn phm PCR sau
Ging 1: Thang chun ADN 100bp.
Ging 3, 5: sn phm PCR t mu mang alen
G  v trí 10398.

Ging 7: sn phm PCR t mu mang alen A 
v trí 10398.
Ging 2, 4: sn phm sau ct bng DdeI t
mu mang alen G  v trí 10398.
Ging 6: sn phm sau ct bng DdeI t mu
mang alen A  v trí 10398.
tinh sc ly ra kim tra s hin din cng ADN tinh sch
c nm trong khong 200- s  i
trình t. S dng phn m























so sánh trình t 

 i trình t ADN chun ca ty th c
công b trên ngân hàng gen NCBI (NC_012920),  t bin trên
h gen ty th.
Vi trình t 4 mu (gm hai mu kt bin
và hai mt bin) (xem ph lc 2). Kt qu gii trình t mt bic biu
din trên hình 12.
So sánh trình t 

i trình t ADN chun ca ty th c công b trên ngân hàng gen
NCBI,  c kt qu 

Kt qa gii trình t mt bic biu din  hình 14.
So sánh trình t 

 i trình t ADN chun ca ty th c công b trên ngân
hàng gen NCBI,  c kt qu 

Hình 11. Kt qu so sánh trình t mt bin vi trình t ADN chun ca ty th
Kt qu t hình 15 cho thy alen G xut hin  v trí 10398 ti mt bin (alen
u này cho thy có xut hit bit qu 




i kt qu y bng k thut gii trình tc
t bin trên h gen ty th ti v trí 10398.













 2  10370

10400T. Da
vào các d lic công b trên Mitomap (ngân hàng d liu genome ty th) thy rng hai
dng bin th này không liên quan tt bin gây bnh, mà ch 
bi M [62], còn bin th T10370C thuc dng bin
th ng, không gây bnh [50].
3.2.4. 







 10398
















 phân tích PCRRFLP ca 122 mu ADN tng s ca 61 bi
tr mu 



 61 mu 






u) 

cho thy có xut hit bin ADN ty th   10398. Tin hành phân tích mi liên
quan gia t bim A10398G ca ADN ty th ca 61 bi trc tràng 



 c kt qu 

 12.
Bng 2. Phân b  A10398G  ADN ty th ca bi trc tràng
theo m bnh hc lâm sàng
m
S ng
Phân b A10398G
A
G
Gii tính
Nam
30
50,0
(15)
50,0
(15)
N
31
41,9
(13)
58,1
(18)
Tui
 50
46
47,8
(22)
52,2
(24)

< 50
15
40
(6)
60
(9)
V 
i tràng
30
56,7
(17)
43,3
(13)
Trc tràng
29
37,9
(11)
62,1
(18)
Gii và
trc tràng
2
0
100
(0)
(2)
Hch
0
3
66,7

(2)
33,3
(1)
13
15
60
(9)
40
(6)
>3
27
37
(10)
63
(17)
c u
<5cm
28
35,7
(10)
64,3
(18)
 5cm
22
59
(13)
41
(9)
Phân loi TNM
n I

T
1-2
N
0
M
0
16
37,5
(6)
62,5
(10)
n II
T
3-4
N
0
M
0
20
60
(12)
40
(8)
n III
N
1-2
M
0
T bt k
21

42,9
(9)
57,1
(12)
n IV
M
1
T, N bt k
3
0
(0)
100
(3)
M bit hóa
Cao
5
60
(3)
40
(2)
Va
20
52,4
(11)
47,6
(9)
Kém
2
0
(0)

100
(2)























 :
c ADN 

 t 61 cp mu mô ca b


 (bao gm
mô u và mô lân cn  mi bnh nhân).  sch cn thic các
yêu cu thí nghim.
2. S dng các cp mc hi



 a v t bin
c 246 bp) ca ADN ty th t mu mô ca bnh
i trc tràng.
3. 









 10398G là 54 % mô u, 54 % 

 .
54%.
4.  

 10398G 






 
mô, 

, 



 c u, s hn tin trin bnh, m bit hóa
(p>0,05).
5. 



 3243









 i tr





 .

References
Tài liu ting Vit
1.      u nghiên c   ú bnh nhân Vit Nam bng
  c phân t s dng ch th di truyn h gen ty th vùng D- Loop",
Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu cơ bản trong sinh học,
nông nghiệp, y học, pp. 825-830.
2.  n cu gii mã genome ty th các ti Vit Nam và
ng ng d tài cc (mã s: KC-04-25).
3. Nguyn (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xut bn giáo dc Vit Nam.
4. n (2009), "Tìm hiu bnh ty th  i bc phân
t : QT-08-31).
5. Nguyn Hng Trn Trung và Tt bin h gen ty
th vùng D-Loop  ng xuyên tip xúc vi bc x ion hóa", Tạp chí Y
học Việt Nam, 351, pp. 29-34.
6. Phan TuGiáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xut bn giáo dc
Vit Nam.
7.  (2008), Bệnh học các khối u, Nhà xut bn y hc Hà
Ni.
8. Phm Hùng Vân, Hoàng Hiu Ngc và Võ Quang Hng hp
u tiên v bnh lý thn kinh nhãn cnh bng k thut gii trình t DNA
ty th tách chit t bch cu ca b phát hit bin gây bnh", Kỷ yếu
hội nghị Sinh học phân tử và hóa sinh y học, pp. 285-289.
Tài liu ting Anh
9. Alonso A., Martin P., and Albarran C. et al (1997), "Detection of somatic mutations in
the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex
and single-strand conformation analysis", Electrophoresis, 18, pp. 682-685.
10. Anderson S., Bankier A. T., and Barrell B. G. (1981), "Sequence and organization of the
human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp. 457-465.

11. Andrew R. M., Kubacka I., and Chinnery P. F. (1999), "Reanalysis and revision of the
Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA", Nature Genetics,
23(147).
12. Bai R. K., Leal S. M., and Covarrubias D. (2007), "Mitochondrial genetic background
modifies breast cancer risk", Cancer Research, 67, pp. 4687-4694.
13. Bassam B. J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P. M. (1991), "Fast and sensitive silver
staining of DNA in polyacrylamide gels", Analytical Biochemistry, 196, pp. 80-83.
14. Bianchi M. S., Bianchi N. O., and Bailliet G. (1995), "Mitochondrial DNA mutations
in normal and tumor tissues from breast cancer patients", Cytogenetics and Cell Genetics
, 71(1), pp. 99-103.
15. Bonner M. R. et al (2009), "Mitochondrial DNA Content and Lung Cancer Risk", Lung
Cancer, 63(3), pp. 331-334.
16. Booker L. M. et al (2006), "North American white mitochondrial haplogroups in prostate
and renal cancer", Journal of Urology, 175(2), pp. 468-472.
17. Burgart L. J. et al (1995), "Somatic mitochondrial mutation in gastric cancer", The
American Journal of Pathology, 147, pp. 1105-1111.
18. Canter J. A. et al (2005), "Mitochondrial DNA G10398A polymorphism and invasive
breast cancer in African-American women", Cancer Research, 65(17), pp. 8028-8033.
19. Chatterjee A., Mambo E., and Sidransky D. (2006), "Mitochondrial DNA mutations in
human cancer", Oncogene, 25, pp. 4663-4674.