Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa protein ESAT6 CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HÀ THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ
VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HÀ THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ
VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:

60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THÁI SƠN

PGS.TS. NGÔ TỰ THÀNH

Hà Nội – Năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơnngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS Ngô Tự Thành đã giúp đỡ và thông qua cho tôi luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc
biệt là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật học, trƣờng Đại học Khoa học Tự
Nhiên-Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi những
kiến thức bổ ích trong suốt quá trình tôi học tập tại trƣờng.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể phòng Sinh học phân tử-Khoa
Miễn dịch và sinh học phân tử- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin đƣợc cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và tạo
mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa học này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 4 năm 2014
Học viên

Hà Thị Hiên

i


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 8
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................... Error! Bookmark not defined.

1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO ................ Error! Bookmark not defined.
1.4. VI KHUẨN LAO ..................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.1. Đặc điểm phân loại................................ Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Đặc điểm hình thái ................................ Error! Bookmark not defined.
1.4.3. Cấu trúc thành tế bào............................. Error! Bookmark not defined.
1.4.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................. Error! Bookmark not defined.
1.4.4.1. Môi trƣờng và dạng khuẩn lạc ........... Error! Bookmark not defined.
1.4.4.2. Chu kì tế bào ...................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.5. Khả năng gây bệnh ................................ Error! Bookmark not defined.
1.4.6. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao ............... Error! Bookmark not defined.
1.4.6.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosisError! Bookmark not
defined.
1.4.6.2. Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1.Error! Bookmark
not defined.
1.5. PROTEIN ESAT6/CFP10........................ Error! Bookmark not defined.
1.5.1. Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10. .................. Error!
Bookmark not defined.
1.5.2. Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng.Error!
Bookmark not defined.
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... Error!
Bookmark not defined.
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................. Error! Bookmark not defined.
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ............................ Error! Bookmark not defined.

ii


2.4. PHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨUError!

Bookmark

not defined.
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử ............... Error! Bookmark not defined.
2.4.2.1. Tách chiết ADN ................................. Error! Bookmark not defined.
2.4.2.2. PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 ................. Error!
Bookmark not defined.
2.4.2.3. Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10.Error! Bookmark not
defined.
2.4.2.4. Giải trình tự ADN .............................. Error! Bookmark not defined.
2.4.2.5. Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein
CFP10/ESAT6 ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2.6. Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein
CFP10/ESAT6 ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2.7. Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia
coli chủng BL21(DE3) ............................ Error! Bookmark not defined.
2.4.2.8. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 ...... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......... Error! Bookmark not defined.
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG
NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 ..... Error!
Bookmark not defined.
3.1.1.1. Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của
M.tuberculosis ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.1.2. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 .. Error!
Bookmark not defined.
3.1.2. Kết quả tách dòng.................................. Error! Bookmark not defined.

iii

3.1.2.1. Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của
M.tuberculosis ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2.2. Kết quả tách dòng............................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10
................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1.2.3.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+....... Error!
Bookmark not defined.
3.1.2.3.2. Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+ .................. Error!
Bookmark not defined.
3.1.2.3.3. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCRcolonies .................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10
................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng
BL21(DE3) .............................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6Error!

Bookmark

not

defined.
3.2.3. Tối ƣu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6 ....... Error!
Bookmark not defined.
3.2.3.1. Kết quả tối ƣu nhiệt độ cảm ứng ........ Error! Bookmark not defined.
3.2.3.2. Kết quả tối ƣu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên
gen CFP10/ESAT6 .................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 ......... Error! Bookmark not defined.
3.2.5. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm ..... Error! Bookmark not defined.
3.2.6. Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu ........ Error!

Bookmark not defined.
3.2.7. Xác định hoạt tính kháng nguyên ......... Error! Bookmark not defined.

iv


KẾT LUẬN ..................................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 9

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính ........ Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính ............... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Mức độ tƣơng đồng của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 từ các
chủng vi khuẩn lao Việt Nam so sánh với chủng chuẩn H37Rv. ............ Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.2. Mức độ biểu hiện CFP10/ESAT6 tại các điều kiện khác nhau.
......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3. Nồng độ độc tố trong sản phẩm. .... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4. Đáp ứng với các nồng độ kháng nguyên khác nhau ................ Error!
Bookmark not defined.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn lao M. tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57]. .. Error!

Bookmark not defined.
Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57].
......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72].Error! Bookmark not
defined.
Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trƣờng Lowenstein - Jensen
......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.5. Vùng gen RD [31]. ......................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.6 . Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49]. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.1. Kết quả khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 ......... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gene mã hóa protein CFP10 và ESAT6 ...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.3. Khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid.Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.4. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại trên các plasmid tái tổ hợp, sử
dụng cặp mồi P1, P4........................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5. Kết quả mở vòng pET21a+ và pGEMT/ESAT6/CFP10. ........ Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.6. Trình tự khung đọc mở mã hóa protein CFP10/ESAT6. ......... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10-ESAT6. ... Error!
Bookmark not defined.

vii


Hình 3.8. Kết quả kiểm tra protein đích trên gel SDS.Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.9. Kết quả cảm ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau.Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp.Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.11: Westerm blot trên ........................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12: Westerm blot .................................. Error! Bookmark not defined.

viii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BCG
Bp

Bacillus Calmette-Guérin
`

Base pair
(Cặp bazo)

CFP10

Culture Filtetrate Protein 10

CTCLQG

Chƣơng trình chống lao Quốc gia

DNA

Deoxyribonucleotide acid

ESAT6

Early Secretory Antigenic Target 6

INF γ

Interferon gamma

IS

Insert sequence
(Trình tự chèn)

MDR

Multi drug resistant
(Chủng lao đa kháng thuốc)

ORF

Open reading frame
(Khung đọc mở)

PCR

Polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi polymerase)

RD1

Region deletion 1

RFLP

Restriction fragment length polymorphisms
(Đa hình độ dài đoạn cắt bởi enzym giới hạn)

RNA

Ribonucleotide acid

TST

Tuberculin Skin Test
(Phản ứng quá mẫn muộn với tuberculin)

WHO

World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế Giới)

XDR

Extensively drug resistant
(Chủng lao kháng thuốc tuyệt đối)

ix


MỞ ĐẦU
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3
dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu ngƣời mắc lao mới và có khoảng 3
triệu ngƣời chết vì lao [6]. Tuy nhiên, theo ƣớc tính tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%.
Nhƣ vậy số bệnh nhân mắc lao nhƣng không đƣợc phát hiện và chữa trị kịp thời chiếm
đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát.
Việt Nam là 1 trong 22 nƣớc có tỉ lệ nhiễm lao cao trên thế giới. Tính riêng khu vực
Tây Thái Bình Dƣơng, Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine [6, 70 ].
Điều này đồng nghĩa với việc Việt Nam đang phải đối mặt với nguy cơ lây nhiễm lao
trong cộng đồng mà một trong những nguyên nhân chính là do lây nhiễm lao trƣớc chẩn
đoán. Số ngƣời mắc mới bệnh lao ngày càng tăng, số ngƣời không đƣợc phát hiện, điều
trị càng nhiều sẽ là nguồn lây nhiễm đến cộng đồng. Mặt khác, trong số những ngƣời mắc
đƣợc phát hiện, điều trị thì có đến 20% bệnh nhân không khỏi do kháng thuốc làm tăng
nguy cơ lây lan nhanh bệnh lao [6].
Trƣớc diễn biến nghiêm trọng đó, WHO đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới quan
tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh lao. Bệnh lao ngày càng trở nên nguy
hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy việc phát hiện và
điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn

đoán nhanh và chính xác. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn.
Trong nhiều thập kỉ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) vẫn đƣợc sử dụng để
chẩn đoán nhiễm lao. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra TST có độ đặc hiệu
thấp đặc biệt trên các đối tƣợng có chủng ngừa BCG. Một phƣơng pháp mới dựa trên đáp
ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon gamma đƣợc tiết ra bởi tế bào T
khi đƣợc kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn lao đã đƣợc chứng minh có
độ đặc hiệu cao hơn TST. Hai kháng nguyên 10 Kdal Culture Filtetrate Proteinn (CFP10)
và 6 Kdal Early Secretory Antigenic Target (ESAT6) đƣợc mã hóa bởi gen Ihp nằm trên
vùng đặc hiệu RD1 của vi khuẩn lao. Vùng RD1 có chiều dài 9,5 kb và có chứa 9 khung
đọc mở (ORFs) [36, 55]. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng

10


minh RD1 chỉ quan sát đƣợc trên các chủng Mycobacterium tuberculosis, không có mặt
trên các chủng BCG và các chủng Mycobacteria trong môi trƣờng [42,49]. Do vậy việc
nghiên cứu, ứng dụng gen mã hóa protein ESAT6 và CFP10 trong chẩn đoán lao và có
thể phát triển 1 vacxin có hiệu quả bảo vệ cao đƣợc coi là một hƣớng đi mới và đã đƣợc
nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới [29, 59, 65].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu quy trình biểu
hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ cho việc chế tạo bộ
sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao”. Đề tài này thuộc một phần nghiên cứu của nhiệm vụ
Nghị định thƣ Hoa Kỳ:‫ ״‬Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm
ELISPOT chẩn đoán nhiễm lao ở quy mô phòng thí nghiệm‫״‬.
Mục tiêu đề tài:
1. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10.
2. Biểu hiện và tinh sạch protein ESAT6/CFP10 trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo nguyên
liệu chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao,
Luận án Tiến sỹ Sinh học.
2. Đặng Đức Anh, Hồ Minh Lý, Trần Thị Thanh Hoa, Hoàng Thị Minh Tú, Nguyễn
Thị Nguyệt (2006), ″Giải trình tự và phân tích gen ESAT6 của Mycobacterium
tuberculosis phân lập từ bệnh nhân lao màng não″, Tạp chí Y học dự phòng tập
XVI, số 6(85), tr. 14-18.
3. Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y.
4. Bộ Y tế.( 2012), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia 2012.
5. Bô ̣ Y tế (2010), Chiế n lược phòng chố ng lao quố c gia giai đoạn 2011-2015.
6. Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương

11


trình chống lao quốc gia 2005.
7. Lê Huy Chính (2001), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, Tr. 207-214.
8. Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia
Hà Nội.
9. Chƣơng Trình Chống Lao Quốc Gia (2011), Báo cáo tổng kết Chương trình Chống lao
Quốc gia năm 2010 và phương hướng hoạt động năm 2011.
10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học,
NXB Giáo dục.
11. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
12. Phan Thị Thu Hƣơng, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát hiện
M. tuberculosis trong môi trƣờng bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”,

Hội

nghị khoa học toàn quốc về công nghệ sinh học, Tháng 12/2005.

13. Nguyễn Văn Hƣng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của
Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ
Y học.
14. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng,
NXB Giáo dục.
15. Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên
cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo về sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học Quốc
gia Hà Nội, Tháng 8/2007.
16. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị,
NXB Giáo dục.
17. Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007),
“Nghiên cứu tối ƣu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng trong
chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31.
18. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật.
19. Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao và Bệnh phổi sau đại
học, Học Viện Quân Y.

12


20. Nguyễn Văn Viê ̣t (2011), ″Mycobacterium tuberculosis‫״‬, Vi sinh y học , NXB Quân
đô ̣i nhân dân, Hà Nội, Tr. 228 - 235.
Tài liệu tiếng Anh
21. A.S.Mustafa., F. Oftung., H.A. Amoudy., N.M. Madi., A.T. Abal., F. Shaban., et
al. (2000), ″Multiple Epitopes from the Mycobacterium tuberculosis ESAT6
Antigen are recognized by antigen-Specific –Human T Cell Lines″, Clinical
Infectious Diseases, Vol. 30, S201-S205.
22. Ashtekar M.D. and Vidis S.S. (1993), ″T lymphocytes in pulmonary tuberculosis,″
Indian J.Med.Res, 97, pp. 14-17.
23. Barrett-Connor E. (1979), "The epidemiology of tuberculosis in physicians," JAMA,

241, pp.33-38.
24. Behr MA., Wilson MA., Gill WP., Salamon H., Schoolnik GK., Rane S., et al.
(1999), "Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA
microarray," Science 1999, 284(5419), 1520-1523.
25. Bluberg H. M., Watkins D. L., Berschling J.D. and Antle A. "Moore tuberculosis,"
Ann Internal Med, 122, pp.658-663.
26. Brosch R., G.S.V., Marmiesse M. and et al. (2002), "A new evolutionary scenario
for the Mycobacterium tuberculosis complex," Proc Nalt Acad Sci USA, 99,
3684-3689.
27. Capewell S., Leaker AR. and Leitch AG. (1988), "Pulmonary tuberculosis in health
service staff-is it still a problem," Tubercle, 69, pp. 113-118.
28. Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081,
in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15.
29. Cooper M.A., Dalton D. and Orme I.M. (1993), "Disseminated tuberculosis in
interferon gamma gene-disrupted mice," Jounal of Experimental Medicine 178,
pp.2243-2247.
30. Ellner J.J. and Wallis R.S. (1989), "Immunologic aspects of mycobacterial
infections," Review of Infectious Diseases II, pp.S455-S459.
31. F.X. Berthet., P.B. Rasmussen., I. Rosenkrands., P. Andersen. And B. Gicquel.

13


(1988), “A Mycobacterium tubersulosis operon encoding ESAT6 and a novel
lowmolecular-mass

culture

filtrate

protein

(CFP10),”

Microbiology,

1443195e3203.
32. G.G. Mahairas., P.J.Sabo., M.J. Hickey., D.C. Singh. And C.K. Stover. (1996),
″Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG
and virulent M.bovis″, J.Bacteriol, 178 1274e1282.
33. Gerston K.F. and et all. (2004), "Viability of Mycobacteria in the formalin- Fixed
Lungs," Hunman Pathology, 35, 571-575.
34. Gordon SV., Brosch R., Billault A., Garnier T., Eiglmeier K. and Cole ST. (1999),
"Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using
bacterial artificial chromosome arrays," Mol Microbiol 1999, 32(3), 643-655.
35. Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur
Respir, 1997, 10, p1120 – 1124.
36. Guinn KM., Hickey MJ., Mathur SK., Zakel KL., Grotzke JE., Lewinsohn DM.,
et al. (2004), ″Individual RD1-region genes are required for export of
ESAT6/CFP10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis,″ Mol
Microbiol, 51, 359-370.
37. Gurpreet S. Sandhu, Bruce C. Kline, Glenn D. Roberts, Marcia E. Lewis

(1998),

“IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis”, United
States Patent , 5731150
38. Herrera EA, Perez O, Segovia M. (1996), “Differentiation between Mycobacterium
tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex polymerase reaction”,
Journal of Applied Bacteriology, 80, 596-604.

39. Hill PC., Jackson-SillahD., Fox A. and et al. (2005), ″ESAT6/CFP10 fusion protein
and peptide for optional diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection by ex
vivo enzym-linked immunospot assay in Gambia,″ J Clin Microbiol, 43, 20702074.
40. Hsu T., Hingley-Wilson SM., Chen B., Chen M., Dai AZ., Morin PM., et al. (2003),
"The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of

14


secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue," Proc Natl
Acad Sci USA 2003, 100, 12420-12425.
41. Jaber M., A. Rattan, A. Verma, J. Tyag F, R. Kumar (1995), “A simple method of
DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis”, Tubercle and Lung
Disease, 76, 578-581
42. K.N. Lewis., R.Liao.,K.M. Guinn., M.J.Hickey., S. Smith. And M.A.Behr
D.R.S. (2003), ″Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics
bacille Calmettee- Guein attenuation,″ J. Infec. Dis., 187, 117e123.
43. Kremer L. and B.G. (2005), "A waxy tale - by Mycobacterium tuberculosis," In
Tuberculosis and the Tubercle bacillus. ASM Press, Washington DC, P.287305.
44. Kurabachew M., Sandaad R. A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in
the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”,
Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380.
45. Lazraq R, el Baghdadi J, Guesdon JL, Benslimane A. (1999), “Evaluation of IS6110
as amplification target for direct tuberculosis diagnosis”, Pathologie Biologie,
47(8):790-6
46. L. Brant., T. Oettinger., A.Holm., A.B. Anderson. And P. Andersen.(1996), ″Key
epitopes on the ESAT6 antigen recognize in mice during the recall of protective
immunity to Mycobacterium tuberculosis,″ J. Immunol., 157, 3527e3533.
47. Lewis KN., Liao R., Guinn KM., Hickey MJ., Smith S., Behr MA., et al. (2003),
"Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille CalmetteGuerin attenuation," J Infect Dis 2003, 187, 117-123.

48. Lin Sang., Guihua Xiong. And Hongxia Zhang. (2012),″ Immunogenicity and
protective efficacy against tuberculosis with DNA expressing ESAT6 protein,″
African Journal of Microbiology Research, 6, pp.431-435.
49. M. Harboe., T. Oettinger., H.G. Wiker., I. Rosenkrands. and P. Andesen. (1996),

15


″Evidence for occurrence of the ESAT6 protein in Mycobacterium tuberculosis
and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis
BCG,″ Infec. Immun., 64,16e22.
50. Marri P.R. and et al. (2006), "Comparative genomics of metabolic pathways in
Mycobacterium species: gene duplication, gene decay and lateral gene transfer,"
FEMS Microbiol Rev, 30, 906-925.
51. Murray P.J., Wang L., Onufryk C., Tepper RI.and Young R.A. (1997), ″T cellderive IL-10 antagonizes macrophage funtion in mycobacterial infection,″ Journal
of Immunology, 158, pp.668s-675s.
52. Musser. I.M., A. Amin. and and S. Ramaswamy. (2000), "Negligible genetic
diversity of Mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets:
evidence of limited selective pressure," Genetics, 155, 7-16.
53. Mustafa A.S., Abal A.T. and Chugh T.D. (1999), “Detection of Mycobacterium
tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex
polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 6170.
54. Musser J. M. (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular
genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, 8 (4), 496-514.
55. N. Ganguly. I. ., Siddipui. and P. Sharma. (2008), ″Role of M.
tuberculosis RD-1 region encoded secretory proteins in protective response and
virulence,″ Tuberculosis (Edinb) 88, 510e517.
56. N. van der Wel., D. Hava., D. Houben., D. Fluitsma., M. van Zon., J. Pierson., et al.
(2007), "M. tuberculosis and M. leprae translocate from the phagolysosome to
the cytosol in myeloid cells," Cell, 129, 1287e1298.

57. Palomino J. C. , Sylvia Cardoso Leóo, Viviana Ritacco (2007). Tuberculosis 2007:
From basic science to patient care, WWW.TuberculosisTextbook.com
58. P. S. Renshaw., P. Panagiotidou., A. Whelan., S.V.Gordon., R.G.
Hewinson., R.A. Williamson., et al. (2002), ″Conclusive evidence that the major
T-cell antigens of the Mycobacterium tuberculosis complex ESAT6 and CFP10

16


form a tight, 1:1 complex and characterization of the structural properties of
ESAT6, CFP10, and the ESAT6/CFP10 complex. Implications for pathogenesis
and virulence,″ J. Biol. Chem., 277,21598e21603.
59. Pollock JM. and Andersen P. ″Predominant recognition of the ESAT6
protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in cattle.,″
Infect Immun1997, 65, 2587-2592.
60. Schlossberg D. (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections.
Fifth edition”, Medical Publishing Division.
61. Sechi L. A. et al (1997), “Detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR
analysis of urine and other clinical samples from AIDS and non-HIV-infected
patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285.
62. S.T. Cole., R. Brosch., J. Parkhill., T. Garnier., C. Churcher., D. Harris., et al.
(1998), "Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the
complete genome sequence," Nature 393, 537e544.
63. Todar. and K. (2005), "tuberculosis," ,
Accessed 12 April 2008,
64. Van Pinxteren LA., Ravn P., Agger EM., Pollock J. and Andersen P.
(2000), ″Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT6
and CFP10,″ Clin Diagn Lab Immunol 2000, 7, 155-160.
65. Vordermeier HM., Chambers MA., Cockle PJ., Whelan AO. and
Simmons J. (2002), ″Hewinson RG., Correlation of ESAT-6 specific gamma

interferon production with pathlogy in cattle following Mycobacterium bovis
BCG vaccination against experimental bovine tuberculosis,″ Infect Immun, 70,
3026-3032.
66. Waters WR., Nonnecke BJ., Palmer MV., Robbe- Austermann S.,
Bannantine JP.,Stabel JR., et al. (2004), ″Use of recombinant ESAT6:CFP10
fusion protein for differentiation of infections of cattle by Mycobacterium bovis
and by M. avium subsp.avium and M. avium subsp. Paratuberculosis,″ Clin
Diagn lab Immunol 2004, 11, 729-735.

17


67. WHO. (2009), ″World health report. Global Tuberculosis control,″
68. WHO. (2012), ″World health report. Global Tuberculosis control,″
69. World Health Organization (2010). Multidrug and extensively drug-resistant TB
(M/XDR-TB):

2010

global

report

on

surveillance

and

response,

WHO/HTM/TB/2010.3.
70. World Health Organization (2011), Global Tuberculosis Control, WHO report 2011.
71.

Yinlan Bai, Ying Xue, Hui Gao et al (2007), ″Expression and purification of
Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and MPT64 fusion protein and its
immunoprophylactic potential in mouse model″ , Elsevier, 59, p.189-196.

72.

/>
73.

/>
74.



75.

/>
76. />77. sheet/ Fact sheet No104/2005
78. />
18