Kỹ thuật phân lập, định danh vi sinh vật

KỸ THUẬT PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
1. Nuôi cấy và phân lập vi sinh vật
Quá trình hư hỏng sữa đậu nành do nhiều loại VSV từ nhiều nguồn (không khí, gỗ,
nước, nguyên liệu… ) theo nhiều con đường khác nhau nhiễm vào. Để có thể định danh
chính xác loại VSV đó, cần phân lập được các loại VSV có trong mẫu. Từ đó có thể xác
định được nguồn nhiễm và truy tìm nguyên nhân gây nhiễm.
1.1. Định nghĩa
Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa về
dạng thuần khiết được tạo ra từ một tế bào ban đầu.
1.2. Mục đích
Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ có hình dạng đặc trưng từ quần thể VSV ban đầu.
1.3. Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào VSV
- Nuôi cấy các tế bào trên/ trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc
riêng rẽ, cách biệt nhau.
1.4. Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn
Để thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cần tiến hành các bước sau:
- Bước 1: Pha loãng mẫu nhiều lần rồi chọn độ pha loãng thích hợp.
- Bước 2: Cấy trên/trong môi trường dinh dưỡng.
1.4.1.

Pha loãng

Tùy thuộc vào mật độ vi sinh vật trong mỗi mẫu phân tích mà tiến hành pha loãng
thập phân liên tiếp cho đến khi chọn được độ pha loãng thích hợp để khi nuôi cấy cho
khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ quan sát, nhận diện.
Cách pha loãng: tiến hành như hình vẽ sau:


Mẫu sản phẩm cần phân tích

Mỗi ống nghiệm chứa 9ml môi trường pha loãng thích hợp
1.4.2.

Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn

Chọn độ pha loãng thích hợp rồi hút 0.1 ml mẫu, cấy theo một trong các phương
pháp sau tùy loại VSV:
a.

Đối với VSV hiếu khí và kị khí tùy tiện

a.1. Cấy ria
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.
- Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp như hình vẽ. Sau mỗi
đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp


theo.
Hình ảnh: Các phương pháp ria theo vết cấy cạn dần.
- Lật ngược đĩa, bao gói và đem đi ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
a.2. Cấy tràn
- Dùng pipet đã vô trùng hút 0.1ml mẫu ở độ pha loãng thích hợp lên bề mặt môi
trường trong đĩa petri.
- Dùng que gạt thủy tinh đã vô trùng nhúng vào cồn 70 o, hơ qua ngọn lửa rồi để
nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn.
- Mở đĩa, dùng đầu que gạt, trang đều mẫu trải trên bề mặt thạch.
- Đậy đĩa, khi đĩa khô thì lật ngược đĩa, bao gói và đem đi ủ ở nhiệt độ và thời gian
thích hợp trong tủ ấm.
a.3. Cấy trộn
- Dùng pipet đã vô trùng hút 1ml mẫu ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri vô

trùng.
- Đổ 12 -15ml môi trường vô trùng và được làm nguội đến nhiệt độ 45 – 50 oC vào
đĩa đã cấy mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri theo cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ nhiều lần để mẫu
phân tán đều vào môi trường.
- Đậy nắp, để thạch đông rồi lật ngược đĩa, bao gói, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp trong tủ ấm.
b.

Đối với VSV kị khí

Dùng phương pháp thạch 2 lớp trình bày trong chương 3, mục xác định vi khuẩn kị
khí khử sunfit.


Chú ý: Nhiệt độ và thời gian thích hợp là tùy vào từng loại VSV có trong trong mẫu.
Làm đồng thời nhiều mẫu và ủ ở các chế độ nhiệt khác nhau để khảo sát tính chịu nhiệt
của VSV.

1.5.

Định danh chủng nhiễm

Sau khi nuôi cấy, thu các đĩa có khuẩn lạc mọc riêng rẽ với hình dạng đặc trưng rồi
tiến hành các bước để định danh VSV theo lưu đồ sau:
Khuẩn lạc đơn
Quan sát, miêu tả khuẩn lạc
Quan sát hình thái tế bào
Nhuộm Gram
Thực hiện các test sinh hóa

Định danh
1.5.1.

Miêu tả khuẩn lạc

VSV phát triển trên các môi trường đặc trưng sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng
cho từng loài. Vì vậy, việc miêu tả các khuẩn lạc là việc quan trọng và cần thiết trong việc
định danh VSV. Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc điểm sau:
-

Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng rễ cây, dạng mép viền răng cưa, dạng sợi, dạng đồng
tâm…
Đặc tính quang học: trong, bán trong, không trong, lóng lánh, đục, huỳnh quang.


-

Màu sắc: ghi màu khuẩn lạc và có tiết sắc tố vào môi trường hay không.
Bề mặt: bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề, bề mặt ướt hay khô…
Mặt cắt ngang: phẳng, lồi, lõm giữa, ăn sâu vào thạch…
Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng, có thùy dạng rễ…
Độ đặc: dạng mỡ, dạng bột nhão, dạng nhớt, dạng màng

Hình ảnh: hình dạng, mép và mặt cắt ngang của khuẩn lạc.
Quan sát hình thái tế bào
a. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
Kính hiển vi quang học.
Lam kính và lá kính.
Xanh metylen 0.001% và các loại thuốc nhuộm khác.
Que cấy, cồn, đèn cồn, nước cất và các dụng cụ hỗ trợ khác.

b. Tiến hành
1.5.2.

-

Thường sử dụng tiêu bản giọt ép để quan sát hình thái tế bào vì thao tác nhanh, đơn
giản, có thể quan sát được trạng thái của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh
sản, sự hình thành bào tử…
Có 2 cách làm tiêu bản giọt ép:
-

Làm tiêu bản giọt ép có nhuộm màu
• Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0.001% lên lam kính
• Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi để nguội
trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn.
• Mở nắp trên của đĩa petri, dùng que cấy lấy một chút sinh khối VSV trên bề mặt
thạch và hòa đều vào giọt xanh metylen trên lam kính.
• Khử trùng lại que cấy trên ngọn lửa đèn cồn rồi cất vào giá.


Đặt lá kính lên vết bôi trên lam kính thật nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí.
Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính (x10), (x40) hoặc vật kính dầu
(x100). Đối với vật kính dầu, trước khi đưa lên kính hiển vi để quan sát, phải nhỏ 1
giọt dầu lên lá kính.
Làm tiêu bản giọt ép không nhuộm màu: tiến hành các bước tương tự như làm tiêu bản
có nhuộm màu, nhưng thay vì dùng thuốc nhuộm xanh metylen, sẽ dùng 1 giọt nước cất.
•
•

-

Dựa vào khả năng bắt màu của các VSV với thuốc nhuộm mà thường sử dụng cách
làm tiêu bản có nhuộm màu để quan sát tế bào được rõ ràng hơn. Để đảm bảo tế bào VSV
vẫn còn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu, yêu cầu phải sử dụng thuốc nhuộm không
hoặc ít độc đối với VSV và được pha loãng ở nồng độ thích hợp.
c. Một số hình thái tế bào thường gặp

c.1. Cầu khuẩn
Cầu khuẩn(coccus) là những vi khuẩn mà tế bào có dạng hình cầu, rất phổ biến
trong tự nhiên. Tùy theo kiểu phân chia tế bào mà chúng được chia thành một số nhóm
như sau:
- Đơn cầu khuẩn (Monococcus), kích thước rất nhỏ, có nhiều trong đất, nước không
khí.
- Song cầu khuẩn (Diplococcus), chủ yếu là những vi khuẩn gây bệnh.
- Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus), có ít trong tự nhiên.
- Bát cầu khuẩn (Sarcina) sống hoại sinh trong đất, một số sống ký sinh trong thực
vật gây hư hỏng rau quả.
- Liên cầu khuẩn (Streptococcus), có nhiều trong tự nhiên, đặt biệt trong rau quả,
thực phẩm.
- Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), dạng chum nho, có nhiều trong tự nhiên.

c.2. Trực khuẩn


Trực khuẩn là những vi khuẩn hình que, hai đầu tròn hoặc vuông, có thể phình to
một đầu hoặc hai đầu. Đa số trực khuẩn đứng riêng rẽ, nhưng có một số loại liên kết với
nhau gọi là Diplobacterium hoặc xếp thành chuỗi gọi là Streptobacterium hay
Streptobacillus.

Căn cứ vào khả năng tạo bào tử của trực khuẩn, có thể chia trực khuẩn thành 2

nhóm:
-

Trực khuẩn có bào tử như một số giống Clostridium và Bacillus. Khi quan sát bào tử của
mỗi loại VSV cần quan sát vị trí của bào tử là chính tâm hay lệch tâm, làm tế bào phình to
hay không… Dựa vào những đặc điểm khác nhau này mà phân biệt được các loại VSV.

-

Trực khuẩn không có bào tử: E.Coli, Lactobacillus…

c.3. Xoắn khuẩn


Xoắn khuẩn là những vi khuẩn mà tế bào có dạng hình lò xo hay một nửa vòng
xoắn, có khả năng di động bằng tiên mao hoặc cách uốn vặn vòng xoắn. Chúng được chia
thành 2 loại:
-

Phẩy khuẩn (Vibrio) là loại tế bào có nửa vòng xoắn.
Spirillium là loại có một vài vòng xoắn.

1.5.3. Nhuộm Gram
1.5.3.1. Mục đích

Giúp quá trình định danh vi khuẩn được dễ dàng hơn.
1.5.3.2. Nguyên tắc

Do sự khác nhau về cấu trúc tế bào, nên dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất
và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất

khác nhau:
-

-

Loại vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Đó
là vi khuẩn Gram dương.
Loại không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu
của thuốc nhuộm bổ sung. Đó là vi khuẩn Gram âm.
1.5.3.3. Tiến hành
Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ)
hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.


-

Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm
khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không
khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

1.5.4.

Test sinh hóa

Mỗi loài VSV có cấu tạo và các tính chất sinh hóa khác nhau. Dựa vào các phản ứng
sinh hóa này có thể định danh được các loại VSV. Dưới đây là các test sinh hóa quan
trọng thường sử dụng trong kiểm nghiệm VSV.
1.5.4.1. Test oxidase
a. Nguyên tắc

Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của Vi khuẩn.
Hệ thống cytochrom có ở vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy tiện. Hệ thống này hoạt động
như chất liên kết trong quá trình hô hấp, vận chuyển H+ → O2 tạo thành nước.
- Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p – phenylenediamine dihydrochloride.
b. Phương pháp tiến hành
- Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy 1 khuẩn lạc rồi miết trên giấy đã tẩm sẵn thuốc thử
và được nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý.
- Quan sát kết quả trong 10 giây đầu. Phản ứng dương tính cho kết quả màu xanh tím
-


1.5.4.2. Test catalase
a. Nguyên tắc
-

-

Phát hiện enzym catalase gây xúc tác phản ứng thủy phân : H2O2 → O2 + H2O
Enzym này có mặt ở vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí tùy tiện.
Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O 2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt
khí (dương tính +)
b. Phương pháp tiến hành
Dùng đũa thủy tinh hoặc que cấy lấy vi khuẩn hoặc chọn khuẩn lạc nghi ngờ lên trên mặt
1 lam kính sạch.

Nhỏ H2O2 3%.
Quan sát sau 1 - 2s:
nếu có bọt khí xuất hiện --> phản ứng (+)
nếu không có bọt khí xuất hiện --> phản ứng (-)

1.5.4.3. Test coagulase
a. Nguyên tắc

Một số VSV, đặc biệt các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi
trường enzyme coagulase có tác dụng làm đông tụ huyết tương.
b.

Phương pháp tiến hành

Có 2 cách:
-

-

Thử nghiệm trên lam kính: nhỏ lên lam kính một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lý.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc hoặc dịch nuôi cấy hòa vào giọt nước trên lam kính. Thêm
vào đó huyết tương người mới pha và hòa đều. Phản ứng là (+) nếu trong vòng 20 giây
xuất hiện đông tụ. Phản ứng là (-) nếu không xuất hiện đông tụ sau 4 phút và kết quả này
cần được khẳng định tiếp bằng thử nghiệm trong ống nghiệm.
Thử trong ống nghiệm: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hoặc thỏ không pha
loãng, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm rồi trộn đều VSV. Ủ ống thử


nghiệm ở 37oC. Trong 4 giờ xuất hiện đông tụ, thử nghiệm là (+). Sau 24 giờ không xuất
hiện đông tụ, thử nghiệm là (-).

1.5.4.4. Test khả năng sinh indol
a. Nguyên tắc

Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân acid amin tryptophan
sinh indol, acid pyruvic và NH3 +. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p–
dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
b. Phương pháp tiến hành
- Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường canh thang tryptophan, để ở 35° - 37°C trong 18
-

– 24h.
Nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac vào trong ống nghiệm. Quan sát kết quả. Phản ứng (+) sẽ
xuất hiện vòng màu đỏ phía trên dung dịch nuôi cấy.

1. ống nghiệm chưa được cấy VK
2. ống nghiệm cho phản ứng (+)
3. ống nghiệm cho phản ứng (-)


1.5.4.5.
1.5.4.6.
1.5.4.7.