Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu hoạt lực các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở thừa thiên huế

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay,
có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây
cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt
vải,…). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần
phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ
sinh thái.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh
vực như: nông nghiệp, chế biến thực phẩm, công nghiệp, chăn nuôi, y tế…
Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp
rất phong phú và đa dạng. Mỗi năm nguồn sinh khối trấu của nước ta khoảng
100 triệu tấn, mùn cưa 250 triệu tấn, vỏ lạc 4,5 triệu tấn, vỏ hạt điều, bã mía, gỗ
mụn khoảng 400 triệu tấn. Phần lớn các vật liệu này bị bỏ đi hoặc đốt, ít được
tận dụng. Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị
thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose
bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho
môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng
công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh
vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng
các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện
tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một
số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình
phân giải này.
Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong
một số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển
mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ,
ngoài ra chúng có khả năng phát triển rất nhanh và có thể tiết ra một lượng
enzyme lớn với đầy đủ thành phần có hoạt tính mạnh.

Vì vây, việc nghiên cứu và sửdụng nấm trichoderma trong phân giải phế
thải nông nghiệ giàu cellulose đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở Việt
Nam và trên thế giới như ơ Mỹ, năm 1983 trường đại học Rutgers, sử dụng
1


chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulose đầu tiên. Năm
1998, YU đã nuôi cấy Trichoderma reeesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột
cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g.
Ở Việt Nam nấm mốc trichoderma phân giải cellulose cũng tập trung
nhiều nghiên cứu. Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi Trichoderma
reesei sinh tổng hợp enzyme cellulose trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC
[2]. Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase với
nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã bía, võ cà phê [6]. Tác giả
Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ
nấm mốc Trichoderma reesei bằng phương pháp lên men bán rắn. [27]. Năm
2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ
Trichoderma reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [16].
Tỉnh Thừa Thiên Huế có nguồn phế thải nông nghiệp rất dồi dào, đặc biệt
nghề trồng nấm ăn phát triển sử dụng nhiều nguyên liệu rơm rạ, mùn cưa bông
gòn. Các phế thải sau trồng nấm bị thải bỏ hoặc không được xử lý triệt để, có
nguy cơ gây ô nhiễm môi trường nông thôn. Vì vậy, việc sử dụng các vi sinh
vật có khả năng phận giải cellulose mạnh như nấm Trichoderma nhằm thúc đẩy
quá trình phân giải các phế thải sau trồng nấm làm phân bón hữu cơ sinh học
vừa góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường vừa tạo nguồn phân bón có ích
cho cây trồng
Từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành: “Phân lập, tuyển chọn và
nghiên cứu hoạt lực các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở
Thừa Thiên Huế”.
1.2 Mục đích của đề tài

Phân lập, tuyển chọn được một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải
cellulose mạnh làm đối tượng cho các nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố
nuôi cấy đến hoạt tính của enzyme cellulase.
Bước đầu tạo chế phẩm sinh học phân giải cellulose nhằm xử lý thử nghiệm
các phế thải nông nghiệp như bèo tây và rơm rạ sau trồng nấm.

2


1.3. Ý nghĩa của đề tài
+ Việc tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh
thích nghi với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng ở Thừa Thiên Huế góp phần đa
dạng hóa ngân hàng giống vi khuẩn cellulose.
+ Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu tiếp
tục để xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm mốc cellulose để xử lý
phế thải nông nghiệp tạo nguồn phân hữu cơ sinh học quan trọng cho cây trồng.
+ Sử dụng nấm mốc phân giải cellulose xử lý phế thải nông nghiệp góp phần
giảm thiểu vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn hiện nay trên địa bàn tỉnh
Thừa Thiên Huế.

3


Phần 2
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về cellulase
2.1.1. Nguồn gốc
Celulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên
như: Động vật, thực vật, vi sinh vật. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích
thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản

xuất các chế phẩm enzyme. Các vi sinh vật thường được sử dụng như:
Bảng 2.1. Bảng thể hiện nguồn vi sinh vật sinh enzyme cellulasse [20]
Nhóm chính

Chi

Loài
A. niger

Aspergillus

A. nidulans
A. oryzae (Tái tổ
hợp)

Fusarium

Nấm

Humicola
Melanocarpus

F. solani
F. oxysporum
H. insolens
H. grisea
M. albomyces
P. brasilianum

Penicillium

P. occitanis
P. decumbans
T. reesei

Trichoderma

T. longibrachiatum
T. harzianum

Vi khuẩn

A. cellulolyticus
Acidothermus

Bacillus sp
Bacillus subtilis

Clostridium

C. acetobutylicum
4


C. thremocellum
Pseudomonas

P. cellulosa

Rhodothermus

R. marinus
C. fimi

Cellulomonas

C.bioazotea
C.uda

Xạ khuẩn

S. drozdowiczii

(Actinomycetes)

Streptomyces

S. sp
S. lividans

Thermononospora

T. fusca
T. curvata

2.1.2. Định nghĩa
Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau hoạt động
phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose thông qua việc thủy phân
liên kết β-1,4-glucosid [40].
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và

nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy
phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất [13], [39].
2.1.3. Phân loại
Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh học quốc tế (IUBMBInternational Union Byochemistry anh Molecular) hệ thống thủy phân cellulose
gồm có các enzyme : Endoglucanase có kí hiệu EC3.2.1.4, Exoglucanase có kí
hiệu EC3.2.1.91, β- glucosidase có kí hiệu là EC3.2.1.21 [1].
- Endoglucanase EC3.2.1.4
Enzyme này thường thủy phân các liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose
và các β-D-glucan của ngũ cốc.
- Exoglucanse EC3.2.1.91
Enzyme có tác dụng thủy phân các liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose
và cellotetraose giải phóng cellobiose từ đầu không khử.
- β-glucosidase EC3.2.1.21

5


Enzyme này thủy phân các gốc β-D-glucosid. Một số trường hợp cũng
thủy phân β-D-galactosidase, β-D-frucoside, β-D-xyloside, α-L-Arabinoside.
2.1.4. Cơ chất của cellulase
Cellulose là cơ chất của cellulase và là thành phần cơ bản của thực vật.
Hằng năm, một lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012tấn) được tạo
thành chủ yếu từ quá trình quang hợp [20], [29].
Cellulose là một polysaccharide phong phú trong tự nhiên và là một trong
những hợp chất tự nhiên khá bền vững. Nó không tan trong nước mà chỉ phồng
lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ
cao. Celulose bị phân hủy ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40-50 0C nhờ
hệ enzyme thủy phân cellulose gọi là cellulase [21].
Cellulose được cấu tạo từ các gốc β-D-glucopyranose được liên kết với
nhau bằng liên kết 1,4-glucoside. Có công thức cấu tạo là (C 6H10O5)n hay

[C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành
phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật.
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000–25.000.000 Dalton.
Các phân tử cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên
kết hydro. Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3
nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các
vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở hai vùng là kết tinh và
vô định hình [21].

Hình 2.1. Cấu trúc không gian của cellulose [29]
(Màu nâu – cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro).

6


Hình 2.2. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [6]
2.1.5. Cấu trúc của cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các axit amin, các axit
amin được nối với nhau bởi liên kết peptid (-CO-NH-), ngoài ra trong cấu trúc
còn có các thành phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme
nhóm endoglucanase và exoglucanase giống nhau trong hệ cellulase của nấm
sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát
từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosyl hóa, cuối đuôi là vùng
gắn kết với cellulose (CBD : cellulose binding domain). Vùng này có vai trò
liên kết tạo cellulose tinh thể. Trong quá trình thủy phân cellulose có sự tương
quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực
của các enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase còn dựa
vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này
chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có
mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong

cellulose. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường
của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến
hoạt tính xúc tác của enzyme [13], [29].

Hình 2.3. Cấu trúc của cellulase [29]

7


2.1.6. Cơ chế hoạt động của cellulase
Thủy phân cellulose có sự tham gia của 3 loại cellulase gồm
endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba loại trên thì
không thể thủy phân phân tử celllulose đến cùng. Mỗi dạng enzyme trong phức
cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên
những enzyme này thường phối hợp với nhau để thủy phân hoàn toàn phân tử
cơ chất thành sản phẩm đơn giản là glucose [13], [29].
2.1.6.1. Cơ chế của 1,4-β-D-glucan cellobiohyrolase (EC 3.2.1.91).
Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid từ đầu không khử chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose.

Hình 2.4.Cơ chế hoạt động của exoglucanase [29]
2.1.6.2. 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14).
Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucosid giữa mạch
của chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Sản phẩm phân
cắt là olygosacharide.

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của endoglucanase [29]
8

2.1.6.3. β-D-glucosid glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucosid không khử ở tận cùng để phóng
thích ra β-D-glucose.

Hình 2.6. Cơ chế hoạt động của β-Glucosidase [29]

Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của cellulase [13]
2.1.7. Tính chất
Thuộc tính của cellulase thay đổi tùy theo nguồn gốc của chúng. Khối
lượng phân tử của cellulase thay đổi từ 30-110KDa [29]. Cellulase là một
protein có tính axit, độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất khác nhau.
Cellulase có thể hoạt động từ dãy pH từ 3-7, nhưng pH tối ưu là 4-5 và nhiệt
độ tối ưu là 28-50 0C. Hoạt tính của cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 80 0C
trong 10-15phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose và cellobiose được
tạo ra trong phản ứng thủy phân và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, nó còn
bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn 2+, Ag+, Zn2+ nhưng ở mức độ nhẹ.
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như Carboxymethyl
Cellulose (CMC) Hydroxyethyl Cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc [32].
9


2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi
sinh vật
2.1.8.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của
vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng chủng mà
nhiệt độ thích hợp khác nhau. Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme thường bị
kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp cellulase của nhiều

loài nấm là khác nhau và nằm trong khoảng 18-30 0C. Phần lớn vi sinh vật sử
dụng môi trường lên men bắn rắn thì ưa nhiệt, có nhiệt độ thích hợp cho sinh
trưởng là 20-400C và tối đa không quá 50 0C. Các chủng xạ khuẩn thường chịu
nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Cellulase của xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn
cellulase của các loài nấm sợi [18].
2.1.8.2. pH
Sự sinh trưởng của vi sinh vật làm thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Giá trị
pH của môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật không giống nhau. Có những giá trị pH mà ở đó vi sinh vật phát triển
bình thường, nhưng quá trình sinh tổng hợp enzyme lại ít hoặc không diễn ra.
Nhiều loại nấm phát triển và sinh tổng hợp mạnh mẽ cellulase ở pH =
4,6; tuy nhiên cũng có loài như Fusarium oxysporum có thể tiếp tục phân giải
cellulose ngay cả ở những môi trường có pH = 1,8-2,0 [18], [33].
2.1.8.2. Thời gian nuôi cấy
Tốc độ phát triển của vi sinh vật thường liên quan đến thời gian nuôi cấy.
Thời gian nuôi cấy của các chủng nấm mốc phụ thuộc vào chủng giống. Thời
gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường, nấm
sợi phát triển từ 48-60 giờ đã sinh tổng hợp cellulase rất cao. Trong khi đó xạ
khuẩn phải mất ít nhất 72 giờ mới tổng hợp cellulase nhiều [18], [32].
2.1.8.3. Môi trường nuôi cấy
- Nguồn cacbon: Sự hiện diện của chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy
giữ vai trò quan trọng để vi sinh vật tổng hợp enzyme mong muốn. Để vi sinh
vật tổng hợp cellulase người ta thường bổ sung nguồn cacbon từ cellulose tự
nhiên hay dẫn xuất của nó, những chất được coi là tác nhân cảm ứng đặc hiệu
vào môi trường nuôi cấy [38].
10


- Nguồn nitơ: Ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật. Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh

celllulase là muối nitrate. Đối với các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác
nhau đến sinh tổng hợp cellulase. Sự phụ thuộc vào hàm lượng nitơ này phụ
thuộc vào từng loại sinh lý của từng loại vi sinh vật [18], [29], [33].
- Các nguyên tố khoáng: Những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo và
Cu có ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Trong đó
Zn, Mn và Fe có tác dụng kích thích tạo thành cellulase ở nhiều chủng nấm
mốc và vi khuẩn. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11–2,2mg/l, Fe là 0,2mg/l và
Mn là 3,4–27,2mg/l [18], [33].
2.1.8.4. Độ ẩm
Độ ẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất
của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Độ ẩm thích
hợp để thu canh trường vi sinh vật có hoạt độ enzyme cao là 53-70% tùy thuộc
vào đặc điểm sinh lý của từng chủng giống, cấu trúc cơ học của môi trường và
điều kiện nuôi cấy [18], [28].
2.1.8.5. Sự thông khí
Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase thường là hiếu khí. Do đó, độ thông khí
của môi trường ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp cellulase của chúng. Môi
trường không khí cũng ảnh hưởng lớn đến lượng sinh khối và lượng enzyme tạo ra
[8], [33].
2.1.9. Ứng dụng
Hiện nay việc sản xuất chế phẩm cellulase từ vi sinh vật đã được tiến hành
ở quy mô công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi vào nhiều lĩnh vực khác nhau
ở nhiều nước trên thế giới. Cellulase có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành
công nghiệp như dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, chế biến thức
ăn gia súc,…
- Trong sản xuất bia: Dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong
đó có cellulase làm cho thành tế bào đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho
tác động của protease và quá trình đường hóa.
- Trong sản xuất agar: Sử dụng cellulase xúc tác xử lý rong thu agar- agar
có chất lượng cao hơn và ít ô nhiễm môi trường hơn phương pháp dùng axit.

- Trong xử lý môi trường: Celllulase đóng một vai trò quan trọng trong
việc phân hủy cellulose có trong chất thải, giúp cho việc phân hủy này tự nhiên
11


và dễ dàng hơn. Điều này rất có ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trường đồng thời
thúc đẩy quá trình chuyển hóa trong tự nhiên [38]
- Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: Phá vỡ màng tế bào thu được các tế
bào trần thực vật và các tế bào trần nấm men.
- Trong nông nghiệp: Cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các
phế phụ phẩm trong sản xuất phân bón hữu cơ làm giảm ô nhiễm môi trường.
- Trong sản xuất cà phê ở Việt Nam (chủ yếu sản xuất bằng phương pháp
khô), phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Do đó, người ta sử
dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê, tăng khả
năng trích ly dịch quả.
- Trong sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc
trích ly dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt được
nghiền, thu được dịch quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã
ép bã thu được dịch quả. Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả
và các thành phần polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng
hiệu suất trích ly dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và
giảm thiểu một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng.
Enzyme này là điểm mấu chốt để cải thiện hiệu suất dịch hóa [13].
- Trong sản xuất thức ăn gia súc: Bổ sung chế phẩm vào thức ăn gia súc
ngoài tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm
tăng tốc độ sinh trưởng, phát triển và nâng cao chất lượng vật nuôi. Hiện nay,
việc sử dụng các loại enzyme trong ủ thức ăn chăn nuôi rất được quan tâm vì
giá thành thấp mà hiệu quả cao.
- Trong công nghiệp giấy: Cellulase và hemicellulase được sử dụng để
chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ mịn làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy

và giấy vệ sinh công nghiệp. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng để loại màu bột
gỗ để tái sử dụng và cải thiện hệ thống thoát nước trong các nhà máy chế biến
bột gỗ.
- Trong công nghiệp dệt: Cellulase được sử dụng để giữ màu cho màu vải
sáng, bền và không còn bị sờn cũ, giúp vết cắt hoàn hảo hơn, giúp điều chỉnh
độ đậm nhạt cho vải sợi.
- Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa: Được sử dụng nhằm mục đích
làm bền vải cotton. Ngoài ra, còn giúp cho bột giặt và chất tẩy rửa có thể tẩy

12


sạch một số vết bẩn khó giặt như vết mực, vết bẩn có nguồn gốc protein, vết loan
dầu mỡ…
2.1.10. Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase
2.1.10.1. Trên thế giới
Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ năm 1950. Cuối thế kỷ
XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase của các
loài vi sinh vật.
Năm 1988, Jiraporn Sukhumavasi và đã cho rằng Clostridium josui sp.
Nov là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí bắt buộc, ưa ấm phát triển tốt
nhất ở 45oC và pH=7, là vi khuẩn tạo bào tử hình tròn được tìm thấy trong
phân. Dòng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu, và những nguyên liệu
có chứa cellulose khác [39].
Năm 1991, Gokhale nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ
chủng A. niger cho biết nguồn nitrogen tốt nhất cho A. niger NCIM là dịch
chiết bắp, (NH4)2SO4 và (NH4)H2PO4 [34].
Năm 1999, dựa theo những kết quả nghiên cứu của đồng nghiệp, Kang và
Cs đã tìm ra được khả năng sinh endoglucanase và β-glucosidase của chủng A.
niger với một lượng tương đối lớn và một ít exoglucanase [36].

Năm 2000, công trình nghiên cứu của Sonia về khả năng sinh tổng hợp các
enzyme như polygalactoronase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger
3T5B8 trên các nguồn phế liệu nông nghiệp và ứng dụng enzyme này trong
việc tách chiết dầu thực vật. Cũng trong năm này, Mawadza và Cs đã nghiên
cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao
gồm phức hệ ba enzyme: Endoglucanase, cellobyhidrolase và β-glucosidase
thuỷ phân hoàn toàn cellulose.
Và nghiên cứu gần đây - năm 2008, Ahamed và cộng sự tiến hành nuôi cấy
kết hợp hai chủng nấm mốc T. reesei RUT-C30 và A. niger LMA đã rút ra kết luận
là có sự gia tăng đáng kể trong hoạt động của carbonmethyl cellulase với hoạt độ
đạt 4,7 UI/ml và hiệu quả phân giải cellulose 89,4% so với A. niger độc canh [28].
2.1.10.2. Tình hình trong nước
Cho đến nay, Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về enzyme
cellulase. Các nghiên cứu này được tiến hành trên nhiều phương diện khác
nhau liên quan đến loại enzyme này.
13


Năm 1999, Tăng Thị Chính và Cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện
lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải,
nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng
dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Nguyễn Đức Lượng và cộng
sự (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của
Actinomyces griseus [8]. Trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã
tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân
lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh [12].
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh
tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên
cứu, tác giả đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng

hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải công
nghiệp như mật rỉ đường [11].
Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase
từ T. reesei và A. niger trên môi trường lên men bán rắn [16].
Năm 2007, Khưu Phương Yến Anh, Nghiên cứu khả năng sinh enzyme
cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ [1].
Năm 2009, Nguyễn Văn Tuân đã nghiên cứu tuyển chọn, nuôi cấy
chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá
tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase [26].
Năm 2010, Đậu Thị Dung đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Mê Thuột. Tác giả
đã tuyển chọn trong tự nhiên ở Buôn Mê thuột các chủng xạ khuẩn chịu nhiệt
có khả năng sinh tổng hợp cellulase, đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố của
môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa
nhiệt đã tuyển chọn [13].
Năm 2011, Lê Hương Thủy cùng cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa các điều
kiện sinh cellulase ngoại bào trên môi trường lên men công nghiệp. Và gần
đây, năm 2012 công trình nghiên cứu của nhóm sinh viên Dương Văn Tuân, Lê
Hoàng Thùy Linh với nghiên cứu sử dụng kết hợp 2 enzyme pectinase và
cellulase của B. subtilis, P. lantarum, A. niger và PH. chysosporium để xử lý
lớp vỏ nhớt của cà phê [20].

14


2.2. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
Hệ vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase khá phong phú. Năm 1875,
Popov là người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật
kỵ khí. Năm 1903, Van Iterson đã phát hiện ra khả năng phân giải cellulose của
vi khuẩn hiếu khí. Sau đó, các công trình nghiên cứu về cellulase của vi sinh

vật phát triển không ngừng. Ngày nay, nhiều nước đã sản xuất chế phẩm
cellulase vi sinh vật trong công nghiệp ở qui mô lớn và đã ứng dụng cellulase
trong nhiều lĩnh vực.
Từ lâu, người ta đã khám phá ra các vi sinh vật có khả năng cellulose
trong dạ cỏ của những động vật nhai lại (như: trâu, bò, ngựa, cừu…). Các vi
sinh vật này phân giải cellulose trong rơm, rạ, cỏ ở dạ cỏ của động vật nhai lại
thành các chất dinh dưỡng dễ hấp thu. Các vi sinh vật này có thể là kỵ khí bắt
buộc hoặc kỵ khí không bắt buộc. Người ta đã phân tích thấy có đến 15 – 20 tỉ
vi khuẩn/ 1cm3 chất có trong dạ cỏ các động vật nhai lại. Các vi sinh vật có khả
năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ là: Ruminococcus albus,
Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus parum, Bacteroides amylophilus,
Bacteroides succinogenes, Clostridium butyricum, Clostridium cellobronarum.
Ngoài ra, nhiều vi sinh vật trong đất, nước, không khí, cây cỏ, thực vật chết,
phân động vật có khả năng phân giải cellulose. Các vi khuẩn có khả năng phân
giải cellulose khá mạnh như: Pseudomonas fluorescens var cellulose,
Acetobacter xylinum, Cellvibrio gilvus, Cellvibrio fulvus… Nhiều loài nấm có
khả năng tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao như: Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus
amstelodamy, Aspergillus fumigatus; Mucor pusillus; Penicillium notatum,
Penicillium variabite, Penicillium pusillum; Trichoderma koningi,
Trichoderma lignorum, Trichoderma viride… Người ta thấy các nấm mốc
thường sản sinh enzyme cellulase với nồng độ cao hơn là vi khuẩn.
2.3.Giới thiệu về nấm Trichoderma
2.3.1. Lịch sử ra đời của nấm Trichoderma
Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau. Trong
thời gian gần đây, người ta thường bàn nhiều đến Trichoderma và các công
dụng của nó trong lĩnh vực phân bón vi sinh. Tuy nhiên Trichoderma không
phải mới được phát hiện và ứng dụng gần đây mà khoảng 200 năm về trước,
Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm
đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: Trichoderma caesium

15


Pers. T.nigrescens Pers, T.viride var. viride Pers. Cho đến năm 1801 Persoon
và Gray đã mô tả chi tiết thêm 4 loài nấm Trichoderma đó là: T. aureum Pers
(1796), T. laeve Pers (1796), T. dubium Pers (1801), T. fuliginoides Pers
(1801). Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế
giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện
thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến hiện nay (2013) đã có trên 150 loài nấm
Trichoderma
được
mô
tả.
Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã nghiên
cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma. Và những
ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong
nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và
khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như
làtác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở
thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Nấm Trichoderma có thể sơ bộ phân loại dựa vào một số chỉ tiêu như:
hình dạng, màu sắc bào tử, kích thước của bào tử, hình dạng, màu sắc kích
thước của bào tử, hình dạng cành bào tử, cách mọc của thể bình (phialide), sự
phát triển của khuẩn lạc trên các loại môi trường ở các nhiệt độ khác nhau, mùi
vị trên môi trường, sự phân bố của khuẩn lạc trên môi trường… Đặc điểm hình
thái chung của nấm Trichoderma là sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả
năng phân nhánh nhiều, cành bào tử không màu, bào tử rất nhiều, dính ở đỉnh
của cánh bào tử. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu
cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong
không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chum nhỏ nhờ chất nhầy.

Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, tròn, elip, hoặc oval tùy theo
từng loài. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau, có kích thước từ 1
- 7µm, có hình đệm rất rắn chắc.
2.3.2. Vị trí phân loại Trichoderma
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho
công tác phân loại do còn nhiều đặc điểm chưa được biết đầy đủ. Persoon ex
Gay (1801) phân loại Trichoderma như sau [40]
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Hypocreales
16


Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Ainsworth và Susman (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp
Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [50].
Theo nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da silva (1997),
Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài
Trichoderma được chia thành 5 nhóm: Trichoderma, longibrachiatum,
Saturisporum, pachybasium và Hypocreanum [50], [51].
Theo GS Nguyễn Lân Dũng
2.3.3. Đặc điểm hình thái (Gary J.Samuels, 2004)
Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển
nhanh, trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển
sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trăng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra
một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng.

Hình 2.8 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường

PDA sau 2-3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) [50]
Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào
tử là một nhóm sợi nấm bên nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ
những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc khu vực tỏa ra của khuẩn
lạc (T. koningii), có kích thước từ 1-7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng
như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề
mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm.
Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của
cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang bào tử trần bên trong không có
17


vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chum nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm
nối bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có
màu trắng (như T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip
hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 -1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ
dài : rộng là hơn 1.4µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thước không quá
5µm.
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T.
harzianum có thể tồn tại 110-130 ngày dù không được cung cấp chất dinh
dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống
sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng
nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
2.3.4. Môi trường sống và đặc điểm sinh học
Chủng nấm Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay
Fungi Imperfecti), có khuẩn lạc màu lục (khi tăng trưởng dưới nắng mặt trời).
Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang
bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuổi (đính bào tử) ở
đầu ngọn có cuống bào tử.
Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái

chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp
phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng.
Bộ gen của nhiều loài Trichoderma đã được giải mã và được công bố công
khai từ JGI. Bộ gen của nấm Trichoderma có khoảng 30-40 Mb, với khoảng
12.000 gen được định danh.
Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong
một số môi trường sống khác. Đây là những loài nấm đất phổ biến trên khắp
thế giới. Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất [50].
Nấm Trichoderma phát triển nhanh ở 25-30°C, có một số ít loài
Trichoderma tăng trưởng được ở 45°C.
Khuẩn lạc của nấm Trichoderma có màu trong suốt trên môi trường thạch
đường bột ngô (CMD). Trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) khuẩn
lạc có màu trắng, đôi khi có màu vàng nhạt và có mùi thạch dừa đặc trưng.
Sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, thường được hình thành ở dạng
gần như vòng tròn đồng tâm ở phần trục chính gần cực.
18


Các nhánh sợi nấm thường mọc tạo gốc với trục chính khoảng 90 độ.
Phần ngọn sợi nấm thường có dạng như ngọn cây thông hay kim tự tháp (ví dụ
với Trichoderma conidiophore).
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là
cơ chế sinh sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được
ghi nhận nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương
pháp kiểm soát sinh học.
Bào tử của nấm Trichoderma mịn, thường xuất hiện dạng khô nhưng ở
một số loài có thể được nằm trong giọt chất lỏng màu xanh lá cây hoặc màu
vàng (ví dụ T. virens , T. flavofuscum ). Bào tử của hầu hết các loài có hình
elip, 3-5 x 2-4 µm (L / W => 1.3), bào tử hình cầu (L / W <1,3) rất hiếm, chỉ
thấy ở một vài loài [50].

Bào tử hậu có thể được sản xuất bởi tất cả các loài, thường mọc ở phần
cuối của những nhánh ngắn ở dạng đơn bào. Bào tử hậu của một số loài là đa
bào (như T. stromaticum ).
Nấm Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ
của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có
thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay
khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc
vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống
thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m
phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tạo và còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau
khi sử dụng. Tuy nhiên không phải nhiều giống có khả năng này.
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký
sinhvà lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát
triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế
cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự
sinh trưởng và phát triển của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh
học và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng.
Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau.
Sau đây là một số cơ chế chủ yếu:
-Ký sinh nấm khác.
-Tạo chất kháng sinh có tác dụng diệt nấm và vi khuẩn trong đất.
-Cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian với các loài nấm khác.
19


-Giúp cây chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển
của cây và rễ.
-Làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ.
-Tạo cho cây có cảm ứng kháng bệnh.
-Tạo sự bất hoạt enzyme gây bệnh cho cây.

Trichoderma vừa có khả năng phân hủy cellulose vừa có khả năng đối
kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật nên việc dùng Trichoderma trong
phân bón là lựa chọn tốt vừa bảo vệ được cây trồng, tăng thêm thu nhập, giảm
chi phí đầu tư và bảo vệ môi trường [8].
2.3.5. Công dụng
- Nấm ký sinh: Trichoderma có khả năng khống chế, cạnh tranh và tiêu
diệt nhiều loại nấm gây bệnh thối rễ, chết rạp cây con, xì mủ…trên cây trồng
như Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Sclerotium… bằng cách
tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loại nấm gây hại, sau đó
Trichoderma xâm nhập và hút dinh dưỡng của các loại nấm hại làm các loại
nấm gây hại bị chết.
- Một số giống Trichoderma giúp cây trồng phát triển nhiều rễ, ra rễ mạnh
hơn, nhiều hơn và mọc sâu hơn (sâu 1m dưới mặt đất) do đó làm cho cây trồng
tăng chính chống chịu hạn và tính đổ ngã. Ngoài ra nghiên cứu cho thấy trên rễ
cây bắp nếu xử lý dòng nấm Trichoderma T.22 thì nhu cầu cây bắp cần ít hơn
40% đạm so với cây không xử lý nấm Trichoderma.
- Phân giải hữu cơ: Trichoderma được xem như nhà máy sản xuất enzym
phân giải chất xơ cellulose và các enzym phân giải các hợp chất khác (chitin,
protein, pectin, amylopectin…). Do đó Trichoderma thường được trộn chung
với chất thải hữu cơ, vỏ cà phê, dư thừa thực vật sau thu hoạch để đẩy nhanh
quá trình phân hủy các chất hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng giúp cây
hấp thụ dễ dàng.
Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân chậm tan của
Trichoderma mà người ta đã trộn chúng vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi
sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế
phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ
vi sinh vật có ích trong đất; phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tiêu,
cung cấp dinh dưỡng cho cây; phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng,
chất lượng phân cao hơn.
20

- Phân hữu cơ sinh học: Nhờ các đặc tính trên mà thường được trộn chung
với các loại phân hữu cơ (phân chuồng) và các chế phẩm sinh học…bón vào
đất để hạn chế bệnh hại và cải tạo tính chất vật lý, hóa học của đất giúp đát tơi
xốp, thoáng khí, nhiều chất mùn, tăng độ phì, tạo điều kiện thuận lợi cho vi
sinh vật có ích và vi sinh vật đối kháng phát triển, hạn chế phân bón hóa học và
thuốc BVTV, giúp tăng cường khả năng phát triển, phục hồi bộ rễ....
- Ứng dụng trong công nghệ SX cây trồng kháng bệnh: Một số gen lấy từ
chủng Trichoderma harzianum được cấy vào cây trồng giúp cây kháng được
nhiều nấm bệnh như bệnh đốm vòng, khảm, chết rạp cây con.
- Tính mẫn cảm với thuốc BVTV: Trichoderma thể hiện tính kháng thuốc
với phần lớn các hóa chất nông nghiệp bao gồm cả thuốc trừ sâu và thuốc trừ
bệnh. Dù rằng tính kháng thuốc này ở các chủng Trichoderma có khác nhau.
Tuy nhiên một số tài liệu khuyến cáo không dùng chung Trichoderma với sản
phẩm có hoạt chất Carbendazim và Benomyl....
Ngoài các ưu điểm như trên, khi dùng Trichoderma spp. còn có những ưu
điểm khác như:
•

Không gây hại cho người và vật nuôi

•

Có phổ đối kháng rộng trên các loài nấm gây bệnh trên cây trồng

•

Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh

•

Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử

•

Phát triển nhanh trong đất

Đẩy nhanh quá trình hấp thu chất dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng
cây trồng
•

2.3.6. Ứng dụng của nấm mốc phân giải celllulose
2.3.6.1. Trong công nghệ làm phân bón vi sinh
Phân bón vi sinh vật phân giải cenlulose là sản phẩm chứa một hay nhiều
chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện
hành có khả năng phân giải cenlulose , để cung cấp chất dinh dưỡng cho đất và
cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và chất lượng nông sản, tăng độ
màu mỡ của đất. Phân vi sinh vật phân giải cenlulose và các chủng vi sinh vật
này không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và
chất lượng nông sản.

21


Sử dụng phân bón vi sinh giúp trả lại độ phì nhiêu cho đất bằng cách làm
tăng hàm lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác. Các nhà khoa học đã
kết luận: sử dụng phân hữu cơ vi sinh làm tăng năng suất cây trồng, chất lượng
sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lượng NO3 -. Điều này cũng có nghĩa
phân hữu cơ vi sinh đã góp phần quan trọng trong việc cải tạo đất, đáp ứng cho

một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững, xanh sạch và an toàn [4].
Góp phần làm giảm các vấn đề ô nhiễm môi trường, ít gây nhiễm độc hoá
chất trong các loại nông sản thực phẩm so với sử dụng phân bón hóa học.
Hiệu quả của vi sinh vật trong việc làm tăng khả năng sinh trưởng và phát
triển cây trồng, tiết kiệm phân bón hoá học cũng như tăng năng suất, chất lượng
nông sản.
2.3.6.2. Trong công nghệ xử lý rác thải và giảm thiểu ô nhiễm môi trường
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu
quả. Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu về việc sử dụng cellulose cho các chủng
vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác.

22


Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm mốc được phân lập từ các bãi rác, xưởng mùn cưa, rơm rạ
mục, lá cây mục và một số vùng đất canh tác khác nhau ở Thừa Thiên Huế.
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh vật
thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa nông học, trường Đại Học Nông Lâm
Huế.
3.2.2. Thời gian: Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng thời gian từ 9/2014
đến tháng 5/ 2015.
3.3. Thiết bị, dụng cụ và môi trường thí nghiệm
3.3.1.Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

- Thiết bị thí nghiệm: Buồng cấy, tủ ấm, tủ khử trùng dụng cụ, máy lắc, cân
điện tử, nồi hấp áp lực, máy đo mật độ quang, máy đo pH, máy li tâm, tủ lạnh.
- Dụng cụ thí nghiệm: Bình tam giác (100,250, 500ml), đĩa petri, ống
nghiệm, que cấy, que phân lập.
3.3.2. Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
* Môi trường phân lập
Hai loại môi trường là PDA và và Crapek- dox được sử dụng để phân lập
các chủng nấm mốc, có các thành phần như sau:
+ Môi trường PDA (1 lít môi trường lỏng):
- Khoai tây : 200g
- Glucose: 20g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1 lít
- pH:5.5
+ Môi trường Czapek- dox (1 lít môi trường lỏng)
- Saccarose: 10 g/l
- KCl: 1 g
23


- NaNO3: 2g
- KH2PO4:1g
- MgSO4.7H2O: 0,5 g
- FeSO4: 0.01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1 lít
- pH:6-6.5
* Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm mốc
Sử dụng môi trường Czapek- dox nhưng thay nguồn carbon bằng CMC
(carboxyl methyl cellulose) để đánh giá hoạt tính phân giải cellulose của các

chủng nấm mốc.
* Môi trường thu nhận enzyme cellulase của các chủng nấm mốc
Để nuôi cấy thu dịch chiết enzyme cellulase ngoại bào chúng tôi sử dụng
cả hai loại môi trường lỏng và xốp. Môi trường lỏng có thành phần tương tự
môi trường Czapek- dox nhưng không có thạch agar và thay đường saccarose
bằng CMC (carboxyl methyl cellulose). Môi trường xốp bao gồm cơ chất là
cám gạo:bột bắp với tỉ lệ 3:1. Đây cũng là môi trường dùng để nhân sinh khối
nấm mốc cho các thí nghiệm xử lý nguyên liệu sau này.
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu đất, rơm rạ, lá cây mục ở các
bãi rác, xưởng mùn cưa, và các vùng đất canh tác khác nhau của các tỉnh Thừa
Thiên Huế, Quảng Nam, Đắc lắc.
- Tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose mạnh.
- Xác định hoạt độ của enzyme cellulase bằng phương pháp khuyếch tán
trên thạch đĩa và phương pháp định lượng đường khử thông qua phản ứng tạo
màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS).
- Xác định thời gian và nguồn carbon nuôi cấy thích hợp cho việc sinh
tổng hợp enzyme cellulase của chủng nấm mốc được tuyển chọn.
- Thử nghiệm khả năng phân giải bèo lục bình của các chủng nấm mốc
trong phòng thí nghiệm.
24


- Thử nghiệm khả năng xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm của chủng
chủng nấm mốc ngoài đồng ruộng nhằm tạo phân hữu cơ sinh học.
3.4.2.Phương pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Phương pháp phân lập và xác định số lượng nấm mốc
* Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm
Tiến hành rửa sạch, làm khô các dụng cụ thí nghiệm (ống nghiệm, bình

tam giác, đĩa petri, pipet,…), sau đó bao gói và đem khử trùng ở 165 0C trong
vòng 2 giờ.
* Chuẩn bị môi trường phân lập:
Sử dụng cân điện tử cân chính xác các thành phần của môi trường Crapekdox và PDA. Pha môi trường với nước cất, đo pH trước khi đem hấp thanh
trùng bằng nồi hấp áp lực ở 1210C trong khoảng 20 phút. Phân phối môi trường
vào các hộp petri đã vô trùng. Để làm môi trường thạch nghiêng, rót khoảng 34 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào mỗi ống nghiệm, đậy nút bông, đem
hấp thanh trùng, như trên, sau đó lấy ra và đặt nghiêng ống nghiệm để tạo mặt
thạch nghiêng.
* Phân lập nấm mốc:
Cân 1 gam mẫu cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất vô trùng lắc
đều, ta có độ pha loãng 10-2, lấy ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước
cất vô trùng lắc đều, ta có độ pha loãng 10 -3, tiếp tục như vậy cho đến các độ
pha loãng 10-4, 10-5,10-6… Dùng pipette vô trùng lấy dịch pha loãng ở các nồng
độ tương ứng nhỏ vào hộp petri chứa môi trường phân lập, dùng que gạt dàn
đều giọt dịch trên mặt thạch. Mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri. Bao gói cẩn
thận và đem nuôi ở 300C cho mọc thành khuẩn lạc.
* Đếm số lượng khuẩn lạc nấm mốc:
Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành đếm khuẩn lạc nấm mốc mọc trên đĩa petri
và tính số lượng khuẩn lạc nấm mốc trong trong đất theo công thức sau:

Nt = n.p.q
Nk = n.p.q/k
25