Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG Đ I H C KHOA H C T

NHIÊN

----------------------------

Nguy n Văn B c

NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA
THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T

LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C

Hà N iăậ 2010


ĐẠI H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG Đ I H C KHOA H C T

NHIÊN

KHOA SINH H C

Nguy n Văn B c

NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA

THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T

Chuyên ngành: Sinh h c th cănghi m
Mưăs : 60 42 30

LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C

H

NGăD NăKHOAăH C:ăPGS. TS. NghiêmăNg căMinh

Hà N iăậ 2010


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Lời cảm ơn!
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng
phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành
khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện
Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ
Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thành khóa luận.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa
Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại
học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng
biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, tháng 12 năm 2010
Học viên

Nguyễn Văn Bắc


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc
DANH M C CH

VI T T T

Bp

: Base pairs

CNSH

:ăCôngăngh ăsinhăh c

CTCLQG

:ăCh

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drugăresitantă(Kh́ngăthu căm̉ăr ng)

EMB

: Ethambutol.

HRS

:ăBaălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin

HRSE

: B nălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin và ethambutol

INH

: Isoniazid

IPTG

: Isopropyl-thio- -D-galactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Luria - Bertani

MDR

:ăMultidrugsăresistantă(Kh́ngăđaăthu c)

PAS

: Paraminosalicylic acid

PAZ

: Pyrazinamid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RMP

: Rifampicin

RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determiningăregionă(Vùngăquy tăđ nhăkh́ngă

ngătr̀nhăch ngălaoăqu căgia

rifampicin)
Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase

TCYTTG

:ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíi

V

:ăVolumeă(thểătích)

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

M CL C
M

Đ U ......................................................................................................................... 1

Ch

ng 1 ậ T NG QUAN ............................................................................................ 3

1.1.ăB NHăLAO ........................................................................................................... 3
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNGăTHU C ................................................................... 3
1.γ.ăVIăKHU NăLAO .................................................................................................. 5
1.3.1. C u t o ........................................................................................................... 5
1.3.2. C ch gơy b nh ............................................................................................ 8
1.3.3. Đặc điểm h gen ............................................................................................ 9
1.4.ăC ăCH ăKHÁNGăTHU Că ăVIăKHU NăLAO ................................................ 9
1.4.1. Kháng sinh trong điều tr lao ....................................................................... 9
1.4.2. Nguyên nhơn gơy kháng thu c .................................................................. 10
1.4.3. Rifampicin vƠ c ch kháng ....................................................................... 12
1.4.4. Isoniazid vƠ c ch kháng .......................................................................... 15
1.5.ăCÁCăPH

NGăPHÁPăCH NăĐOÁNăLAOăKHÁNGăTHU C ....................... 16

1.5.1. Đặc điểm lơm sƠng vƠ các xét nghi m c n lơm sƠng ............................... 16
1.5.2. Xác đ nh kiểu hình ...................................................................................... 18
1.5.3. Xác đ nh kiểu gen........................................................................................ 18
1.5.4. K thu t real-time PCR và multiplex real-time PCR ............................. 19

Ch

ng 2 ậ V T LI U VẨ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U ............................... 23

β.1.ăV TăLI UăNGHIÊNăC U ................................................................................. 23
2.1.1. Đ i t

ng nghiên c u ................................................................................. 23

2.1.2. V t li u thi t b vƠ ḍng c̣ nghiên c u .................................................... 23
2.1.3. Các cặp m i dùng trong nghiên c u ......................................................... 24


Luận văn thạc sĩ
β.β.ăPH

Nguyễn Văn Bắc

NGăPHÁPăNGHIÊNăC U ....................................................................... 25

2.2.1. S đ nghiên c u ......................................................................................... 25
2.2.2. PCR nhơn đo n gen đích ............................................................................ 26
2.2.3. T o dòng gen ............................................................................................... 27
2.2.4. Multiplex real-time PCR ............................................................................ 28
Ch

ng 3 ậ K T QU VẨ TH O LU N ................................................................ 30

γ.1.ăK TăQU ăTÁCHăDọNGăVẨăGI IăTRÌNHăT ............................................... 30
3.1.1. K t qủ nhơn gen katG và rpoB t̀ DNA tách t̀ vi khu n lao ............... 30
3.1.2. K t qủ tách dòng gen ................................................................................ 31
3.1.3. K t qủ phơn tích trình t gen katG ......................................................... 34
3.1.4. K t qủ phơn tích trình t gen rpoB ......................................................... 36
γ.β.ăT Iă UăHịAăPH Nă NGăMULTIPLEXăREAL-TIMEăPCRăPHÁTăHI Nă
NHANHăVIăKHU NăLAOăKHÁNGăTHU C ......................................................... 41
3.2.1. Thi t k các primer và probe cho ph̉n ng multiplex real-time PCR . 41
3.2.2. K t qủ t i u thƠnh ph n vƠ chu trình ph̉n ng multiplex real-time
PCR phát hi n đột bi n liên quan kháng thu c ................................................. 44
K T LU N ................................................................................................................... 60
KI N NGH .................................................................................................................. 61
TẨI LI U THAM KH O ........................................................................................... 62
PH L C ...................................................................................................................... 69


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

M

Đ U

B nhălaoăvƠăviăkhu nălaoă(Mycobacterium tuberculosis)ăđưăđ ợcăbi tărõăt ăm tă
th ă kỷă nay.ă Hi nă nayă tỷă l ă nhi mă laoă đ ợcă ́cătínhălƠă 1/γă dơnă s ă th ă gíi,ăkho ngă 9ă
tri uăng

iămắcălaoăḿiăvƠăh năγătri uăng

iăch tădoălaoăm iănĕm.ăB nhălaoăđangătr̉ă

nênă nghiêmă tr ngă h nă v́iă s ă xuấtă hi nă ćcă ch ngă laoă kh́ngă đaă thu că (Multi-Drugs
Resistant - MDR),ă t́că lƠă thểă laoă v́iăviă khu nă kh́ngă ítănhấtă haiă lọiă thu că ch ngă laoă
ṃnhănhấtălƠăisoniazidă(INH)ăvƠărifampicină(RMP).ăTheoăs ăli uăth ngăkêăc aăch
tr̀nhăch ngălaoăQu căgiaănĕmăβ007,ăth ăgíiăcóăkho ngă511.000ătr
kh́ngă đaă thu c,ă trongă đóă cóă h nă 1γ0.000ă tr

ngă

ngăhợpănhi mălaoă

ngă hợpă tửă vong.ă Doă nh ngă khóă khĕnă

trongăvi căđiềuătr ănh ngăb nhănhơnămangăćcăch ngălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngăvƠăđaă
kh́ngămƠăvi căph́tăhi năśmăćcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu căs ătr̉ănênărấtăquanătr ngă
trongăđiềuătr ăb nhălao.
Hi nă nayă nhiềuă n iă ch nă đónă viă khu nă laoă kh́ngă thu că v nă d aă vƠoă ph

ngă

ph́pănuôiăcấyăviăkhu năvƠălƠmăkh́ngăsinhăđ ălƠăch ăy u,ătuyănhiên,ăvi cắngăd ngăsinhă
h căphơnătửăcũngăđangăṭoăraănh ngăđ tăph́ătrongăph́tăhi năviăkhu nălaoăkh́ngăthu c.ă
C ăch ă kh́ngă thu că ̉ă viă khu nă laoă lƠă doă trongă qúă tr̀nhă ti nă hóa,ă cóă nhiềuă đ tă bi nă
xuấtăhi nătrongăm tăs ăgenăch́cănĕng,ătr ́căh tălƠẳăgenărpoB và katG.ăTh iăgianăch nă
đónăcóăthểărútăngắnăchỉăcònăvƠiăngƠy,ăv́iăđ ănḥyăvƠăđ ăđặcăhi uăcao,ăṭoăđiềuăki nă
choăkiểmăsótăb nhălaoăd ădƠngăh n.ăĆcănghiênăćuăvềăsinhăh căphơnătửătrongăch nă
đónălaoăkh́ngăthu căđưăchỉăraărằngăm iălọiăkh́ngăthu călƠădoăxuấtăhi năćcăđ tăbi nă
trênăgenăt

ngắngăch uătŕchănhi m.ăChínhăv̀ăv yăvi căx́căđ nhăćcătr

laoăkh́ngăthu căth

ngăhợpănhi mă

ngăđiăkèmăv́iănh ngăch năđónăph́tăhi năđ tăbi năgenăđ iăv́iăćcă

ch ngălaoăph́tăhi năđ ợc.ăĆcăch ngăvi khu nălaoăkh́ngăisoniazidălƠădoăcóăliênăquană
t́iăđ tăbi năṭiăcodon 315 trên gen katG,ăđ iăv́iăćcăch ngăkh́ng rifampicinădoăxuấtă
hi năcác đ tăbi nẳăm t vùng nóng g măβ7ăcodonănằmăg nătrungătơmăc aăgenărpoB.

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Xuấtă ph́tă t ă nh ngă lỦă doă trên,ă chúngă tôiă ti n hƠnhă đềă tƠi:ă “Nghiên cứu phát
hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
V́iă m că tiêuă nghiênă ću: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và
rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
Đểă đ̣tă đ ợc m că tiêuă c aă đềă tƠi,ă chúngă tôiă ti nă hƠnh m tă s ă n iă dungă nghiênă
ćuănh ăsau:
1.

X́căđ nhătr̀nhăt ăgenărpoB và katG.

2.

Phân tích đặcăđiểmăphơnătửăc aăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c phân
l păṭiăVi tăNam trênăc ăs̉ătr̀nhăt ănucleotideăc aăhaiăgenărpoB và katG.

3.

T iă uă hóaă thƠnhă ph nă vƠă chuă tr̀nh b ă kit multiplex real-time PCR phát
hi nănhanhăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c.

2


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Ch

ng 1 ậ T NG QUAN

1.1.ăB NHăLAO
Lao (Tuberculosis) là m tă b nhă truyềnă nhi mă ṃn tính,ă lƠă t̀nhătṛngă nhi mă viă
khu nă Mycobacterium tuberculosis,ă th
h ̉ngăđ năh ăth năkinhătrungă
kê),ăx

ngă gặpă nhấtă ̉ă ph̉iă nh ngă cũngă cóă thểă nhă

ngă(laoămƠngănưo),ăh ăḅchăhuy t,ăh ătu năhoƠnă(laoă

ngăvƠăkh́p.ăB nhălaoăgắnăliềnăv́iăs ăph́tătriểnăc aăxưăh iăloƠiăng

iăt ăhƠngă

ngƠnănĕmănay,ătrênăth ăgíiăch aăbaoăgi ăvƠăkhôngăm tăqu căgiaănƠo,ăm tăkhuăv cănƠo,ă
m tădơnăt cănƠoăkhôngăcóăng

iămắcăvƠăch tăv̀ăb nhălao.ăTr căkhu nălaoăl năđ uătiênă

đ ợcăb́căsƿăRobertăKochăđưăph́tăhi năvƠo ngày 24/3/1882. Trongăth iăgianănƠyẳăMỹă
vƠăchơuăÂu,ăćă7ăng

iăth̀ăcóă1ăng

iăch tăv̀ălao,ădoăv y,ăph́tăhi năc aăRobertăKochălƠă

m tăb ́căngoặtăquanătr ngătrongăvi căkh ngăch ăvƠălọiătr ăcĕnăb nhănƠy.ăTr ́căđơy,ă
laoăđ ợcăxemălƠăm tătrongănh ngăcĕnăb nhătruyềnănhi mănguyăhiểmănhấtătrênăth ăgíi,ă
l uăhƠnhăv́iătỷăl ămắcăb nhăkh́ăcao,ăđặcăbi tẳăćcăn ́căthu căchơuăPhiăvƠăkhuăv că
chơuăÁ,ătrongăđóăcóăVi tăNam.
Vi tă Namă đ́ngă th́ă 12 trongă ββă n ́că cóă s ă b nhă nhơnă laoă caoă trênă toƠnă c u.ă
Trongă khuă v că Tơyă Th́iă B̀nhă D

ng,ă Vi tă Namă đ́ngă th́ă baă sauă Trungă Qu că vƠă

Philippinesăvềăs ăb nhănhơnălao,ăcũngănh ăs ăb nhănhơnălaoăxuấtăhi năhằngănĕm.ăHi nă
nayănguyăc ănhi mălaoẳăn ́cătaăhằngănĕmăđ ợcă ́cătínhălƠă1,5%ădơnăs ă(̉ăćcătỉnhă
phíaă Namă lƠă β%,ă ̉ăćcă tỉnhăphíaă Bắcă lƠă 1%).ă Trênă th că t ă chỉă s ă nguyă c ănhi mă laoă
hƠngănĕmăcóăthểăcaoăh nă1,5%,ănh ăv y,ăćcăconăs ănêuătrênăcònăcóăthểăĺnăh n.ăĐiềuă

đóăs ătĕngăthêmăs ăkhóăkhĕnăđ iăv́iăcôngăt́căphòngăch ngălaoăkhôngănh ngătrongăćcă
nĕmăt́iămƠăcóăthểă trongăth iăgianăkh́ădƠi,ăcóăthể đ năhƠngăch cănĕm,ăngayăc ă khiẳă
thiênăniênăkỷăḿiă[3, 35].
1.β.ăTÌNHăHÌNHăLAOăKHÁNGăTHU C
B nhă laoă ngƠyă cƠngă tr̉ă nênă ph́că ṭpă vƠă cóă nhă h ̉ngă nặngă nềă khiă xuấtă hi nă
thêmăviăkhu nălaoă kh́ngăthu căṭoă nênă m tăḍngăb nhăkhóăphòngă ch ng.ăĆcăch ngă

3


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

lao kháng thu căđ ợcăchiaălƠmăhaiăthể,ăđóălƠălaoăkh́ngăđaăthu că(Multi-drugs resistant
- MDR)ăvƠălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngă(Extensively drug resistant - XDR),ănh ngăch ngă
viăkhu nălaoăkh́ngăthu cănƠyălƠăngu nălơyănhi măvƠălƠăm iăđeăd aăchoăścăkh eăc aă
c ngăđ ng.ăTheo ́cătínhăc aăT̉ăch́căYăt ăth ăgíiă(WHO),ătrênăth ăgíiăcóăkho ngă4βă
ṿnă ng

iă mắcă laoă kh́ngă đaă thu c,ă chi mă s ă l ợngă ĺnă nhấtă lƠă ̉ă khuă v că Tơyă Th́iă

B̀nhăD

ngăcóă15ăṿnătr

ngăhợp,ăk ăđ nălƠăkhuăv căĐôngăNamăÁăvƠăsauăđóălƠăkhuă

v căChơuăPhiăvƠăĐôngăÂu.ăM tăs ăch ngălaoăv aăkh́ngăđaăthu căv aăkh́ngăthu căph̉ă
r ng,ă cóă thểă coiă lƠă lọiă siêuă kh́ngă thu c [17].ă T̀nhă h̀nhă laoă siêuă kh́ngă thu că cũngă

ngƠyăcƠngătr̉ănênătr mătr ng,ădoăv yăt ăth́ngă11/β004ăđ nă11/β005,ăWHOăvƠăTrungă
tơmăKiểmăsótăB nhăHoaăKỳăđưăphơnătích 17.890ăm uăđ măgửiăt ă40ăqu căgiaătrênătoƠnă
th ăgíi,ăvƠăthấyărằngăcóăβ0%ătr

ngăhợpălƠăkh́ngăđaăthu căvƠăβ%ătr

thu căph̉ăr ng.ă ăVi tăNam,ătheoănghiênăćuăc aăCh
thì có 32,5%ăćcătr

ngăhợpălƠăkh́ngă

ngătr̀nh Ch ngălaoăQu căgiaă

ngăhợpăb nhălaoăḿiămangăviăkhu nălaoăkh́ngăthu că[1, 3].

Viăkhu nălaoăkh́ngăthu călƠăm tăth́chăth́căĺn,ăđeăd aăcôngăcu căphòngăch ngă
laoă trênă toƠnă c u,ă v̀ă ćcă thu că ch ngă laoă cóă hi uă qu ă hi nă nayă đangă b ă viă khu nă laoă
kh́ngăḷiănhấtălƠăkh́ngăđaăthu că[10].ăThu căch ngălaoăcóănhiềuălọi,ăt́căd ngăc aăm iă
thu cătrênătr căkhu nălaoăkhôngăgi ngănhau.ă Hi nănayăng

iătaăchiaăthu căch ngălaoă

thƠnhă haiă lọi:ă (1)ă ćcă thu că ch ngă laoă ch ă y uă (cònă g iă lƠă ćcă thu că ch ngă laoă lọiă
m t,ăthu căch ngălaoăhƠngăđ u),ă(β)ăćcăthu căch ngălaoăth́ăy u (cònăg iălƠăćcăthu că
ch ngălaoălọiăhai,ăthu căch ngălaoăhƠngăth́ăhai).ăTrongăkhiăćcăthu căch ngălaoălọiă
m tălƠănh ngăthu căcóăhi uăqu ănhấtăvƠăcũngăítăđ cătínhănhất,ăth̀ăćcăthu căch ngălaoă
hƠngăth́ăhaiălƠănh ngăthu căcóăt́căd ngăkémăh năḷiăcóăđ cătínhăcaoăvƠăgíăthƠnhărấtă
đắt.ă ăNewăYork,ăchiăphíăđiềuătr ăb nhănhơnănḥyăv́iăthu căchỉămấtăβ.000ăUSDătrongă
khiă đóă điềuă tr ă b nhă nhơnă kh́ngă thu că h tă β50.000ă USD.ă Hi nă nayă s ă tửă vongă hƠngă
nĕmădoălaoătrênăth ăgíiăcònăĺnăh năs ătửăvongădoăHIV,ăs tărétăvƠăćcăb nhănhi tăđ́iă

c ngăḷi.ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíiăđưănh năđ nhăb nhălaoăhi nănayăđưăquayătr̉ăḷiăvƠătr̉ă
nênăt iăt ăh năb̉iăs ăkh́ngăthu căc aăviăkhu nălaoă[17].

4


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Thu căkh́ngăsinhăđ uătiênădùngăđểăđiềuătr ălaoălƠăstreptomycin,ănh ngăvƠiănĕmă
sau khi kháng sinh nƠyăđ ợcăsửăd ngăth̀ăng

iătaăđưănh năthấyăhi năt ợngăđềăkh́ngăḷiă

streptomycinăc aăviăkhu nălao.ăSauăđóăćcăkh́ngăsinhăch ngălaoăkh́căti păt căraăđ i:ă
para ậ aminosalysilic,ăisoniazid,ărifampicinănh ngăđềuăkhôngămangăḷiăhi uăqu ăsauă
m tăth iăgianăđiềuătr ănhấtăđ nhă[7].ăNghiênăćuăt̀măki măhóăd ợcăḿiăcóăhi uăqu ă
điềuătr ălao,ăđặcăbi tălƠălaoăkh́ngăthu căluônăluônăđ ợcăth căhi năvƠăcƠngăngƠyăcƠngă
cóănhiềuăhợpăchấtăch ngălaoăḿiăđ ợcăđ aăvƠoăsửăd ng,ăvíăd ,ăg năđơyălƠălinezolidă
[43].ăTuyănhiên,ătheoăc ăch ăvƠắpăl c,ăviăkhu năkhôngăng ngăbi năđ̉iăṭoănênănhiềuă
ch ngă ḿiă h nă cóă kh ă nĕngă kh́ngă thu că nhanhă chóngă h nă [52].ă Kh ă nĕngă điềuă tr ă
thƠnhăcôngăcóăthểăđ̣tă95-100%ăđ iăv́iănh ngăb nhănhơnămắcălaoăthôngăth

ng,ătrongă

khiătỷăl ăthƠnhăcôngăv́iăb nhănhơnămắc laoă kh́ngăthu căchỉălƠăβ0ă ậ γ0%,ăth măchíă
cònăkhôngăđiềuătr ăđ ợcăkhiămắcălaoăkh́ngăđaăthu căvƠăkh́ngăthu căph̉ăr ngămặcădùă
đưădùngăk tăhợpăđ nănĕmălọiăkh́ngăsinhăđiềuătr ălao.ăV̀ăv y,ăvi căph́tăhi năvƠăngĕnă
chặnăs ălanătruyềnăćcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu călƠăvấnăđềăquanătr ngănhấtătrongăđiềuă

tr ălaoăhi nănayă[7, 10, 35].
1.γ.ăVIăKHU NăLAO
1.3.1. C u t o
Tr căkhu nălaoăcóăḍngăh̀nhăque,ăthơnăm nhădẻ,ăkhôngăcóănhaăbƠo,ăkíchăth ́căβă
- γăµm,ădƠyă0,γăµm,ăkh́ngăc n,ăkh́ngăacid (hình 1.1).ăKhiăđ ợcănhu măbằngăph

ngă

pháp Ziehl - Neelsen,ă tr că khu nă laoă bắtă mƠuă đ ă th m,ă doă khôngă b ă c nă vƠă acidă lƠmă
mấtă mƠuă carbonfuchsin.ă ă môiă tr

ngă nuôiă cấyă cóă đ ă acidă đ mă đặcă nhấtă đ nh,ă tr că

khu nălaoăv năph́tătriểnăđ ợc,ăv̀ăv y,ăchúngăđ ợcăg iălƠătr căkhu năkh́ngăc n,ăkh́ngă
toan (acid fast bacilli - AFB),ă đơyă lƠă đặcă điểmă n̉iă b tă c aă viă khu nă thu că chiă
mycobacteria.ăĐặcăđiểmănƠyărấtăquanătr ngăđểăph́tăhi nătr căkhu nălaoăbằngăph

ngă

ph́păh̀nhăth́iăh că(nhu mămƠu)ătrongăćcăm uăb nhăph m.ăM tăs ăgi ăthi tăchoărằngă
ḿcăkh́ngăacidălƠădoăđ ădƠiăc aăćcăchu iămycolicăacid.ăM. tuberculosis cóăkh ănĕngă

5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thểăhi nătấtăc ăćcăc ăch ăc năthi tăđểăt̉ngăhợpăćcăvitamin,ăaminoăacidăvƠăćcăenzymeă

cofactorăthi tăy uăc aăt ăbƠo.ăMycobacteriaăcóăcấuătrúcăg năgi ngăv́iăviăkhu năGramă
d

ngănh ngăchúng khôngăđ ợcăx păvƠoălọiăviăkhu năGramăd

ngădoăćcăphơnătửăgắnă

v́iă thƠnhă t ă bƠoă lƠă lipidă ch́ă khôngă ph iă proteină hayă polysaccharide.ă Doă đó,ă chúngă
khôngăgi ăḷiătinhăthểămƠuătímăxuấtăhi nătrongănhu măGramă[2, 5, 37, 38].
Tr căkhu nălaoărấtăhi uăkhí,ăph́tătriểnăt tănhấtẳăγ7oCăvƠăd ́iắpăsuấtăc aăO2 là
100ămmHg.ăĐỉnhăph̉iăvƠăvùngăph̉iăd ́iăx

ngăđònăth

suấtăO2 t ă1β0ăậ 1γ0ămmHgă(khiăđ́ng)ăr iăđ năthơnăx

ngăhayămắcălaoănhấtăv̀ăcóắpă
ngăvƠăđ uăx

ngăv̀ắpăsuấtăO2

̉ăđơyălƠă100ămmHg.ăĹch,ăgan,ăḍădƠy,ăth căqu năítămắcălaoăh năv̀ắpăsuấtăO2 thấp.
Tr căkhu nălaoăsinhăs nărấtăch m,ăćăβ0ăgi ăḿiăcóăm tăl năphơnăchiaăt ăbƠo,ă
trongăđiềuăki năphòngăthíănghi măth̀ăćă1βăđ năβ4ăgi ăM. tuberculosis phơnăchiaăm tă
l nă trênă môiă tr

ngă nuôiă cấyă giƠuă dinhă d ỡngă Loewensteină [46].ă T că đ ă ph́tă triểnă

ch măcóăthểălƠădoătínhăth măthấuăc aăthƠnhăt ăbƠoăḥnăch ătrongăvi căhấpăth ăchấtădinhă
d ỡngăvƠăliênăquanăđ năt căđ ăt̉ngăhợpăribosomeă(H̀nhă1.2).

Hình 1.1. Hình d ng c a t bƠo M.
tuberculosis
( />crobe_gallery/tuberculosis)

Hình 1.2. T bƠo vi khu n lao phát
triển trong môi tr ng nuôi c y.
( />/story?id=3079114&page=1)

6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Tr căkhu nălaoăcóăcấuăṭoărấtăph́căṭp,ăhoƠnăh oămƠăítăviăsinhăv tănƠoăcóăđ ợc.ă
D ́iăkínhăhiểnăviăđi nătửătr căkhu nălaoăcóăcấuăṭoăchínhănh ăsau (hình 1.3):
- ĹpătrongăcùngăcóăcấuătrúcămƠng,ăcóăthƠnhăph năch ăy uălƠăćcăphospholipidă
g măβănhóm:ănhómă aăn ́căh ́ngăvƠoăbênătrong,ănhómăkỵăn ́căquayăraăngoƠi.ăCấuă
trúc nàyăṭoănênămƠngăsinhăh căcóăt́căd ngăgiúpătr căkhu năđiềuăhòaăs ăth măthấuăc aă
v ăngoƠiătr căkhu n,ămƠngăcònăch́aăćcăproteinăch́cănĕngăkh́cănh ăćcăproteinătruyềnă
tínăhi uăđ năb ăḿyătraoăđ̉iăchấtăvƠădiătruyềnătrongănguyênăsinhăchất,ăćcăenzymeăliênă
quanăđ năqúătr̀nhătraoăđ̉iăchấtăvƠăsinhănĕngăl ợng,ăćcăchấtămangălƠmătrungăgianăchoă
qúătr̀nhăv năchuyểnăćcăchấtădinhăd ỡngăvƠăćcăion.ăĆcăenzymeăxuyênămƠngăvƠăt̉ngă
hợpămƠng,ăṭoăthƠnhăv́chăngĕnătrongăphơnăchiaăt ăbƠo,ăt păhợpăvƠăti tăm tăs ăenzymeă
ngọiăbƠo, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Ĺpă ti pă theoă lƠă peptidoglucană liênă k tă v́iă đ

ngă arabinoseă vƠă ćcă phơnă tửă

mycolicăacidăṭoănênăm tăb ăkhungăđ nhăh̀nhăchoăviăkhu năđ măb oăchoăviăkhu năcóă
đ ăćngănhấtăđ nh.ăThƠnhăt ăbƠoăc aămycobacteria lƠăcấuătrúcăph́căṭpănhấtăđ ợcăbi tă
̉ăprokaryote,ăcóăm tăs ăthƠnhăph năhóaăh căvƠăliênăk tăchéoăbấtăth

ng,ăḿcăđ ăliênă

k tăgi aăpeptidoglucanẳăthƠnhăt ăbƠoăM. tuberculosis là 70 - 80%ătrongăkhiẳăviăkhu nă
E. coli là 20 - 30% [38]
- Ĺpă ngoƠiă đ ợcă ṭoănênă b̉iă s ă liênă k tă gi aă ćcă mycolică acidă vƠă ćcă chấtă
ph́căṭp,ăđơyălƠăĺpăṭoănênăđ cătínhăc aăviăkhu nălaoăvƠăcóăcấuătrúcăph́căṭpălƠmă
tĕngăkh ănĕngăch ngăthấmăn ́căc aăthƠnhăt ăbƠoăviăkhu năgiúpătr căkhu năt năṭiă
lơuăv́iămôiătr

ngăbênăngoƠi,ăch ngăkh ănĕngăb ăh yădi tăb̉i đ̣iăth căbƠoăvƠăćcăt ă

bƠoămi năd chă[38].
- Ĺpăv ăngoƠiăcùngăcóăvaiătròărấtăquanătr ng,ăcóăcấuătrúcăpeptidoglyolipid.ă
Nóă đ mă b oă choă s ă t nă ṭiă c aătr că khu n,ă lƠmă choă tr căkhu năbềnă v ngă v́iă hi nă
t ợngăth căbƠo,ăgiúpăb oăv ăkh iắpăsuấtăth măthấuănênă khiăvƠoăc ăthểătr căkhu nă
khóăbiătiêuădi t.

7


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.3. C u t o thƠnh t bƠo c a M. tuberculosis

( cell.htm)

1.3.2. C ch gơy b nh
Viă khu nă laoă cóă thểă xơmă nh pă vƠoă c ă thểă quaă nhiềuă conă đ
th

ngălƠăđ

t̉năth

ngăhôăhấp,ăhoặcăcóăthểăquaăđ

ngătiêuăhóa,ăda,ăk tăṃcămắt.ăSauăkhiăgơyă

ngătiênăph́t,ăviăkhu nălaoăcóăthểătheoăđ

đ năgơyăt̉năth
nh ngăth

ngă kh́că nhau:ă

ngăḅchăhuy tăhoặcăđ

ngăth́ăph́tẳăćcăc ăquanăkh́c:ăPh̉i,ăth n,ă mƠngănưo,ăx

ngăḿuăđểă
ng,ăḥchă

ngăb ăh năc ălƠăđỉnhăph̉i,ăn iăcóắpăsuấtăoxyălƠă1β0ămmHgăv̀ăđơyălƠăđiềuă

ki năhọtăđ ngăt tăchoăviăkhu nălao.ăĐ căl căc aăviăkhu nălaoăcóăliênăquanăđ nă“Cord
factor”ă(trehaloseă- 6,6’- dimycolate)ălƠăchấtăgơyắcăch ăhọtăđ ngăc aăt ăbƠoăḅchăc u,ă
gơyănênănh ngăuăḥtăṃn tính [7].
Khiăviăkhu nălaoăxơmănh păvƠoăc ăthể,ătrongăc ăthểăxuấtăhi năđ́pắngămi năd chă
quaătrungăgianăt ăbƠo.ă LúcănƠy,ăđ̣iăth căbƠo,ăćcăt ăbƠoălymphoăT,ălymphoăBăvƠăćcă
nguyênăbƠoăsợiăk tăt păḷiăṭoăćcăuăḥt,ăv́iăćcăt ăbƠoălymphoăvơyăquanhăđ̣iăth căbƠo.ă
Ch́cănĕngăc aăćcăuăḥtăkhôngăchỉăngĕnăc năs ălanăt aăc aăt ăbƠo M. tuberculosis mà
cònăṭoămôiătr

ngăṭiăch ăchoăćcăt ăbƠoăc aăh ămi năd chătraoăđ̉iăthôngătină[23]. Bên

trongă ćcă uă ḥt,ă t ă bƠoă lymphoă Tă ti tă raă ćcă cytokine,ă nh ă ă interferon,ă họtă hóaă đ̣i

8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

th căbƠoăkhi năchúngădi tăkhu năt tăh n.ăT ăbƠoălymphoăTăcũngătiêuădi tătr căti păćcă
t ăbƠoăb ănhi m.ăNh ngăđiềuăquanătr ngălƠăviăkhu năkhôngăb ăuăḥtălọiătr ăhoƠnătoƠnă
mƠătr̉ănênăbấtăhọtăṭoăḍngănhi măkhu nă“tiềmă n”ă(latentătuberculosis)ă[18].
1.3.3. Đặc điểm h gen
ToƠnăb ăh ăgenăc aăviăkhu nălaoăM. tuberculosis ch ngăHγ7Rvăđ ợcăgi iătr̀nhă
t ,ă phơnă tích vƠă côngă b ă nĕmă 1998ă g m 4.411.5β9ă bp,ă v́iă đặcă tínhă lƠă ch́aă nhiềuă
guanineăvƠăcystosineă(Gă+ăCăkho ngă65ă%).ăTrênă90%ătr̀nhăt ăđ ợcăd ăđónălƠăcóămưă
hóaă choă proteină vƠă chỉă cóă 6ă genă gi ă (pseudogeneă - gen không mang thông tin di
truyềnămưăhóaăchoăprotein)ă[28, 38, 44].ăD ăli uăh ăgenăc aăm tăs ăviăkhu năthu căchiă
Mycobacterium,ă tr ́că h tă lƠă c aă viă khu nă laoă (M. tuberculosis)ă vƠă viă khu n phong

(M. leprae) có t măquanătr ngăđặcăbi tătrongănghiênăćuăđặcăđiểmăsinhăh căphơnătửă
h ătrợăd chăt ăh c,ădiătruyềnăh căvƠănghiênăćuăkh́ngăthu c,ăs ăli uăđưăđ ợcăl uăgi ă
ṭiăm tăs ătrungătơmăvƠăcóăthểăsửăd ngăm tăs ăch

ngătr̀nhăđểătruyăc păkh́măph́ăvƠă

sửăd ngă[11, 53].
1.4.ăC ăCH ăKHÁNGăTHU C ăVIăKHU NăLAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều tr lao
Thu căch ngălaoăcóănhiềuălọi,ăvƠăt́căd ngăc aăchúngălênătr căkhu nălaoăcũngă
khôngăgi ngănhau.ăHi nănayăng

iătaăchiaăthu căch ngălaoălƠmăhaiălọi:ă(1)ăĆcăthu că

ch ngălaoăch ăy u:ăg mănĕmăthu căch ăy uăđóălƠ:ăisoniazidă(INH),ărifampicină(RMP),ă
ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycină(SM).ăĐơyălƠănh ngăthu căkh́ngă
laoăhi uăqu ăvƠăcũngăítăđ cătínhănhất.ă(β)ăĆcăthu căch ngălaoăth́ăy u:ălƠănh ngăthu că
ch ngă laoă cóă t́că d ngă kémă h năvƠă cóă đ că tínhă cao,ă khôngă đ ợcădùngă trongă ph́că đ ă
điềuătr ălaoănh ngăḷiăđ ợcădùngătrongăćcătr

ngăhợpăđiềuătr ăthấtăḅiădoăviăkhu nălaoă

kh́ngă ḷiă ćcă lọiă thu că ch ngă laoă lọiă m t.ă Ćcă thu că nƠyă g mă có:ă ethionamide,ă
prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin,
thiacetazone, ofloxacin, các quinoloneầ

9


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Ćcă thu că isoniazid,ă cycloserine,ă kanamycină cóă t́că d ngă ́că ch ă t̉ngă v́chă t ă
bƠo.ă Ćcă thu că streptomycin,ă kanamycin,ă capreomycină cóă t́că d ngă ́că ch ă t̉ngă hợpă
protein.ă Ćcă thu că rifampicină vƠă ethambutolă cóă t́că d ngă ́că ch ă s ă t̉ngă hợpă nucleică
acid.ăThu căparaminosalicylicăacidăcóăt́căd ngăch ngăchuyểnăhóaă[7, 35, 37, 38].
1.4.2. Nguyên nhơn gơy kháng thu c
Viăkhu nălaoăkh́ngăthu călƠăkhiăchúngăkhôngăch uăs ăt́căđ ngăc aăćcălọiăkh́ngă
sinhă dùngă điềuă tr ă chúng.ă Th
tr

ngă nóiă t́iă viă khu nă laoă kh́ngă thu că lƠă nóiă t́iă nh ngă

ngă hợpă viă khu nă laoă kh́ngă v́iă m tă trongă nh ngă thu că ch ngă laoă dòngă th́ă nhất:ă

isoniazid,ărifampicin,ăpyrazinamide,ăethambutolăhoặcăstreptomycină[7, 35]
Tínhăkh́ngăthu căbaoăg măch ăy uăγănguyênănhơnăchính:
-

Thu căhoặcăćcăgenăđíchăb ălƠmăbi năđ̉iătrongăćcăch ng kh́ngăthu cădoăđó
ćcăthu căkhôngăcònăt́căd ngăn aătrongăvi cătiêuădi tăviăkhu n.

-

S năph măc aăgen,ămƠăhọtătínhăc aănóăb ắcăch ăb̉iăthu căđ ợcăviăkhu nă
s năxuấtăth aăra,ădoăđóăl ợngăthu cămƠăb nhănhơnău ngăvƠoăkhôngăđ ăđểắcă
ch ăhoƠnătoƠnăviăkhu nălao.

-

Nh ngăthayăđ̉iăx y raẳăḿcăđ ăphơnătửăvƠăc ăch ăxơmănh păc aăthu căvƠoă
bênătrongăt ăbƠoăviăkhu nălƠmăchoăn ngăđ ăthu căbênătrongăt ăbƠoăkhôngăđ̣tă
t́iăn ngăđ ăt iăthiểuăcóăkh ănĕngăgi tăch tăviăkhu năgơyăb nh.

Hi năt ợngăkh́ngăthu căc aăviăkhu nălaoăcóăthể x yăraătr ́căkhiăxơmănh pă(tiênă
ph́t)ăhoặcăsauăkhiănh păvƠoăc ăthểăng

iăb nhă(th́ăph́t).ăViăkhu nălaoăkh́ngăthu cătiênă

ph́tălƠăhi năt ợngălơyănhi măb̉iăm tăch ngăđưăkh́ngăthu cămƠăviăkhu nănƠyăđưăcóăs ăđềă
kh́ngăt ănhiên.ăV̀ăv y,ăb nhănhơnămắcălaoădoăs ălơyănhi mănƠy,ăngayăt ăđ uăviăkhu nă
laoă xơmă nh pă vƠoă c ă thểă đưă cóă s ă đềă kh́ngă v́iă thu că đangă sửă d ng.ă Cònă hi nă t ợngă
kh́ngăthu căth́ăph́tăx yăraăđ iăv́iăćcăch ngăviăkhu nălaoẳăb nhănhơnănƠoăđóădùngă

10


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thu căch ngălaoăkhôngăđúngăquyăđ nh,ăkhôngăđúngăliềuăl ợng,ăth iăgianăsửăd ngăthu c
doăđóăđưăch năl căviăkhu nălaoăkhangăthu că[1, 38].
Ćcăch ngăviălaoăkh́ngăthu căđ ợcăchiaălƠmăhaiălọi:ă(1)ăĆcăch ngălaoăkh́ngă
đaăthu că(MDRăậ TB):ăLƠătr

ngăhợpăkhiăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăđ ngăth iăhaiă

thu că ch ngă laoă ṃnhă nhấtă hi nă nayă lƠă isoniazidă vƠă rifampicin.ă (β)ă Ćcă ch ngă laoă

kh́ngă thu că ph̉ă r ngă (XDRă ậ TB):ă LƠă tr

ngă hợpă khiă viă khu nă laoă đưă ̉ă t̀nhă tṛngă

kh́ngă đaă thu că vƠă cóă thêmă tínhă kh́ngă m tă trongă baă lọiă thu că ch ngă laoă lƠă
capreomycin, kanamycin, amikacin [49].
NgƠyănayăkhiănghiênăćuăvềăsinhăh căphơnătử,ăng
kh́ngăḷiănhiềuălọiăkh́ngăsinhăcóăliênăquanăđ năćcăgenăt

iătaăđưăx́căđ nhăđ ợcăc ăch ă
ngắng.ăTrong hình 1.4 mô

t ăćcăc ăch ăphơnătửăc aăhi năt ợngăkh́ngăđaăthu cẳăviăkhu nălao.ăTrongăđó, kháng
isoniazid đ ợcă choă lƠă liênă quană đ nă ćcă gen:ă KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng
streptomycin cóăthểălƠădoăđ tăbi nẳăgenărpsL. Kháng pyrazinamid cóăthểăliênăquanăđ nă
gen pncA. Kh́ngăquinoloneăcóăthểăliênăquanăt́iăgenăgyrA. Kháng rifampicin đ ợcăx́că
đ nhălƠăliênăquanăđ năđ tăbi nẳăvùngăg nălõiăc aăgenărpoB,ăgenămưăhóaătiểuăph nă ăc aă
RNA polymerase [7, 25]. Trong lu năvĕn này, chúng tôi t pătrungănghiênăćuăc ăch ă
kh́ngăđaăthu c,ăt́călƠătr

ng hợpăviăkhu nălaoă kh́ngăđ ngăth iăhaiăthu căch ngălaoă

ṃnhănhấtăhi nănayălƠăisoniazid và rifampicin,ăđiềuăđóăđ ngănghƿaăv́iăvi cănghiênăćuă
các đ tăbi nătrên gen rpoB v́iăkatG.

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.4. C ch kháng đa thu c c a vi khu n lao
( />
1.4.3. Rifampicin vƠ c ch kháng
Rifampicin tênă khoaă h că lƠă γă ậ[[(4 ậ methyl ậ 1 ậ pipeainyl) imino] methyl]
(hình 1.5A). Rifampicină lƠă d nă xuấtă b́nă t̉ngă hợpă t ă rifampicină B,ă m tă kh́ngă sinhă
đ ợcă chi tă xuấtă t ă nấmă Streptomyces mediterranei, là thu că cóă họtă tínhă di tă khu nă
ṃnh,ăti tăkhu n,ăthu cădi tăviăkhu nălaoătrongăvƠăngoƠiăt ăbƠo.ăRifampicinăkhôngăcóă
hi nă t ợngă kh́ngă thu că chéoă v́iă ćcă lọiă thu că ch aă laoă kh́c.ă N ngă đ ă ́că ch ă t iă
thiểuă(minimum inhibitory concentration - MIC)ăđ iăv́iăviăkhu n là 5 - 200 ng/ml (in
vitro).ăĐơyălƠăthu cắcăch ăRNAăpolymeraseăṃnhănhấtă[29, 48].

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

A

B

Hình 1.5. Công th c c u t o c a rifampicin (A) vƠ isoniazid (B) [48]

C ă ch ă t́că đ ngă c aă rifampicină liênă quană đ nă kh ă nĕngă ́că ch ă họtă đ ngă
c aăRNAăpolymerase.ăEnzymeă nƠyă lƠă m tă ph́căhợpăoligomerăg mă b nă tiểuă đ nă
v ă kh́că nhauă (α,ă ,ă ’,ă ω),ă vƠă đ ợcă mưă hóaă t

ngă ́ngă b̉iă ćcă genă rpoA,ă rpoB,ă

rpoC, rpoD [7, 20].
Khi rifampicin gắnăv́iătiểuăđ năv ă ăc aăRNAăpolymeraseă(rpoB),ălƠmắcăch ă
ćcăhọtăđ ngăsaoăchépăṭoăraăćcămRNAăc aăviăkhu nălaoăvƠădoăđóălƠmăng ngătr ăćcă
họtăđ ngăs ngăc aăviăkhu nălao.ăĐơyălƠăc ăch ăc ăch ăt́căd ngăc aăRMPăđ iăv́iăviă
khu nălao (hình 1.6).

Hình 1.6. C u trúc tinh thể liên k t gi a rifampicin và RNA polymerase [20]

13


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Gen rpoB cóăkíchăth ́căγ519ăbp,ămưăhóaăchoătiểuăph nă ăc aăRNAăpolymeraseă
(Tuberculosis,ăβ007).ăNh ngăđ tăbi năkh́ngăkh́ngăsinhărifampicinăth

ngăx yăraătrênă

đọnăgenărpoB,ănhấtălƠăđọnănằmăg nătrungătơmăc aăgenădƠiă81ăbp đ ợcăgíiăḥnăt ăb ă
baă507ăđ nă5γγ,ăng

iătaăg iăđơyălƠăvùngă“nóng”ă ậ “hot-spotăregion”ă(hình 1.7).ăĐ tă

bi nẳăb ăbaăth́ă5β6,ă516,ă5γ1,ăchoăk tăqu ăđềăkh́ngăv́iărifampicinăcao;ăđ tăbi nẳăb ă
ba 510, 515 vƠă51βăth̀ăchoăkh ănĕngăkh́ngărifampicinẳăḿcăđ ăthấpăh nă[47].ăĐọn
nucleotide c aăvùngănóngăg m:ă

507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC
CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
M iănucleotideătrênăđọnănƠyăcóăthểăb ăthayăth ,ăhónăđ̉iăv ătrí,ămấtăđi,ăthêmăvƠoă
đểăṭoăraăćcăđ tăbi năđ ợcăthểăhi nătrên hình 1.7 nh ăsau:ă[41].

Hình 1.7. Trình t nucleotide vƠ các v trí có kh̉ năng x̉y ra đột bi n trên đo n ắnóngẰ
c a gen rpoB [41]

- Khiăx yăraă đ tăbi nă g năvùngălõiăc aăgenă rpoB s ălƠmăthayăđ̉iăcấuătrúcătiểuă
ph nă ăc aăRNAăpolymeraseămƠănóămưăhóaănênălƠmăchoăkh ănĕngăk tăhợpăc aăRMPă
v́iătiểuăph nănƠyăgi măđi.ăK tăqu ălƠăt́căd ngăc aărifampicin đ iăv́iăviăkhu nălaoăgi mă

14


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

hoặcămấtăđi.ăNh ăv yăđ tăbi nătrênăvùngăgenănƠyăc aărpoB đưălƠmăchoăviăkhu nălaoătr̉
nênăkh́ngăthu căv́iărifampicin.
- 90 - 95ă%ăćcăch ngăM. tuberculosis kháng rifampicin đ ợcăx́căđ nhălƠădoăćcă
đ tă bi nă trênă vùngă genă nóng 81ă bpă nƠyă c aă rpoB.ă Nh ă v yă cònă 5ă - 10ă %ă ćcă ch ngă viă
khu nălaoăkhôngăcóăđ tăbi nătrênăvùngănƠyăc aăgen rpoB.ăĐiềuănƠyăchoăthấyăc năph iăx́că
đ nhăthêmănh ngăđ tăbi năkh́cătrênăgenănƠyăhoặcănh ngăgenăkh́căcóăliênăquanăđểăx́căđ nhă
chínhăx́căvƠătoƠnăb ăc ăch ăkh́ngărifampicin c aăviăkhu nălao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid vƠ c ch kháng
Isoniazidăcóătênăkhoaăh călƠăisonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thu că
ch ngă laoă đặcă hi uă cao,ă cóă t́că d ngă ch ngă ḷiă M. tuberculosis vƠă ćcă lọiă
Mycobacterium khôngăđiểnăh̀nhăkh́cănh ăM. bovis, M. kansasii.ăIsoniazidădi tăkhu nă

ph ăthu căvƠoăn ngăđ ăthu cẳăv ătríăt̉năth

ngăvƠăḿcăđ ănḥyăc măc aăviăkhu n.ăC ă

ch ă t́că d ngă c aă isoniazidă cóă liênă quană t́iă s ă h̀nhă thƠnhă ph́că h ă acylă isonicotinicNADHă vƠă nh ă đưă tr̀nhă bƠyă ̉ă trênă chúngă ́că ch ă s ă t̉ngă hợpă acidă mycolică c nă choă
thƠnhăt ăbƠoăviăkhu nălao.
Gen katG cóă kíchă th ́că βββγă bp mã hóa catalase ậ peroxidase. Enzyme này
họtăhóaăINHăbằngăćchăk tăhợpăacylăisonicotinicăv́iăNADHăđểăṭoăthƠnhăph́căh ăacylă
isonicotinic-NADH.ăPh́căh ănƠyăliênăk tăchặtăch ăv́iăketoenoylreductaseă(mưăhóaăb̉iă
gen InhA),ătheoăđóălƠmăngĕnăc năs ăh̀nhăthƠnhăc ăchấtăenoyl-AcpMăvƠăhọtăđ ngăt̉ngă
hợpăacidăbéo.ăQúătr̀nhănƠyălƠmắcăch ăs ăt̉ngăhợpăacidămycolicăc năchoăthƠnhăt ăbƠoă
viăkhu nălao.ă

15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.8. C ch kháng INH

vi khu n lao

( />
C ă ch ă phơnă tửă c aă tínhă kh́ngă INHă ch ă y uă cóă liênă quană t́iă đ tă bi nă thêmă
đọn/mấtă đọnă hoặcă ćcă đ tă bi nă nh mă nghƿa/vôă nghƿa,ă trongă đóă ch ă y uă di nă raă ṭiă
codon 315 (Ser  Thr)ăc aăgenăkatG mã hóa catalase peroxidase [26]. N uăcóăs ăbi nă
ḍngăhayăđ tăbi nẳăbaseăth́ăβăṭiăcodonăγ15ăc aăgenăkatG (AGCăbi năđ̉iăthƠnhăACCă
hayăACA)ăs ăd năđ nălƠmăgi măhoặcămấtăhoƠnătoƠnăhọtătínhăc aăcatalaseăperoxidase,ă

doăđóăM. tuberculosis s ătr̉ăthƠnhăkh́ngăthu căINH (hình 1.8) [14].ăDoăđóăph́tăhi năs ă
thayă đ̉iă diă truyềnă nƠyă trongă genă katG cóă thểă cungă cấpă m tă ph

ngă ph́p sƠngă l că

nhanhăvƠăchínhăx́căchoăvi căph́tăhi năćcăch ngăM. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5.ăCÁCăPH

NGăPHÁPăCH NăĐOÁNăLAOăKHÁNGăTHU Că

1.5.1. Đặc điểm lơm sƠng và các xét nghi m c n lơm sƠng
*) Đặc điểm lâm sàng
Nh̀năchungăćcădấuăhi uălơmăsƠngăc aăb nhălaoăcóăviăkhu năkh́ngăthu căkhôngă
kh́cănhiềuăv́iăb nhălaoămƠăviăkhu nănḥyăc măv́iăthu c.

16


Luận văn thạc sĩ
Tr

Nguyễn Văn Bắc

ngăhợpănhi măviăkhu nălaoăkh́ngăthu cătiênăph́tăcóăthểăcóătri uăch́ngăcấpă

tính h n,ăs tăcaoăh n.
Đ iăv́iăkh́ngăthu cămắcăph iăph năĺnăgặpẳănh ngăb nhănhơnălaoă ṃn tính,
đ ợcăđiềuă tr ă ítănhấtă βă l n.ă Nh ngă b nhă nhơnă nƠyă cũngă chi mă tỷă l ă ch ă y uă trongă s ă
b nhănhơnă laoăkh́ngăđaăthu c.ăH uăh tăb nhălaoăkh́ngă đaăthu căb nhăti nătriển,ăhay
gặpădòăph ăqu năậ mƠngăph̉iămƠăđiềuătr ăgặpănhiềuăkhóăkhĕn [7].

*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin:ăth

ngăth̀ăph nắngădaẳănh ngăb nhănhơnăkh́ngăthu cătiênă

ph́tăcóăḿcăđ ăṃnhăh năsoăv́iănh ngăb nhănhơnăcóăviăkhu nănḥyăc măv́iăthu c.ă
Đ iă v́i kh́ngă thu că mắcă ph i,ă đặcă bi tă lƠă kh́ngă đaă thu că ̉ă b nhă nhơnă đ ngă nhi mă
HIVă(+)ăth̀ătỷăl ăph nắngănƠyăơmătínhăkh́ăcao.
- H̀nhă nhăXăQuang:ăkhiăch păph̉iăthẳng,ăk tăqu ăchoăthấyăh̀nhă nhă vềăb nhălaoă
ph̉iă gi aă tr

ngă hợpă laoă kh́ngă thu că tiênă ph́tă v́iă tr

ngă hợpă nḥyă c mă v́iă

thu căkhôngăcóăs ăkh́căbi t.ăNh ngănh ngătr

ngăhợpăkh́ngăthu cămắcăph iăth̀ă

gặpănhiềuălƠăthểăx ăhang,ădi nătíchăph̉iăt̉năth

ngănhiềuăh năvƠăcóănhiềuăhang,ă

kíchăth ́căc aăhangăĺnăh n.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ăVềăh̀nhăthể:ăćcăviăkhu n b̀nhăth

ngăcóăcấuăṭoăthƠnhăt ăbƠoăγăĺpănh ngẳă

viăkhu năkh́ngăthu căthƠnhăt ăbƠoăcóăcấuăṭpă4ăĺpă(viăkhu năcóăthêm m tăĺpă

peptidoglycolipidẳăngoƠiăcùng).ăViăkhu năkh́ngăv́iărifampicinăcóăthƠnhăt ă
bƠoă cũngă dƠyă h nă hẳnă soă v́iă viă khu nă nḥyă v́iă thu c.ă Khu nă ḷcă c aă viă
khu năkh́ngăthu căcóăthểăkhôngăđiểnăh̀nhăkhiănuôiăcấy,ăm căcằnăc iă[7]
+ăVềăs ăl ợngăviăkhu năkhiăsoiăkínhăvƠănuôiăcấy:ănh ngăb nhănhơnăkh́ngăthu că
th́ăph́tăcóăs ăl ợngăviăkhu năkhiăsoiăkínhăcaoăh nănhiềuăsoăv́iăb nhănhơnă
thôngăth

ng.ăKhôngăcóăs ăkh́cănhauănhiềuăgi aăb nhănhơnăkh́ngăthu cătiênă

ph́tăvƠăb nhănhơnăthôngăth

ng.ăKhiănuôiăcấyătrênămôiătr

ngăđặcăs ăkhu nă

ḷcă m că ̉ă b nhă nhơnă kh́ngă thu că mắcă ph iă lƠă caoă h nă vƠă th iă giană m că

17


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

nhanhăh năsoăv́iăkh́ngăthu cătiênăph́tăvƠẳănh ngăb nhănhơnănƠyăs ăkhu nă
ḷcăḷiăcaoăh nẳăb nhănhơnăthôngăth

ngă[7].

+ăVềăđặcăđiểmăkh́ngă sinhăđ :ăkh́ngăthu cătiênăph́tăth

v́iăn ngăđ ăthấp,ăkh́ngăthu cămắcăph iăth

ngăkh́ngăhayăkh́ngă

ngăkh́ngăv́iăn ngăđ ăcaoăh n.ă

Kh́ngăthu cătiênăph́tăhayăgặpăv́iăm tăthu c,ăkh́ngăthu căth́ăph́tăth

ngătỷă

l ăkh́ngăcùngălúcăv́iănhiềuăthu căcaoăh nă[7].
Nh ă v yă khôngă thểă d aă vƠoă lơmă sƠngă hayă th iă giană điềuă tr ă hi uă qu ă đểă ch nă
đónăb nhănhơnălaoăkh́ngăthu căđ ợc.ăĆcăxétănghi măc nălơmăsƠngăkh́căchỉăcóăgíătr ă
gợiăỦ.ăCh năđónăb nhălaoăkh́ngăthu căhi nă nayă v năph iă lấyăk tăqu ăkh́ngăsinhăđ ă
lƠmătiêuăchu n.
1.5.2. Xác đ nh kiểu hình
G mă ćcă ph

ngă ph́pă sau:ă Ph

ngă ph́pă x́că đ nhă t

ngă quan,ă ph

ngă ph́pă

x́căđ nhătỷăl ăkh́ng,ăph

ngăph́păđoămƠu,ăph

pháp khác [13].ăĆcăph

ngăph́pănƠyăđềuăx́căđ nhăkh ănĕngăph́tătriểnăc aăviăkhu nă

laoătrongămôiătr

ngăph́păkhửănitrateăvƠănhiềuăph

ng

ngănuôiăcấyăcóăkh́ngăsinh,ăt ăđóăđ aăraăk tălu năvềăkh ănĕngăkh́ngă

thu căc aăch ngăviăkhu nălaoăđangănghiênăćuă[12].ăNh ợc điểmăc aăćcăph
này là viă khu nă laoă m că ch m,ă trênă môiă tr
tu n.ăSửăd ngăh ăth ngămôiătr

ngă Lowenstein-Jensenă th

ngăph́pă

ngă mấtă 4-6

ngăl ngăđ ợcăc iăti nănh MGIT,ăBATECăcũngămấtăβă

tu n. ĐiềuănƠyălƠmăchoăcôngăt́căđiềuătr ăvƠăkiểmăsótăt̀nhăh̀nhăb nhălaoăcũngănh ăb nhă
laoăkh́ngăthu c cònăkhóăkhĕn.
1.5.3. Xác đ nh kiểu gen
Hi nănayăcóănhiềuăph

ngăph́păx́căđ nhăkiểuăgenăđ ợcắngăd ngăđểăch năđónă

viăkhu nălaoăkh́ngăthu că[1, 4],ăgi iătr̀nhăt ăgenă[6], laiătrênăphaărắnă[γ6], Real ậ time
PCR [14]
Ćcăph

ngăph́păch năđónăx́căđ nhăkiểuăgenăd aătrênăc ăs̉ăph́tăhi năđ tăbi nă

̉ăćcăgenăcóăliênăquanăt́iătínhăkh́ngăthu căt

18

ngắngă[51],ăsửăd ng ćcăkỹăthu tăcao,ă


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

đòiăh iăthi tăb ăhi năđ̣i,ăt năkémăvƠăc nănhơnăl căcóătr̀nhăđ ăchuyênăsơuănh ngăth iă
gianăch năđónăbằngăph

ngăph́pănƠyănhanhăh n,ăcóăđ ănḥyăvƠăđ ăđặcăhi uăcao.

Đểăx́căđ nhăđ tăbi nătrênăgenăcóăliênăquanăt́iăkh́ngăthu că(genărpoB và katG)
hi nănayăgi iătr̀nhăt ăgenăv nălƠăph

ngăph́păx́căđ nhăc ăb n,ăchínhăx́cănhấtăvƠăth iă

gianăchoăk tăqu ăt ăγă- 5ăngƠy.ăSauăkhiăgi iătr̀nhăt ăđọnăgenăv aăđ ợcăt́chădòngăt ă
ch ngălaoănghiênăćuătaăs ăsoăśnhătr tăt ăsắpăx păćcănucleotideẳăm uăthíănghi măv́iă

tr tăt ănucleotideăchu năđểăbi tăđ ợcăćcăv ătríăsaiăl chă[22, 16].
Vi că x́că đ nhă các đ tă bi nă có liên quan kh́ngă thu că rifampicin và isoniazid
bằngă kỹă thu tă gi iă tr̀nhă t ă choă bi tă chínhă x́că v ă tríă đ tă bi nă cũă vƠă ḿiă trênă genă c nă
nghiênăću,ămangăḷiăhiểuăbi tăsơuăsắcăvềăs ăđaăḍngăc aăcấuătrúcăqu năthểăviăkhu nălaoă
̉ăb nhănhơnălaoăkh́ngăthu c,ăđ́nhăgíăđ ợcătỷăl ăđ tăbi năliênăquanăkh́ngăthu cătrênă
ćcăch ngălaoăphơnăl păt ăćcăvùngăđ aălỦăkh́cănhau.ăQuaăđó lƠmătiềnăđềăxơyăd ngăm tă
s ă b ă kit real-timeă PCR,ă nhằmă ph́tă hi nă nhanhă viă khu nă laoă kh́ngă rifampicin và
isoniazidăṭiăVi tăNam.
1.5.4. K thu t real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCRălƠăkỹăthu tăPCRămƠăk tăqu ăkhu chăđ̣iăDNAăđíchăhiểnăth ăđ ợcă
ngayăsauăm iăchuăkỳănhi tăc aăph nắng,ădoăđặcăđiểmănƠyănênăv́iăreal-timeăPCRăng

iă

lƠmăthíănghi măkhôngăc năthi tăph iălƠmăti păćcăb ́căthíănghi măđểăđ căvƠăphơnătíchă
k tăqu ăđểăx́căđ nhăcóăs năph măkhu chăđ̣iăđíchăhayăkhôngăv̀ăk tăqu ăcu iăcùngăc aă
ph nắngăkhu chăđ̣iăcũngăđ ợcăhiểnăth ăngayă sauăkhiăhoƠnătấtăph nắngăkhu chăđ̣i.ă
Nh ă v y,ă nênă cóă thể nói real-timeă PCRă lƠă kỹă thu tă nhơnă b nă DNAă đíchă trongă ngă
nghi măthƠnhăhƠngătỷă b năsaoăd aăvƠoăćcăchuăkỳănhi tăvƠăk tăqu ăkhu chăđ̣iătrongă
ngăph nắngăđ ợcăhiểnăth ăcùngălúcăv́iăph nắngăkhu chăđ̣iăx yăraăđểăng

iălƠmăthíă

nghi măcóăthểăthấyăđ ợc.
Chìa khóaăc aăkỹăthu tăreal-timeăPCRăchínhălƠăhóaăchấtăvƠăthu căthửăcóătrongă
ph nắng,ătrongăđó chấtăhuỳnhăquangăđ ợcăthêmăvƠoăh năhợp ph nắng là y uăt ăđ uă

19