Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng tích lũy solasodine ở tế bào in vitro của cây cà gai leo (TT)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR
LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE
Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016


Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa
học, Đại học Huế và Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài
nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014).
Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
PGS.TS. Cao Đăng Nguyên

Phản biện 1: ............................................................................................................
............................................................................................................
Phản biện 2: ............................................................................................................
............................................................................................................
Phản biện 3: ............................................................................................................
............................................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp

tại:
................................................................................................................................
Vào hồi ............ giờ ........ ngày ....... tháng .......... năm ..........................................
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường đại học Khoa học, Đại học
Huế


MỞ ĐẦU
T n cấp t iết c a đề t i
Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam
tiêu thụ từ 30 - 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong
y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu .
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) có tên khoa học
khác là Solanum procumben Lour. thuộc họ Cà (Solanaceae). Trong
thành phần h a học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, c
hoạt t nh kháng vi m và ảo vệ gan, chống ại tế ào ung thư. Ngoài
ra solasodine đã được nghiên cứu cho thấy có nhiều tác dụng trong y
dược. Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai eo được khai thác chủ yếu
từ nguồn hoang dại, nguồn nguyên liệu này không đủ để đáp ứng cho
việc nghiên cứu và điều trị.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là phương pháp có những ưu
điểm vượt trội mở ra tiềm năng ớn để tăng thu sinh khối trong thời
gian ngắn, hàm ượng hợp chất thứ cấp cao, chủ động dễ điều khiển
quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các
hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết
những kh khăn n i tr n.
Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp,
bổ sung vào môi trường nuôi cấy à phương thức để thu được các sản
phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất,
vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao.

uất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh
ưởng c a một số elicitor lên khả năng t c lũy solasodine ở tế
bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).

p

dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu
cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên

1


cho các nghiên cứu trong ĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ
àm cơ sở cho việc xây dựng

qui trình sản xuất solasodine từ sinh

khối tế ào để ứng dụng trong ĩnh vực dược phẩm sau này.
M c tiêu c a đề t i
Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi
cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).
ng a

oa ọc v t

c tiễn
: Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung

cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng t ch ũy
solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các

elicitor. Đồng thời luận án cũng à tài iệu tham khảo hữu ích cho
nghiên cứu và giảng dạy về ĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học
bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật.
: Đề tài à hướng nghiên cứu có tiềm năng
ứng dụng trong ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng àm dược
liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ và chăm
sóc sức khỏe cộng đồng.
N

ng đ ng g p

i c a lu n n

Đây à công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh
hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine
trong nuôi cấy tế bào cà gai leo. Kết quả của luận án à đáng tin cậy
và có thể sử dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất
solasodine ở quy mô lớn hơn.
P ạ

vi ng iên cứu
Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro

tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguy n, Môi trường
và Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng
11 năm 2014.

2

C ương 1.
T NG QUAN T I LIỆU
1.1. SẢN
TẾ

UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NU I CẤY

O THỰC VẬT
Nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các

hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương iệu và màu nhuộm mà
không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp
bằng phương pháp h a học. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết
một tỷ lệ lớn ượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy.
Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một ượng nhỏ
(nhỏ hơn 1% trọng ượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và
phát triển của thực vật. Mặc dù hợp chất thứ cấp dường như không
được thừa nhận vai trò trong việc duy trì quá trình sống cơ ản của
thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng
trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường.
1. . ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ
NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY
TẾ

O THỰC VẬT
Elicitor thực vật có thể được định nghĩa như à một chất cơ

bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì
khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Sự

cảm ứng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng
hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm ượng của
elicitor. Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các
chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor

3


nội sinh). Tr n cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân
thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.
Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên cứu cải
thiện khả năng t ch ũy các hợp chất thứ cấp khi nuôi cấy tế bào mới
được quan tâm trong thời gian gần đây. Trên thế giới cho đến nay đã
có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của elicitor lên sự
sinh trưởng và khả năng t ch ũy hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào
thực vật. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy hàm ượng hợp chất thứ
cấp tăng n khi ổ sung elicitor.
1. . C Y C GAI LEO
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà
(Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens, mọc
rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300
m. Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc
chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn,
đau ưng, cảm cúm… Gần đây, nhiều tác dụng khác của cà gai leo
được phát hiện như: kháng vi m, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát,
giảm nhẹ khối u.
Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ
Cà, nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại
hormon steroid khác nhau. Solasodine đã được báo cáo là có thể
chống ung thư, ức chế độc hại nhiều loài sinh vật. Solasodine

alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong
việc truyền xung động thần kinh. Gần đây, so asodine được biết như
một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư
da.

4


C ương
ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU
.1. ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU
Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in
vitro.
. . NỘI DUNG NGHI N CỨU
- ác định khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế
bào cà gai leo.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng
sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo:
+ Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250
µM SA)
+ Thời gian nuôi cấy: 7 tuần
+ Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày
- Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine
n khả năng ức chế co agenase.
- Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế
bào in vitro của cây cà gai leo.
. . PHƯ NG PH P NGHI N CỨU
. .1. P ương p

p nuôi cấy

ô v tế

ot

cv t

2.3.1.1. Nuôi cấy cây in vitro
2.3.1.2.

ấ

2.3.1.3

ấ

2.3.1.4. Xử lý cảm ứng t bào
Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men
(1-5 g/L), và salicylic acid (50-250 µM) ở dạng riêng rẽ hoặc phối
hợp các nồng độ tối ưu của chúng vào môi trường nuôi cấy tế bào với

5


thời điểm cảm ứng từ 7 đến 21 ngày sau khi nuôi cấy.
2 3 1 4 Xá định sinh khối t bào
. . . P ương p

p

a sin

2.3.2.1. Chi t Soxhlet
2.3.2.2. Sắc ký lỏng hiệ
2323
. . .

ă g cao

ức ch collagenase của solasodine
l số liệu
T

t t sơ đồ t

ng iệ

Cây cà gai leo in vitro
Nuôi cấy callus
Nhân callus
Nuôi cấy tế ào
ử ý các elicitor khác nhau
Thăm dò nồng độ elicitor
Thăm dò thời điểm ổ sung elicitor
Thu sinh khối tế ào
Tách chiết so asodine
Định ượng
Thử nghiệm hoạt t nh sinh học

6

C ương
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
.1. SINH TRƯỞNG V

TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ

BÀO CÀ GAI LEO
.1.1. Sin trưởng c a tế bào

Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo

.1. . T c lũy solasodine c a tế bào

Hình 3.2. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

7


3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR L N SINH TRƯỞNG VÀ
TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO
3.2.1. Ản
3.2.1.1. Nồ

ưởng c a methyl jasmonate
độ methyl jasmonate

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của MeJA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo
K ối lượng tế o (g)

Nồng độ MeJA
GI
(µM)
Tươi
Khô
25
3,89b
0,37b
1,30
d
bc
50
3,38
0,35
1,13
100
3,57c
0,34c
1,19
150
2,96e
0,36bc
0,99
f
bc
200
2,40
0,34
0,80
250

2,29g
0,35bc
0,76
a
a
ĐC
4,98
0,45
1,66
ĐC: Tế bào không xử lý elicitor. Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ
sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05
(Duncan's test). Chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng.

Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được phân t ch HPLC để khảo
sát ảnh hưởng của nồng độ MeJA (25-250 µM)

n t ch ũy

solasodine.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào
cà gai leo
Nồng độ MeJA (µM)
25
50
100
150
200
250
ĐC1
ĐC2

Solasodine (mg/g)
127,5c
159,0a
138,0b
98,0e
38,0f
36,5f
123,5d
23,5g

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy

8


Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM
MeJA

Hình 3.6. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
50 µM MeJA

3.2.1.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Dựa vào kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MeJA lên
khả năng t ch ũy so asodine trong tế bào cà gai leo, 50 µM MeJA
được chọn để khảo sát thời điểm cảm ứng trong nuôi cấy tế bào.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM

9

n sinh trưởng của


tế bào cà gai leo
Ngày cả
7
14
21
ĐC

ứng

K ối lượng tế
Tươi
3,39b
3,43b
3,71a
3,38b

o (g)
Khô
0,31b
0,33ab
0,34a
0,35a

GI
0,88

0,84
0,99
1,13

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch
ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

H

lượng ( g g)
108,5b
79,5c
74,5d
159,0a

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

3.2.2. Ản
3.2.2.1. Nồ

ưởng c a dịch chiết nấm men
độ dịch chi t nấm men

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

K ối lượng tế o (g)
Nồng độ YE
GI
(g/L)
Tươi
Khô
1
9,30a
0,54a
3,10
b
2
9,20
0,53a
3,07
3
8,80c
0,48b
2,93
d
c
4
8,08
0,43
2,69
5
7,94e
0,41c
2,65
ĐC

4,98f

0,45bc

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor

10

1,66


Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà
gai leo
Nồng độ YE (g L)

H

lượng ( g g)
125,5d
165,0c
220,5a
198,0b
112,0e
123,5d
23,5f

1
2
3

4
5
ĐC1
ĐC2

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor. ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm
tuổi
3.2.2.2. Thời gian nuôi cấy
Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung
vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát thời điểm t ch ũy
solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần.
Lượng sinh khối tế bào cũng như hàm ượng solasodine đều
tăng dần từ tuần thứ 1 và đạt cực đại vào tuần thứ 4.

Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE

11


Hình 3.9. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
3g/L YE

3.2.2.3. Thời đ ểm cảm ứng
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh
trưởng của tế bào cà gai leo
K ối lượng tế
T ời điể
(ng y)
Tươi
7

8,79a
14
8,41a
21
5,66b
ĐC
8,80a

o (g)
Khô
0,45a
0,36b
0,35b
0,48a

GI
2,93
2,80
1,89
2,93

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng
t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

H

lượng ( g g)
110,5b
96,0c
92,0d
220,5a

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

12


3.2.3. Ản

ưởng c a salicylic acid

3.2.3.1. Nồ

độ salicylic acid

SA ở các nồng độ từ 50-250 µM được bổ sung vào môi
trường lúc bắt đầu nuôi cấy để khảo sát khả năng sinh trưởng của tế
bào cà gai leo sau 4 tuần.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo
Nồng độ SA
(µM)
50
100

150
200
250
ĐC

K ối lượng tế
Tươi
12,03a
8,05b
7,61bc
5,99bc
5,21c
4,98c

o (g)
Khô
0,81a
0,68ab
0,64ab
0,53bc
0,51c
0,45c

GI
4,01
2,68
2,54
2,00
1,74
1,66

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào
cà gai leo
Nồng độ SA (µM/L)
50
100
150
200
250
ĐC1
ĐC2

H

lượng (mg/g)
133,5d
186,5b
245,0a
162,0c
51,0f
123,5e
23,5g

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp
solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE. Ở môi
trường có bổ sung 150 µM SA, ượng solasodine trong tế ào đạt cao
nhất (245 mg/g khối ượng khô), cao hơn khi xử ý 50 μM MeJA

khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần.
3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy

13


Hình 3.11. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA
150 µM.

Hình 3.12. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
150 µM SA.

3.2.3.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA
của tế bào cà gai leo
T ời điể
(ng y)
7
14
21
ĐC

K ối lượng tế
Tươi
8,12c
8,90b
9,13a
7,61d

o (g)

Khô
0,68b
0,69b
0,74a
0,68b

n sinh trưởng

GI
2,71
2,97
3,04
2,54

ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

14


Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng t ch
ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ngày)
7
14
21
ĐC

H

lượng (mg/g)

117,0b
101,5c
82,5d
245,0a

ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

3.2.4. Ản
3.2.4.1. Nồ

ưởng kết hợp c a các elcitor
độ các elicitor

3.2.4.1.1. Kết hợp hai elicitor
Chúng tôi chọn nồng độ thích hợp nhất của chất này kết hợp
với các nồng độ khác nhau của chất kia để tìm hiểu ảnh hưởng phối
hợp chúng

n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai

leo. Cụ thể như sau: 50 µM MeJA kết hợp với YE (1-5 g/L) hoặc SA
(50-250 µM); 3 g/L YE kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc SA
(50-250 µM); 150 µM SA kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc YE
(1-5 g/L). Các elicitor được bổ sung vào môi trường vào lúc bắt đầu
nuôi cấy.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor
ũy so asodine của tế bào cà gai leo
Elicitor
K ối lượng tế o (g)
SA

MeJA
YE
Tươi
Khô
(µM) (µM) (g/L)
50
2
4,56f
0,43e
d
50
50
5,17
0,42f
c
150
25
5,37
0,49b
a
150
3
7,74
0,47c
b
25
3
5,91
0,55a
4,98e

0,45d
ĐC

15

n sinh trưởng và tích

GI

Solasodine
(mg/g)

1,52
1,72
1,79
2,58
1,97
1,66

186,0b
165,5e
173,0c
197,5a
170,5d
123,5f


3.2.4.1.2. Kết hợp ba elicitor
Bảng 3.14. Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor
solasodine của tế bào cà gai leo

Nồng độ elicitor
K ối lượng tế
SA
MeJA YE
Tươi
(µM) (µM) (g/L)
150
50
5
4,82b
150
150
3
4,24c
100
50
3
4,05d
ĐC
4,98a

n sinh trưởng và t ch ũy

o (g)
Khô
0,31c
0,32c
0,39b
0,45a

GI

Solasodine
(mg/g)

1,61
1,41
1,35
1,66

153,0c
160,0b
180,5a
123,5b

3.2.4.2. Thời gian nuôi cấy
Nồng độ xử lý kết hợp của 2 chất SA 150 µM và YE 3 g/L
cho hàm ượng solasodine cao nhất đã được sử dụng để nghiên cứu.

Hình 3.15. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA
150 µM và YE 3 g/L

Hình 3.16. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
150 µM SA và 3 g/L YE

16


3.2.4.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến

khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo
K ối lượng tế
T ời điể
(ngày)
Tươi
7
14
21
ĐC

6,62b
5,35cd
5,13d
7,74a

o (g)
Khô
0,45ab
0,39b
0,32c
0,47a

GI
2,21
1,78
1,71
2,58

ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi
cấy.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến
khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

Solasodine (mg/g)
11,8b
51,0c
46,0d
197,5a

ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi
cấy

3.3. Khảo s t sơ ộ hoạt tính c a solasodine từ dịch chiết tế bào
cà gai leo
Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên
collagenase
Chiều dài cột
gel an đầu
(mm)

Chiều dài cột
gel sau 24 giờ
(mm)

Chiều cao cột

gel bị tiêu
(mm)

Dịch chiết
solasodine

119 ± 2,1

104,0 ± 1,5

15,0 ± 0,6

ĐC

118 ± 1,8

50,3 ± 1,2

67,7 ± 1,6

Thí nghiệm

ĐC: dung dịch collagenase 0,1 mg/mL.

17


3.4. Quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro
cây cà gai leo
Cây cà gai leo tự nhiên

1. Kh trùng:
- Ethanol 70% trong 1 phút
- HgCl2 0,1% trong 8 phút
- Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng
2. Tạo cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong
môi trường S0
Cây cà gai leo in vitro
3. Tạo callus từ đoạn thân, đoạn rễ và cuống
lá của cây in vitro trên môi trường S1
Tạo callus
4. Nhân callus trong môi trường S2
Nhân callus
5. Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trường
S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút
6. Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi
trường S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút
Nuôi tế bào huyền phù
7. Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi
trường S3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ
lắc 150 vòng/phút, 4 tuần.
Tăng sinh so asodine
8. Tách chiết solasodine từ tế bào theo
p ương p p Sox let.
9. Địn lượng dịch chiết solasodine bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
10. c định hoạt tính trên cột collagen gel.
Dịch chiết solasodine

Hình 3.20. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao
từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

18


C ương 4
BÀN LUẬN
4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA METHYL JASMONATE
4.1.1. Ản

ưởng c a nồng độ methyl jasmonate

Thông thường, khi bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy
đều ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào, kết quả này được công
bố trên nhiều công trình nghiên cứu trước đây. Trong nghi n cứu của
chúng tôi, trong môi trường c MeJA sinh trưởng của tế bào cà gai
eo kém hơn so với đối chứng không bổ sung elicitor, nồng độ
elicitor càng cao thì sự sinh trưởng của tế bào càng giảm. Kết quả
này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về sự ức chế của elicitor
n sinh trưởng của tế bào thực vật.
Nồng độ elicitor đ ng vai trò rất quan trọng trong quá trình
cảm ứng, sự t ch ũy các hợp chất thứ cấp sẽ đạt cao nhất ở nồng độ
elicitor thích hợp. Nồng độ chất k ch kháng cao gây ra hiện tượng
đáp ứng quá ngư ng, dẫn đến chết tế bào. Trong nghiên cứu của
chúng tôi, sự t ch ũy so asodine đạt cao nhất khi được xử lý MeJA ở
nồng độ 50 µM (159 mg/g, gấp 1,3 lần tế ào đối chứng không bổ
sung MeJA).
4.1.2. Ản

ưởng c a thời gian x lý methyl jasmonate

Thời điểm xử lý elicitor cũng à một yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy các sản phẩm thứ cấp của
tế bào thực vật. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sinh
trưởng và tích lũy solasodine của tế bào ở các thời gian xử lý elicitor
khác nhau đều giảm so với xử lý ở thời điểm an đầu của quá trình
nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả
nghiên cứu của Chong và cs (2005) về ảnh hưởng của các elicitor

19


khác nhau và thời điểm bổ sung elicitor vào mẫu nuôi cấy tế bào
Morinda elliptica.
4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN
4.2.1. Ản

ưởng c a nồng độ dịch chiết nấm men

Không giống như khi xử lý bằng MeJA, khi bổ sung YE vào
môi trường nuôi cấy, sinh khối tươi và khô thu được đều cao hơn so
với đối chứng không bổ sung elicitor. Có nghiên cứu cho rằng, khi bổ
sung vào môi trường nuôi cấy, YE có vai trò hoạt động như một
nguồn nitrogen và dưới áp lực dinh dư ng này có thể cũng đ ng một
vai trò quan trọng trong sinh trưởng và kích thích tế bào thực vật tăng
cường sản xuất hợp chất thứ cấp. Từ kết quả nghiên cứu của chúng
tôi cho thấy, cả sinh khối và hàm ượng solasodine của tế bào cà gai
eo đều tăng ở nồng độ thích hợp (2-4 g/L). Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên
một đối tượng khác của họ cà là S. melongena.
4.2.2. Ản

ưởng c a thời gian x lý dịch chiết nấm men

Đối với cây cà gai leo, thời gian xử lý elicitor càng dài càng
kích thích sinh khối tế bào phát triển. Khi bổ sung YE vào thời điểm
bắt đầu nuôi cấy cũng như sau 7 ngày tế bào có khả năng sinh trưởng
tương đương nhau, ở thời điểm cảm ứng là 14 ngày chỉ số sinh
trưởng tế bào bắt đầu giảm và mạnh nhất là ở 21 ngày. Kết quả
nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên cây S. melongena cũng cho
thấy thời gian cảm ứng 28 ngày là tốt nhất cho phát triển sinh khối
cũng như hàm ượng so asodine như trong nghi n cứu của chúng tôi.
Phân tích hàm ượng so asodine t ch ũy trong tế bào cây cà
gai leo cho thấy thời điểm cảm ứng tốt nhất vẫn là lúc bắt đầu nuôi
cấy giống như đối với MeJA (so asodine đạt 220,5 mg/g khối ượng
khô).

20


4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA SALICYLIC ACID
4.3.1. Ản

ưởng c a nồng độ salicylic acid

Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ 50 và 100 µM SA
đã c ảnh hưởng kích thích rõ rệt lên sinh khối tế bào so với đối
chứng, tương tự như YE và ngược với MeJA. Hiện nay, không c
nhiều công trình nghi n cứu ghi nhận hiện tượng này ngoại trừ ở họ
cà. Trên họ cà, nghiên cứu của Jain và cs (2015) cho thấy khi xử lý
50 µM SA trên nuôi cấy rễ tơ cây S. melongena sinh khối thu được

cao hơn đối chứng khoảng 1,5 lần sau 28 ngày (5,16 g so với 3,39 g),
trong khi đ hàm ượng so asodine cao hơn đối chứng khoảng 13,5
lần (89,03 µg/g khô so với 6,5 µg/g khô).
Kết quả phân tích hàm ượng solasodine trong tế bào cà gai
leo cho thấy sự t ch ũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau
đ giảm mạnh ở 200-250 μM SA. Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên
khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn
cả MeJA và YE.
4.3.2. Ản

ưởng c a thời gian x lý salicylic acid

Tương tự với khi xử lý MeJA, thời gian xử lý bằng SA càng
dài thì càng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo.
Thời gian cảm ứng ngắn (7 ngày) ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế
bào. Tế ào đối chứng có thời gian cảm ứng dài nhất, do đ sinh khối
chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô.
Ảnh hưởng của thời gian xử lý SA lên khả năng tổng hợp
so asodine cũng tương tự như đối với MeJA và YE, thời gian cảm
ứng càng dài khả năng t ch ũy so asodine càng cao. Kết quả khảo sát
cho thấy xử ý 150 μM SA vào thời điểm 7-21 ngày sau khi nuôi cấy
không đủ thời gian cảm ứng để tế bào có thể sản xuất một ượng
solasodine cao. Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết

21


quả tốt nhất, cao hơn các trường hợp khác từ 2-3 lần.
4.4. ẢNH HƯỞNG PHỐI H P CÁC ELICITOR
Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác

nhau ở nghiên cứu này đều có tác dụng tăng t ch ũy so asodine trong
tế bào cà gai leo so với đối chứng. Công thức kết hợp tốt nhất cho
ượng so asodine cao hơn khoảng 1,6 lần so với tế ào không được
xử lý và khoảng 8,4 lần so với rễ cây tự nhi n 1 năm tuổi. Tuy nhiên,
xử lý kết hợp chỉ cao hơn chỉ xử lý với 50 μM MeJA, và thấp hơn xử
lý riêng rẽ với 3 g/L YE hay 150 μM SA.
Tương tự như xử lý riêng rẽ MeJA, YE và SA, xử lý kết hợp
các elicitor cũng cho thấy thời điểm bổ sung thích hợp nhất là lúc bắt
đầu nuôi cấy, hay nói cách khác thời gian cảm ứng dài (4 tuần) có
hiệu quả nhất. Sinh trưởng của tế ào và ượng so asodine đều cao
hơn so với các thời điểm cảm ứng khác (7-21 ngày sau khi nuôi cấy)
tương ứng với thời gian cảm ứng là 21-7 ngày. So với kết quả nghiên
cứu ở tế bào của phần lớn các loài thực vật khác, tế ào cà gai eo đòi
hỏi thời gian cảm ứng dài ngày hơn.
4.5. SO SÁNH HIỆU QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR
Trong nghiên cứu này, cả 3 elicitor đều àm tăng khả năng
sinh tổng hợp solasodine trong tế ào cây cà gai eo, trong đ SA c
vai trò cao nhất, tiếp đến là YE và cuối cùng là MeJA, ảnh hưởng của
các chất này lên sự phát triển của sinh khối cũng tương tự.
SA là elicitor phi sinh học có giá thành rẻ, dễ dùng n n được
nhiều tác giả sử dụng, nhiều công trình cũng cho thấy SA có hiệu quả
cao nhất trong kích khảng tổng hợp các HCTC ở thực vật.

22


KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Sự sinh trưởng và t ch ũy so asodine trong tế bào huyền
phù cà gai eo đạt cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt

4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/ ình và hàm ượng solasodine
đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3
lần.
2. Ảnh hưởng của các e icitor đến khả năng t ch ũy
solasodine trong tế bào in vitro của cây cà gai leo:
2.1. Hàm ượng so asodine t ch ũy cao nhất khi tế bào cà gai
eo được xử lý 150 µM salicylic acid ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy
(245 mg/g khối ượng khô).
2.2. Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp,
so asodine tăng dần từ tuần thứ 2-3, đạt cực đại ở tuần thứ 4 và sau
đ giảm dần từ tuần 5-7.
3. Solasodine từ tế bào huyền phù cà gai leo có khả năng kháng vi m,
thể hiện qua khả năng ức chế collagenase của chúng.
4. Đề xuất quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in
vitro tế bào của cây cà gai leo có xử lý 150 µM salicylic acid từ
nguồn cây tự nhiên.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu cải thiện sản xuất solasodine từ tế bào cà gai leo
trong hệ lên men bioreactor.
2. Nghiên cứu cơ chế tác động của elicitor đến con đường
chuyển hóa solasodine trong tế bào cà gai leo.

23