Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ bánh men thu thập tại Yên Phong Bắc Ninh.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MẪN VĂN HOẰNG
Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU
THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa

:CNSH & CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên, 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MẪN VĂN HOẰNG
Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU
THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: 43 - CNSH

Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Văn Chí

Thái Nguyên, 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Được sự tạo điều kiện giúp đỡ, quan tâm của các thầy cô giáo và bạn
bè, trong thời gian vừa rồi tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình
tại phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm –
Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Trần Văn Chí giảng
viên khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực phẩm trường Đại Học
Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện làm khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh
Học & Công Nghệ Thực Phẩm đã chỉ bảo, hướng dẫn tận tình các kỹ năng
phòng thí nghiệm. Động viên tình thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian hoàn thánh khóa luận.
Thái Nguyên, ngày tháng năm
Ngƣời thực hiện

Mẫn Văn Hoằng


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Thành phần của 1 lít môi trường Hansen ....................................... 30

Bảng 3.2. Thành phần của 1 lít môi trường Malt – Cao Nấm Men - Peptone.......... 30
Bảng 4.1. Kết quả đo giá trị OD của 50 chủng nấm men phân lập được ............ 35
Bảng 4.2 . Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 50 chủng nấm men .................. 37
Bảng 4.3. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường ............................... 40
Bảng 4.4. Kết quả thử khả năng lên men dịch chiết malt ở các tỉ lệ .............. 41
Bảng 4.5 Kết quả chưng cất dịch tinh bột cơm và dịch chiết malt ................. 43


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Cấu tạo tế bào nấm men [11] .......................................................... 17
Hình 3.1. Hình ảnh 1 số khuẩn lạc ................................................................. 32
Hình 3.2. Ảnh kết quả của việc quan sát qua kính hiển vi chủng 43.1.................. 33
Hình 4.1. Kết quả thử khả năng lên men đường glucose của một số chủng... 40
Hình 4.2. Hình ảnh kết quả thử khả năng lên men trong dịch chiết malt ....... 41
Hình 4.3. Hình ảnh một số chủng thử hoạt tính catalase ................................ 42
Hình 4.4. Đồ thị kháo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự phát triển
của chủng nấm men 34.1 .................................................................... 44
Hình 4.5. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sự phát triển
của chủng nấm men 34.1 .................................................................... 44
Hình 4.6. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của PH ban đầu đến sự sinh trưởng phát
triển của chủng nấm men 34.1 ........................................................... 45


iv
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 7
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................... 7

1.2. Mục tiêu và yêu của đề tài.......................................................................... 8
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 8
1.2.2. yêu cầu của đề tài .................................................................................... 8
1.3. Ý nghĩa của đề tài ...................................................................................... 8
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 8
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 8
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 9
2.1. Sơ lược về rượu .......................................................................................... 9
2.1.1. Phân loại rượu ......................................................................................... 9
2.1.2. Quy trình sản xuất Rượu [9] ................................................................ 12
2.2. Nấm Men .................................................................................................. 16
2.2.1. Hình thái và cấu tạo nấm men [2] ......................................................... 16
2.2.2. Dinh dưỡng nấm men [2] .................................................................... 18
2.2.3. Sinh sản của nấm men [2] ................................................................... 22
2.2.4. Sinh trưởng của nấm men [2]............................................................... 23
2.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men[2] ......................................... 24
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1. Đối Tượng và Phạm Vi Nghiên Cứu ...................................................... 29
3.1.1. Đối Tượng ............................................................................................ 29
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 29
3.2. Thời gian và địa điểm............................................................................... 29
3.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ....................................................................... 29


v

3.3.1. Thiết bị .................................................................................................. 29

3.3.2 Dụng cụ .................................................................................................. 29
3.3.3. Hóa chất................................................................................................. 29
3.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 30
3.5. Các phương pháp nghiên cứu.................................................................. 30
3.5.1. Phương pháp nghiền và pha loãng mẫu [7] ......................................... 30
3.5.2. Phương pháp phân lập [3] ................................................................... 31
3.5.3. Phương pháp cấy truyền và giữ giống [3]............................................ 31
3.5.4. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái ........................................... 31
3.5.5. Phương pháp dịch chiết malt [1] .......................................................... 33
3.5.6. Phương pháp đếm số lương tế bào trên buồng đếm hồng cầu [7] ....... 33
3.5.7. Phương pháp xác định sinh khối nấm men bằng phương pháp đo OD [7] ....... 33
3.5.8. Phương pháp xác định khả năng lên men [1]....................................... 34
3.5.9. Phương pháp chưng chất xác định nồng độ rượu [8]........................... 34
PHẦN 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................. 35
4.1. Kết quả phân lập...................................................................................... 35
4.2. Tuyển chọn một số chủng nấm men cá khả năng lên men rượu mạnh ............ 39
4.2.1. Thử khả năng lên men các loại đường ................................................. 39
4.2.2. Thử khả năng lên men trong dịch chiết Malt ...................................... 41
4.2.3. Thử hoạt tính Catalase ......................................................................... 42
4.2.4. Xác định nồng độ cồn và tuyển chọn ................................................... 42
4.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng Sacchoromyces
cerevisiae 34.1 ................................................................................................. 43
4.3.1. Khả năng sử dụng nguồn carbon ( đường glucose) .............................. 43
4.3.2. Khả năng sử dụng nguồn nitơ (peptone) .............................................. 44
4.3.4. Ảnh hưởng của PH ................................................................................ 44


vi
4.4. Định danh sơ bộ ....................................................................................... 45
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................... 46

5.1. Kết luận .................................................................................................... 46
5.2 Đề nghị ...................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47


7
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước ta là một nước nông nghiệp, với nhiều nếp văn hóa truyền
thống của từng vùng miền khác nhau. Từ miền Bắc tới miền Nam cây lúa
đã gắn bó lâu đời và trở lên quen thuộc.
Xa hơn, từ thời trung cổ ở châu Âu việc trồng lúa cũng khá là phổ
biến và rộng rãi. Cho lên các sản phẩm từ lúa cũng được con người tạo ra
trong đó có bia, rượu. Một loại đồ uống mà cho đến bây giờ vẫn được ưu
chuộng sử dụng rộng rãi.
Việc làm ra bia rượu lúc đó rất thô sơn đơn giản, nên chất lượng
chưa được cao. Vì lúc đó con người chưa hiểu rõ được bản chất của việc
sinh ra rượu cũng như các điều kiện trong đó.
Hiện tại sau nhiều thế kỉ, với sự tiến bộ và phát triển của loài người
đã nắm được nhiều kiến thức về khoa học kỹ thuật. Chất lượng rượu đã
được nâng lên rõ dệt, con người đã biết tuyển chọn lọc những chủng vi
sinh vật trong quá trình làm rượu. Quá trình đó gọi là lên men rượu, bia.
Chủng vi sinh vật sử dụng trong quá lên men chủ yếu là nấm men. Mỗi
vùng miền khác nhau lại có các chủng nấm men khác nhau và chất lượng
rượu cũng khác nhau. Ở quy mô sản xuất rượu nhỏ lẻ hộ gia đình ở các
vung quê của nước ta, việc sử dụng các chủng nấm men vẫn còn mang
tính dân dã theo kinh nghiệm. Cho nên việc lên men rượu vẫn chưa được
tối ưu hóa khả năng lên men và chất lượng rượu chưa được ổn định.
Trước hiện trạng đó, để góp phần nâng cao chất lượng rượu và tối

ưu hóa khả năng lên men của một số chủng nấm men tại địa phương tôi
tiến hành “Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng
lên men rượu cao từ bánh men thu thập tại Yên Phong- Bắc Ninh”
nhằm tìm ra chủng nấm men tốt nhất tại đó và tối ưu hóa được các điều
kiện sinh trưởng phát triển của nó. Phục vụ cho viêc nghiên cứu và ứng
dụng vào thực tế.


8
1.2. Mục tiêu và yêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Từ các mẫu bánh men thu thập được tại địa phương, ta tiến hành
phân lập và tuyển chọn ra các chủng có khả năng lên men rượu tốt nhất
và tối ưu hóa được điêu kiện nuôi cấy.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập được các chủng nấm nen từ mẫu bánh men.
Tuyển chọn ra được các chủn nấm men có khả năng lên men rượu
cao nhất và định danh.
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cây và sinh trưởng của các chủng nấm
men đó.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Sơ bộ đánh giá được trong mẫu bánh men thu thập được có những
loại vi sinh vật nào là chủ yếu và ý nghĩa của các loại vi sinh vật đó trong
quá trình lên men.
Tìm được chủng nấm men có khả năng lên men tốt nhất trong mẫu
bánh men.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sau khi có kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào quy mô sản xuất
rượu nhỏ lẻ tại địa phương và là tiền đề để ứng dụng trong quá trình lên

men rượu với quy mô công nghiệp.


9
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về rƣợu
2.1.1. Phân loại rượu
Rượu là loại đồ uống chứa cồn (anchol) có nhiều loại rượu và
hương vị cũng khác nhau tùy vào điều kiện sản xuất và vùng miền khí
hậu khác nhau. Dựa vào công nghệ sản xuất rượu, rượu được phân thành
3 loại rượu chính :
2.1.1.1. Rượu chưng cất: Loại rượu này dùng những nguyên liệu chứa
đường và tinh bột, nhưng sau khi lên men được cất lại. Rượu chưng cất là
những loại rượu nặng như: Brandy, Whisky, Rhum, và Vodka…
BRANDY
Chỉ các loại rượu chưng cất từ rượu Vang (Nho) hay từ trái cây đã
lên men. Thường thì Brandy phải qua hai lần chưng cất để đạt tỉ lệ cồn
70 – 80% rồi mới ủ cho rượu dịu bớt trong các thùng gỗ sồi nhờ quá trình
oxy hóa, sau đó pha thêm nước cất để được độ cồn khoảng 40%. Cũng có
khi Brandy pha được thêm caramen để có màu đẹp Brandy có hai dòng
chính là Cognac và Armagnac.
Cognac: Được sản xuất từ vùng Cognac của Pháp. Cognac được
chưng cất từ nho. Sau khi hái trái, Nho được ép lấy nước cốt rồi mới đưa
vào nồi cất. Rượu mới cất không có màu chứa khoảng 70% cồn, còn mùi
vị trái cây. Rượu được đổ vào thùng gỗ sẽ dần đổi thành màu hổ phách và
có hương vị nho dịu. Cuối cùng chúng sẽ được pha chế sao cho có mùi vị
ngon nhất trước khi đóng chai và dán nhãn.
Armagnac: Được làm ở vùng Gscony của Pháp, và chúng cũng
được ủ trong thùng gỗ sồi ở địa phương, sau đó pha trộn cho các chất

trong rượu quyện vào nhau rồi đóng chai nhưng mùi nặng hơn.
WHISKY
Là loại đồ uống có độ cồn cao, chưng cất từ ngũ cốc, có nguồn gốc
từ Ireland, sản xuất để phục vụ cho các buổi lễ và bán ra ngoài, sau đó
mới được truyền bá sang Scotch và một số nước khác.


10
Whisky là sản phẩm chưng cất từ những hạt lúa đại mạch, lúa đen,
bắp và các loại hạt ngũ cốc có hạt nhỏ khác. Trước năm 1820, tất cả các
loại Whisky đều được làm ra từ mạch nha của lúa đại mạch (lên có tên
gọi khác là Whisky đại mạch). Việc chưng cất loại whisky từ lúa đại
mạch pha trộn với bắp xuất hiện vào năm 1830, sau khi bằng sáng chế
được cấp. Từ đó người ta mới phát hiện rằng Whisky pha trộn có mùi êm
dịu hơn
RHUM
Rhum có một lịch sử bắt nguồn từ Châu Á, và được truyền lại sang
phương Tây. Cây mía được Columbus mang đến Châu Mỹ, Cuba, Rhum
được xuất hiện đầu tiên tại vùng này. Rhum được chưng cất từ cốt mía
hay sản phẩm của cây mía. Nó được chưng cất đến khoảng dưới 950 cồn
và được đóng chai ở độ cồn thấp hơn nhiều. Rhum còn giữ lại phần lớn
hương vị tự nhiên của sản phẩm gốc đó là cây mía.
VODKA
Vodka là loại rượu mạnh không màu có nguồn gốc từ các nước
Đông Âu điển hình là nước Nga. Khi mới chưng cất Vodka đạt độ cồn
khoảng 95 độ, sau giảm dần còn 400 – 500. Vodka không nhất thiết phải
qua khâu ủ, nhưng cần sử lý nhằm loại bỏ hương vị và màu sắc để trở
thành trong suốt, không mùi (chủ yếu sử dụng than hoạt tính để khử chất
độc). Đây là loại rượu dễ bay hơi có thể pha chế với nhiều loại trái cây và
các hỗn hợp đồ uống khác.

GIN
Gin nổi tiếng là được sản xuất tại Hà Lan, Gin được chưng cất từ
các loại hạt bắp (bắp, lúa mạch, lúa mì, lúa mạch đen) trộn với hương liệu
thảo mộc như hạnh nhân, quế, hạt cooca, gừng, vỏ chanh, cam,….Độ cồn
trong rượu Gin thường từ 34 – 47%.
2.1.1.2. Rượu lên men thuần túy
Rượu được lên men từ các nguyên liệu có chứa đường và tinh bột
và đều có nồng độ thấp. Những điển hình của loại rượu này là: Rượu
vang, saké, rượu nếp…


11
Rượu Nếp Than
Là loại đồ uống có cồn ethanol, được sản xuất hoàn toàn bằng
phương pháp thủ công từ một loại gạo nếp đặc biệt Nếp Than (Nếp Cẩm),
giống như quy trình sản xuất rượu vang, nếp than thu được từ quá trình
lên men không qua chưng cất. Điểm khác biệt ở chỗ là sản phẩm cuối là
loại rượu chứa cả dịch lên men và bã lên men đã được làm nhuyễn. Tức
là sản phẩm rượu được dùng dưới dạng không trong suốt. Trong thành
phần của mình, ngoài một lượng rượu và một lượng đường với nồng độ
nhất định, rượu Nếp Than còn chứa một số chất mà không thể có ở một
số loại rượu chưng cất như vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B, các
aminoacid như asparagine, lysine, glutamic…..Vì vậy, rượu Nếp Than là
một loại thức uống bổ dưỡng, giúp tiêu hóa tốt thức ăn nếu dùng ở mức
độ vừa phải. Người sử dụng sẽ thích thú với cảm giác cay nồng vừa ngọt
vừa có hương thơm đặc trưng hấp dẫn không thể có ở các loại rượu khác.
Rượu Cần
Là thức uống mang bản sắc văn hóa đặc trưng vùng miền độc đáo
của người miền núi. Nó được dùng phổ biến ở các dịp lễ hội, ma chay,
cưới hỏi trong cộng đồng người dân tộc thiểu số, đặc biệt la đồng bào khu

vực Tây Nguyên.
Rượu Cần là loại rượu có vị ngọt hơn so với rượu cất, có độ rượu
nhẹ và giàu dinh dưỡng. Rượu Cần thu được từ quá trình lên men không
qua chưng cất.
Nguyên liệu chính của rượu Cần là các loại gạo lúa nương. Gạo
được sát vỏ trấu và được bổ xung nước vào đem nấu, cơm được nấu phải
đảm bảo khô, không được nhão. Xới cơm tãi trên một tấm đệm và để
nguội.
Vỏ trấu được dùng để trộn với cơm trước khi cấy men vào hoặc để
lót thành lớp mỏng ở dưới đáy bình và phủ lên bề mặt của bình rượu.
Việc dùng vỏ trấu nhằm tăng độ tới sốp của cơm và tránh việc
thoát hơi nước của nguyên liệu.


12
2.1.1.2. Rượu pha chế
Đây là thứ rượu lên men hoặc rượu cất có pha thêm đường, hương
liệu, dược liệu….mà thành. Trong nhóm này có các thứ rượu bổ, rượu
sâm, Liqueur, cocktail.
Cocktail là thức uống rất phổ biến trên thế giới, có tính bổ dưỡng
và không gây say xỉn hỗn hợp được kết hợp từ hai loại rượu trở lên, hoặc
được pha trộn với các thức uống không ga hoặc nước uống trái
cây,…theo một công thức được quy định tương đối, và vì đây được xem
là thức uống khá dinh dưỡng và mang đầy tính nghệ thuật cho nên cách
pha chế cocktail đòi hỏi người pha cần có cảm tính, chứ không phải theo
công thức cứng ngắc.
2.1.2. Quy trình sản xuất Rượu [9]
2.1.2.1. Chế biến nguyên liệu thành dịch rỉ đường
Nguyên liệu
Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng các loại nguyên liệu sau:

Nguyên liệu có sẵn đường như: mật, rỉ đường…
Nguyên liệu có tinh bột như: gạo, ngô, sắn….
Nguyên liệu có cellulose như: gỗ, mùn cưa, rơm dạ…
Trong công nghệ sản xuất rượu hiện nay sử dụng hai loại nguyên
liệu phổ biến có sẵn đường và tinh bột. Trừ nguyền liệu từ đường và rỉ
đường, các nguyên liệu khác đều phải trải qua quá trình đường hóa mới
có thể thực hiện được quá trình lên men nhờ nấm men.
Các phương pháp đường hóa
Các nguyên liệu chứa cellulose, hemicellulose được đường hóa
bằng acid (HCl, H2SO4) và nhiệt độ cao. Các nguyên liệu chứa tinh bột
được đường hóa bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Phương pháp đường hóa bằng bánh men
Đây là phương pháp đường hóa được sử dụng rộng dãi trong dân
gian để đường hóa các nguyên liệu chứa tinh bột. Trong bánh men có


13
nấm mốc được nuôi cấy phát triển trên môi trường tinh bột sống. Nấm
mốc trong bánh men có hệ enzyme amylaza có vai trò trong đường hóa
tinh bột. Quá trình đường hóa tinh bột không nhất thiết phải hồ hóa tinh
bột thành dung dịch mà chỉ cần làm chín tinh bột (theo kiểu đồ cơm) ở
nhiệt độ khoảng 130 – 1400C để các cấu trúc tinh bột dễ dàng bị phá vỡ.
Lúc này tinh bột chuyển sang dạng dễ tan, làm cho hệ enzyme amylaza
của nấm mốc có thể phân hủy dễ dàng. Tuy vậy, do tinh bột không ở
dạng dung dịch nên hạn chế sự tác dụng của enzyme amylaza lên các
mạch tinh bột làm cho hiệu xuất của quá trình đường hóa không cao, dễ
bị nhiễm tạp khuẩn, khi lên men sẽ tạo ra nhiều sản phẩm trung gian.
Phương pháp này chỉ được sử dụng trong sản xuất rượu thủ công.
Phương pháp Maltase
Người ta thường dùng enzyme (α và β amylaza) của malt để

chuyển hóa tinh bột đã được hồ hóa thành đường lên men.
Phương pháp này có những ưu điểm như:
- Thời gian hồ hóa tinh bột ngắn.
- Chất lượng rượu không bị ảnh hưởng mà còn tạo ra hương thơm
đặc biệt dễ chịu.
- Ít bị nhiễm khuẩn
Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm như:
- Hiệu suất đường hóa không cao, không triệt để do hệ enzyme
amylase trong malt không hoàn chỉnh.
- Thường áp dụng cho các nước sứ lạnh có điều kiện trồng đại
mạch và tiểu mạch.
- Giá thành sản xuất rượu cao, do hàm lượng bột malt sử dụng để
đường hóa cao, nhất là với các nước phải nhập khẩu bột malt.
Phương pháp Myco – Malt.
Đây là phương pháp được dùng phổ biến hơn ở cả trong và ngoài
nước, quá trình đường hóa nhờ enzyme của vi sinh vật chủ yếu la nấm


14
mốc. Các loại nấm mốc được sử dụng có khá nhiều loài thuộc chi
Aspergillus và chi Endomycopsis thời gian thực hiện quá trình đường hóa
dài hay ngắn con tùy thuộc vào chủng nấm mốc và nguyên liệu sử dụng.
Chất lượng của quá trình đường hóa được đánh giá theo hoạt lực
của amylaza, dextrinaza, glucoamylaza.
Kết quả của quá trình đường hóa sẽ cho ra các sản phẩm hỗn hợp
gồm dextrin, maltoza, glucoza trong đó glucose chiếm tỉ lệ cao nhất.
2.1.2.2. Lên men đường thành rượu [9]
Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu – quyết định
đến chất lượng của sản phẩm tạo thành.
Sau khi có dịch đường hóa hay hay dịch đường đã sử lý, người ta

se bổ xung thêm một số thành phần để cung cấp thêm vitamin và amino
acid như muối ammonium, muối phốt phát dịch thủ phân nấm men…..
Quá trình lên men: Môi trường lên men sau khi khử trùng, kiểm tra
nồng độ đường đạt 90 – 120 g/l và PH = 4,5 – 4,8 thì có thể cấy giống
vào. Thời gian lên men từ 60 - 72 giờ trong đó 10 giờ đầu có sục khí cho
nấm men sinh sôi nảy nở và bắt đầu lên men yếm khí.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men đường thành rượu:
C6H12O6 →2C2H5OH +2CO2 + 27kcal
Trong quá trình lên men rượu, dịch lên men thu được sau khi quá
trình lên men kết thúc, ngoài sinh khối nấm men còn có các thành phần
khác: sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các sản phẩm phụ như glixerin,
acid succinic, các aldehyde, và một số loại rượu bậc cao như isomalic.
Isobutylic, propiolic…
Cơ chế của quá trình lên men
Đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp
thụ và khuếch tán vào bên trong tế bào nấm men qua màng tế bào. Trong
tế bào nấm men, nhờ hoạt động sống của tế bào và hoạt động xúc tác của
hàng loạt các Enzyme làm cho những phản ứng hóa sinh sảy ra dẫn đến


15
sự phân giải và tổng hợp các chất khác nhau. Rượu và CO2 được tạo
thành và thoát khỏi tế bào.
2.1.2.3. Chưng cất và tinh chế cồn[9]
Khi kết thúc lên men rượu, sau khi đã loại bỏ tế bào nấm men
muốn được rượu tinh khiết cần phải chưng cất dịch lên men để loại bỏ tạp
chất kỹ thuật cất rượu có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu thu được, tỷ
lệ tạp chất cũng như chất lượng rượu rượu bị ảnh hưởng bởi nguyên liệu
nuôi cấy.
Quá trình chưng cất rượu diễn ra theo các giai đoạn sau:

- Giai đoạn thu rượu thô: Khi kết thúc quá trình lên men, đem
chưng cất dịch lên men ta thu được rượu thô (quá trình chưng cất sẽ tách
rượu và các chất dễ bay hơi khác ra khỏi dịch lên men).
- Giai đoạn tinh chế: Tách tạp chất ra khỏi cồn thô để thu được
rượu tinh khiết. Trong cồn thô, ngoài rượu ethanol còn chứa nhiều tạp
chất khác. Dựa vào trọng lượng phân tử và khả năng bay hơi người ta
chia tạp chất ra làm 3 loại:
+ Tạp chất đầu: Loại này có nhiệt độ sôi cao hơn thấp hơn nhiệt
độ sôi của ethanol như aldehyde acetic, ethyl acetat…..chúng được lấy ra
ở giai đoạn đầu của quá trình tinh chế.
+ Tạp chất cuối: Loại này có nhiệt độ sôi cao hơn ethanol và khó
bay hơi, đó là các rượu cao phân tử như isoamylic, isobutylic….chúng ít
hòa tan trong nước.
+ Tạp chất trung gian: Đặc tính của tạp chất trung gian là tùy vào
nồng độ rượu và tính chất vật lý của các tạp chất mà nó sẽ bay hơi cùng
với tạp chất đầu hay ở lại cung tạp chất cuối.
Sau tinh chế tách được 3 loại tạp chất trên ta sẽ thu được rượu tinh
khiết. Giống vi sinh vật trong sản xuất rượu được sử dụng chủ yếu là các
chủng nấm men Sacchoromyces cerevisiae. Các chủng nấm men dùng
trong sản xuất phải có những đặc điểm sau:


16
- Có đầy đủ các đặc điểm đặc trưng của nấm men.
- Tốc độ phát triển mạnh, hoạt lực lên men cao.
- Lên men được nhiều loại đường khác nhau và có tốc độ lên men cao.
- Thích nghi được với các điều kiện khí hậu không thuận lợi của
môi trường, đặc biệt là chất sát trùng.
- Riêng các chủng nấm men ở nước ta phải có khả năng lên men
trong nhiệt độ cao ≥350C.

Mặc dù ở mỗi vùng có những loại rượu riêng và phương pháp sản
xuất riêng. Nhưng đều có đặc điểm chung là được lên men truyền thống
từ hệ vi sinh vật có trong bánh men đặc trưng của từng vùng.
2.2. Nấm Men
2.2.1. Hình thái và cấu tạo nấm men [2]
2.2.1.1. Hình thái nấm men
Tế bào nấm men có hình dạng cầu, ovan elip hoặc hình trụ hình
quả chanh, hình dạng của chúng còn thay đổi theo điều kiện môi trường
và giai đoạn phát triển.
Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, chiều dài khoảng 8
đến 10 micromet.
2.2.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men[1]
- Tế bào nấm men có cấu tạo dạng đơn bào. Gần giống với tế bào
động vật và thực vật, đã tiến hóa hơn so vơi tế bào vi khuẩn có những cấu
tạo (nhân có màng, có nhiễm sắc thể, phân bào có tơ).
- Tế bào nấm men có cấu tạo phức tạp, trong tế bào có những cơ
quan tử của tế bào các chất nội bào, thể vùi của tế bào.


17
Hình 2.1. Cấu tạo tế bào nấm men [11]

Vỏ Tế Bào: Bao quanh tế bào nấm men là lớp màng mỏng, đàn hồi,
để định hình cũng như chống lại các tác nhân bên ngoài ngoài ra còn
mang điện. Để điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào, điều chỉnh các
chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi vào trong tế bào. Có cấu tạo hóa học
bao gồm các phức hợp chất chứa protein-polysacarit. Phosphate và lipit
dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% trọng lượng của tế bào.
Tế Bào Chất: Tế bào chất hay còn gọi là nguyên sinh chất ở thể
dạng keo chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào như riboxom, ti thể,

các chất dự chữ, lưới nội chất… tế bào chất thay đổi phụ thuộc vào điều
kiện nuôi cấy và tuổi của nó, khi trẻ nguyên sinh chất ở dạng đồng nhất
còn khi già nó trở nên không đồng nhất. Xuất hiện không bào, giọt chất
béo, lipit, polysacarit, các thể vùi, các Enzyme tham gia vào các phản ứng
sinh hóa…vv
Riboxom: Ở dạng các hạt siêu hiển vi cấu tạo từ lipit, protit, và axit
ribonucleic (RNA). Tại đây diễn ra quá trình tổng hợp protein từ các
chuỗi amino axit được hoạt hóa từ ti thể.
Ti Thể: Ở dạng hạt rất nhỏ hoặc dạng que dạng sợi phân bố trong
tế bào chất ở khoảng không giữa vỏ tế bào và không bào. Trong tế bào
nấm men tế bào nấm men thường có từ 1 đến 50 ti thể, tùy vào nồng độ
glucose trong môi trường. Ở môi trường có nồng độ glucose thấp có


18
khoảng 100 đến 200 ti thể. Trong ti thể có chứa các enzyme để thực hiện
các phản ứng oxy hóa để cung cấp năng lượng và tham gia vào các phản
ứng tiếp theo.
Nhân: Nhân tế bào nấm men có màng nhân, bảo vệ nhân và tham
gia vào quá trình điều hòa của nhân. Có đường kính khoảng 2 micromet
kích thước của nhân không đồng nhất ở các tế bào khác nhau và ở các
giai đoạn phát triển khác nhau và phần lớn ở dạng hình cầu hình elip….
Trong nhân chứa nhiều axit nucleic tham gia vào quá trình truyền đạt
thông tin di truyền.
2.2.2. Dinh dưỡng nấm men [2]
Người ta thường chia dinh dưỡng nấm men thành 2 nguồn đó là
dinh dưỡng nội bào và dinh dưỡng ngoại bào. Các chất dinh dưỡng ngoại
bào được thấm qua màng vào bên trong tế bào, khi môi trường đã cạn kiệt
các chất dinh dưỡng thì các chất dự trữ nội bào như glycogen, lipit, .. sẽ được
sử dụng.

Vận Chuyển Các Chất Qua Màng Tế Bào:
Các chất được vận chuyển qua màng tế báo nấm men theo 2 cơ
chế chủ động và thụ động. Vận chuyển chủ động đòi hỏi tiêu hao năng
lượng để thấm các hợp chất chứa Oxy vào để thực hiện các phản ứng
khử tiếp theo.
Dinh Dưỡng Cacbon
Nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men bào gồm các chất như
đường và các dẫn xuất, rượu, amino axit, axit hữu cơ. Đa số các chủng
nấm men đều không có enzyme xenlulaza và amylaza nên không thể sử
dụng trực tiếp được tinh bột và xululoza, gần đây có một số công trình
nghiên cứu cho thấy một số chủng giống thuộc Candida có hoạt tính
amylaza ngoại bào, song vẫn chưa chủng này vào trong sản xuất công
nghiệp cũng như trong thực tế.


19
Các nguồn Carbon dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại
đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) được tất cả các loại nấm men
sử dụng.
Tỷ số các đường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của
từng loài. Qua đây ta có thể xây dựng được phương pháp chuẩn đoán các
loại nấm men. Phần lớn các loài giống Saccharomyces khác nhau giữa
chúng trước hết là quan hệ với các đường trong quá trình trao đổi chất
hydratcarbon. Đối với nguồn các bon khác như các loại rượu và acid hữu
cơ thì mối quan hệ này giống nhau ở tất cả các loài của cùng một giống.
Các loài Saccharomyces lên men rượi vang sử dụng glucose,
fructose, maltose, saccarose và galactose.
Axit axetic và glucose được sử dụng đồng thời như là một quy luật,
trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì
nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước.

Trong nuôi cấy liên tục nấm men có tốc độ sinh trưởng cùng với
tốc độ pha loãng của môi trường thì những hợp chất có nhiều Carbon
trong phân tử sẽ được sau cùng.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng có
khả năng đồng hóa vật chất như nhau. Có thể nói, các loài khác nhau
đồng hóa dinh dưỡng là khác nhau. Thí dụ: các loài Candida natalensis
và C.parapsilosis đồng hóa rất tốt galactoza nhưng C.clausseni lại không
đồng hóa được đường này. Sacchoromyces cerevisia chỉ bắt đầu sử dụng
được galactose từ ngày thứ hai sau khi nuôi cấy.
Những disacarit (maltoza và saccaroza) trước khi được nấm men
sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương
ứng của nấm men. Nấm men chuyển từ sống kỵ khí sang sống hiếu khí
thì khả năng sử dụng glucose và maltose sẽ bị giảm, nhưng với saccarose
hoạt tính sử dụng lại được tang gấp 2,5 lần. Nấm men sử dụng Maltose
chỉ khi trong môi trường không có mặt của glucose và fructose. Maltose
được lên men hoàn toàn trong pha sinh trưởng ổn định của nấm men.


20
Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất
của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm
men và có thể là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất.
Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn carbon nuôi
cấy nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Đặc biệt là
thu sinh khối nấm men từ hydrocacbon làm nguồn protein – vitamin dùng
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có rất nhiều triển vọng. Nhưng vẫn còn ý
kiến e ngại các sản phẩm này còn dư lượng những chất nào đó còn chưa
rõ hoặc không xác định được nó ảnh hưởng đến sức khỏe của con người
và vật nuôi ra sao.
Ngày nay người ta hoàn thiện thực nghiệm về vai trò của CO2 trong quá

trình trao đổi chất của nấm men. Thật vậy, giữa tất cả các nguồn carbon
hữu cơ có thì khí CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết
với CO2 đều là sản phẩm cần thiết cho nấm men.
Dinh Dưỡng Nitơ
Nguồn nitơ cần thiết cho tổng hợp các cấu trúc chứa nitơ của tế
bào chất là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ có sẵn trong môi trường.
Các hợp chất hữu cơ chứa N của tế bào là các acid amine, các
nucleotit, purin, pyrimidine, protein và một số vitamin. Nấm men có khả
năng tổng hợp được tất cả các acid amine …thành phần protein trực tiếp
từ các hợp chất vô cơ trong khi sử dụng nguồn carbon là các chất hữu cơ–
sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa hydratcacbon trong hô hấp và
lên men.
Đa số nấm men không đồng hóa được nitrate. Song, giống
Hasenula và giống Pichialại đồng hóa được chất này. Một số loài thuộc
giống Brettanomyses cũng đồng hóa được nitrate.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt nhất là các muối
moni của acid vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là amoni sulfat, phosphate rồi
đến các muối acetat, lactade, malade và succinade.


21
Trong môi trường có muối ammonium, đặc biệt là sulfate, thì nấm
men sẽ sử dụng gốc acid còn lại sẽ được sử dụng sau hoặc ít sử dụng sẽ
làm cho môi trường acid hóa, giảm PH.
Trong môi trường lỏng ammoniac (NH3) ở NH4+ gần với tiền chất
nhất của Nitơ hữu cơ là nguồn N rất dễ cho nấm men sử dụng, chỉ xếp
sau các acid amine. Nấm men còn sử dụng được urea và peptone. Trong
môi trường lỏng urea sẽ bị ureaza của nấm men phân ly thành NH4+ và
CO2. Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt trong môi trường nên có
mặt cả nguồn Nitơ vô cơ và hữu cơ.

Các nguồn Nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amine (Nấm
men chỉsử dụng được acid amine ở dạng tự nhiên), các peptide, các
nucleotide…Trong thực tế người ta hay dùng ngô, cao nấm men, dịch
thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc…) làm nguồn N hữu cơ.
Dinh Dưỡng các nguyên tố vô cơ
Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh nói chung, trong đó có
nấm men, phosphor (P) được quan tâm trước hết,sau đó là kali (K) và
magie (Mg), lưu huỳnh (S)….
Như chúng ta đã biết phosphor tham gia vào quá thành phần quan
trọng của tế bào như các nucleoproteide, acid nucleic, polyphosphate,
phospholiphid….các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các
biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt biệt là trao đổi chất hydrocarbon
trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phosphor
vô cơ là orthophosphate. Hợp chất này chuyển thành polyphosphate và
sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Khi không đủ P
trong môi trường sự troa đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên
quan đến sự phá vỡ nhau cầu và sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu cầu
sinh lý về P đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 – 13 mg P.
Trong phòng thí nghiệm vi sinh ta thường dùng KH2PO4 và
K2HPO4 làm nguồn cung cấp P và K. Trong sản xuất thường dùng dịch
chiết từ supephosphat làm nguồn P.


22
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amine trong phân tử
protein và là nhóm (-SH) của enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt
lưu huỳnh trong môi trường nuôi cấy thì sự trao đổi chất của tế bào bị vi
phạm và có thể không tổng hợp được protein. Trong môi trường với hàm
lượng lưu huỳnh nhỏ làm tang sự nảy chồi của nấm men. Nhưng ở nồng
độ 1mg/l S đã kìm hãm quá trình này. Do vậy, khi sử dụng các nguồn lưu

huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men cần
phải thận trọng.
Dinh Dưỡng Các Chất Sinh Trưởng
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazơ purin
và pyrimidin. Nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc
tố là 6 vitamin nhóm B.
Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao
nấm men (dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết
cám (cám gạo hoặc cám mì) dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme
và đặc biệt là rỉ đường.
Acid amine ngoài vai trò là nguồn nitơ hữu cơ và cả nguồn carbon
hữu cơ được vi sinh vật sử dụng trực tiếp làm vật liệu xây dựng tế bào
còn là các chất kích thích sinh trưởng của một số chủng nấm men.
2.2.3. Sinh sản của nấm men [2]
Nấm men có hai hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (bằng bào
tử) và vô tính bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào. Tùy thuộc vào điều
kiện nuôi cấy nấm men sẽ sinh trưởng vô tính hay sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính
Các tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu sang vỏ tế bào
con, mà ở chỗ các mấu chồi sẽ tổng hợp các vật liệu của vỏ tế bào và tích
tụ ở đây nhằm chuyển cho tế bào con. Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở
đầu cong nhất của tế bào.


23
Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính của nấm men liên quan đến sự tạo thành bào tử
nang(túi) của tế bào sinh dưỡng kèm theo quá trình giảm phân của sự
phân cắt của nhân. Bào tử nang bền với các tác nhân bên ngoài như nhiệt
độ cao, khô hạn nhưng nó kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn,

chúng thường chế ở nhiệt độ 600C còn bảo từ vi khuẩn chết ở 1200C.
Chu kỳ sống của nó đầu tiên là bảo tử nang- nảy mầm – tạo ra các
pha đơn bội – tiếp hợp – tạo thành hợp tử - chuyển thành pha nhị bội- bào
tử nang.
2.2.4. Sinh trưởng của nấm men [2]
Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh
dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất trong môi trưởng dinh dưỡng
giảm đến mức thấp nhất. Khi đó sinh trưởng và phát triển của chúng chầm
dần và ngừng hẳn, cũng có thể còn tế bào phân chia nhưng sự tăng sinh
khối là không đáng kể. Nếu trong cả quá trình nuôi cấy ta không bổ sung
thêm chất dinh dưỡng vào và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có
quần thể tế bào trong không gian sống giới hạn. Hệ sinh trưởng như vậy
được gọi là “hệ kín”, trong hệ kín sinh trưởng sẽ được chia thành 6 pha
tương ứng vơi 6 giai đoạn phát triển của tế bào nấm men.
- Pha tiềm phát: ở pha này vi sinh vật chưa sinh sản và còn làm
quen dần với môi trường, tế bào chưa tăng sinh.
- Pha tăng dần: tế bào bắt đầu sinh sản và tăng dần.
- Pha lũy thừa: ở pha này tế bào sinh sản mạnh đạt mức cực đại.
- Pha giảm dần : trong pha này sự sinh sản và phân chia của tế bào
chậm dần.
- Pha ổn định: pha này được coi như pha cần bằng động, số lượng
tế bào đạt mức cực đại và không thay đổi theo thời gian.
- Pha suy vong: số lượng tế bào trong pha này bị giảm do tế bào
già, nghèo chất dinh dưỡng, tích lũy nhiều chất ức chế.
2.2.1.6 Sự trao đổi chất của nấm men [5]