Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường việt nam

THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ
(Thông tin đưa lên trang Web)
Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria
monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong
một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201
Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Lê Quang Hòa
2. PGS.TS. Tô Kim Anh
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
TÓM TẮT KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ
lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là
xúc xich và thịt hun khói cắt lát.
2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48
chủng L. monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và
lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn
lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV
và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16
ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch
lớn trên thế giới.
3. Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L. monocytogenes, bao gồm:
thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP là
nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M.
4. Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L. monocytogenes từ thực phẩm dựa trên
phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ lắc
150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và
mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh
mẫu thực phẩm. Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân
tích 12-14 giờ.

5. Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh
Listeria monocytogenes trong thực phẩm. Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả
có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 và
TCVN 7700-1:2007.
Hà Nội, ngày 28 tháng 3 năm 2016
Tập thể hướng dẫn

TS. Lê Quang Hòa

PGS.TS. Tô Kim Anh

Nghiên cứu sinh

Phùng Thị Thủy


INFORMATION ON NEW CONCLUTION OF DOCTORAL THESIS
(Information will be posted on the Website)
Name of thesis: Study on rapid method for direct detection and molecular
epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from Vietnam foods
Specialization: Biotechnology
Code No.: 62420201
Name of PhD. student: Phung Thi Thuy
Advisor:
1. Dr. Le Quang Hoa
2. Assoc. Prof. Dr. To Kim Anh
Training Institution: Hanoi University of Science and Technology

Summary of the new contributions of the Thesis
1. Fifty nine strains of L. monocytogenes were isolated from 543 Vietnam food samples. The

average infection rate of L. monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in
sausage and slide meat products.
2. Forty eight strains out of 59 isolated of L. monocytogenes were divided into two lineages, of
which 40 isolates belonging to lineage I and 8 isolates belonging to lineage II. The lineage I
strains was considered high risky than those of the lineage II. On the other hand, the
isolates could be divided into 9 clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI
strain were seen as outbreak causing strains. The 48 isolates also can be divided into 16 ST,
of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide.
3. A molecular method for rapid detection of L. monocytogenes based on LAMP reaction was
established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition
for the reaction was 65 °C for 40-60 min. with betaine concentration of 0.9 M.
4. The direct detection procedure of L. monocytogenes based on the LAM reaction was
optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10
and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA
extraction. The sensitivity of detection procedure attained 1 CFU L. monocytogenes /25 g
food with total analysis time of 12-14 hours.
7. A LAMP-L'MONO kit for L. monocytogenes rapid detection based on LAMP technique
was designed and validated and found to be conformed with ISO 11290-1: 1996 and
TCVN 7700 -1: 2007 methods.

Hanoi, 28th, March, 2016
Advisor:

Le Quang Hoa

PhD. Student

To Kim Anh

Phung Thi Thuy

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Tên tác giả: Phùng Thị Thủy

1.

Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria
monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được
trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam
2.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62420201

3.

Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

4.

Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án
 Mục đích nghiên cứu:
-

Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập được
từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.

-

Thiết kế, chế tạo thử nghiệm và kiểm định bộ sinh phẩm LAMP phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền.

 Đối tượng nghiên cứu:
-

Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội

-

Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực
phẩm đang lưu hành tại Việt Nam,

-

Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác ngoài L. monocytogenes
Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

5.


Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm




Điện di DNA trên gel agarose
Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các housekeeping gen cho

giải trình tự
Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch
GeneJETTM PCR Purification (Fermentase)
Phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài
MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp





Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen được
giải trình tự 2 chiều.







Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4
Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP
Phản ứng Real-time PCR
Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn
Kiểm định bộ sinh phẩm





Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 và ISO 112901:1996

Xây dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalW
Các kết quả chính và kết luận

6.

 Các kết quả chính đã đạt được trong đề tài nghiên cứu:
- Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ
nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (lần lượt
là 30,34 % và 14,48 %).
Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48
chủng L. monocytogeneses phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và
lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn
lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV
và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST
trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn
trên thế giới.
- Đã Thiết kế được bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy trên mẫu vi khuẩn
thuần là 16 CFU/ phản ứng, trên canh trường tăng mẫu xúc xích là 336 CFU/ml. Bộ mồi
cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu)
- Đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng LAMP đó là thực hiện phản ứng tại nhiệt độ
65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain là 0,9 M.
- Đã tối ưu được điều kiện tăng sinh cho phát hiện L. monocytogenes là: sử dụng môi
trường BLEB (17 g/l casein enzymeic hydrolysate; 3 g/l papaic digest of soyabean meal;
5 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g/l dextrose; 6 g/l cao nấm men;1,35 g/l KH2PO4; 9,6 g/l
Na2HPO4; pyruvate 1,2 g/l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg/l), tăng sinh ở 37oC tốc độ
lắc 150 vòng/ phút, thời gian 10 giờ (với sản phẩm thịt); 12 giờ (với sản phẩm sữa và
mayonair).
- Đã tìm được điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường
tăng sinh mẫu thực phẩm đó là sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt 5
phút tại 95oC, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g trong 3 phút thu dịch DNA cho phản ứng

LAMP.
- Đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes monocytogenes trong
thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt 1 cfu/25 g với tổng thời gian phân
tích khoảng 12-14 giờ.
- Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes
trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP mang tên LAMP-L’MONO.
- Đã kiểm định và ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO cho kết quả có độ
tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 (sửa đổi lần
1: 2004) và TCVN 7700-1:2007. Độ đặc hiệu đạt 100 % (phòng thí nghiệm, trên mẫu
thực và kiểm định). Độ chính xác (ổn định) đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực) và
đạt 96 % (kiểm định), tỷ lệ dương tính giả 0% (phòng thí nghiệm và mẫu thực).
 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
-

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy thực tế tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes
trên thực phẩm khá cao, có những dòng phân lập được có khả năng gây dịch bệnh lớn. Tuy rằng


cho đến hiện nay mới chỉ có công bố về một vài trường hợp bệnh nhên bị listeriosis, nhưng nếu
không kiểm soát tốt vi khuẩn này trong chuỗi cung cấp thực phẩm thì đây có thể sẽ là nguy cơ
lớn về dịch bệnh cho người tiêu dùng.
Kết quả đề tài này cũng đã chế tạo thành công bộ kít phân tích phát hiện nhanh L.
monocytogenes. Bộ kít này cho kết quả phân tích tương đồng với các phương pháp tiêu chuẩn
như TCVN và ISO. Thêm nữa bộ kít còn có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay đang
sử dụng về giá thành, thời gian phân tích cũng như độ nhạy, độ đặc hiệu. Những ưu điểm này sẽ
góp phần tích cực vào việc giảm thiểu sự tạp nhiễm loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực
phẩm nhằm giảm tổn thất cho nhà sản xuất cũng như người tiêu dùng.
Tập thể hướng dẫn
Nghiên cứu sinh

TS. Lê Quang Hòa

PGS.TS. Tô Kim Anh

Phùng Thị Thủy


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là
listeriosis. Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi. Nếu không được
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sẩy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi
như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật.
Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm
lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản
hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên kh p thế giới đã
được thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây

bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như
không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về
dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả
năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam
vẫn là một ẩn số.
Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L. monocytogenes là phương pháp nuôi cấy.
Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, real-time PCR hoặc các phương pháp
miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời
của một số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật
gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước. LAMP là k thuật khuếch đại đ ng nhiệt
được sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản
ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp
đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tích. K thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng
để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới.
Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện Listeria
monocytogenes là phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được kh ng định
bằng các phản ứng sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử s c
1


ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu
cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong
thực tế sản xuất.
Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế
tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ
học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị
trường Việt Nam”.

2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án




Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân
lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại
thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP.

3. Những đóng góp mới của luận án



Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích

4. Bố cục của luận án
Luận án bao gồm 123 trang trong đó có 2 trang mở đầu, 38 trang tổng quan, 9 trang
vật liệu và phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết quả.
NỘI DUNG CHÍNH
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Tổng quan về L. monocytogenes.

Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L.
monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm
môi trường. Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh
listeriosis do L. monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau

trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài. Chính vì vậy
trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có
quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng.
1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp phân loại dƣới loài L. monocytogenes
Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể
thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học
các chủng L. monocytogenes gây dịch bệnh. Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên
kiểu gen hiện nay khá phổ biến. Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở
dữ liệu liên quan cho phân tích so sánh. MLST là một phương pháp phân loại dưới loài
đơn giản và được sử dụng khá phổ biến. Cơ sở dữ liệu cho phương pháp MLST khá phong
phú. Chính vì vậy luận án này sử dụng phương pháp MLST và sơ sở dữ liệu của viện
2


Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học các loài L. monocytogenes phân lập được.
Từ đó đánh giá nguy cơ gây dịch bệnh của loài vi khuân này trên thực phẩm Việt Nam.
1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp phát hiện L. monocytogenes
Hiện nay có khá nhiều các phương pháp được sử dụng trong phân tích phát hiện L.
monocytogenes. Ngoài các phương pháp tiêu chuẩn như phương pháp nuôi cấy theo ISO
hoặc TCVN còn có các phương pháp nhân gen như real-time PCR hoặc các phương pháp
sử dụng kít miễn dịch được tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên các phương pháp hiện nay có thời
gian phân tích khá dài hoặc yêu cầu sử dụng các trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa
đáp ứng được yêu cầu của việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực tế sản
xuất. Chính vì vậy Luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn
giản và đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao.
Chƣơng II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.


Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu thực phẩm

Mẫu được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội
Chủng vi sinh vật
Một số chủng vi khuẩn được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học - Công
nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
Hóa chất
- Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi
cấy vi khuẩn
Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L. monocytogenes
Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP
2.2.

Các thiết bị sử dụng chủ yếu

Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và
lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm
 Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho
giải trình tự
 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch
GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
 Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại
dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)
 Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen
được giải trình tự 2 chiều.
 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4
 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP
 Phản ứng Real-time PCR

 Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn
 Kiểm định bộ sinh phẩm
 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm
 Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 và ISO 112901:1996
3


Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân
lập từ một số thực phẩm Việt Nam

3.1.1. Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm
Trong nghiên cứu này, các mẫu thực phẩm được tăng sinh trên môi trường Half Fraser,
những mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình 1 Hình 3-1 A) được cấy trải
trên môi trường RAPID’L.mono (Biorad). Các mẫu thực phẩm dương tính với L.
monocytogenes là những mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 3-1 B) và có ít
nhất một khuẩn lạc nghi ngờ được kh ng định dương tính bằng k thuật PCR với cặp mồi
đặc hiệu LM1-LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp. (Hình 3-2).

1

A

2

B

Hình 3-1 Kết quả phân lập L. monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono.

A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu
đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu .
: Hình thái khuẩn lạc L. monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen
không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L. monocytogenes.

702 bp

Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định phân lập được
tr n môi trường RAPID’L.mono
: Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một
mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L. monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi
ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh
: thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TMcủa Fermentas

4


Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã
phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 3-1 sau.
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam
trong khoảng thời gian từ 0

Loại thực phẩm

đến 0

Số lƣợng
mẫu thực
phẩm

Số lƣợng chủng
phân lập đƣợc

Tỷ lệ nhiễm
(%)

Xúc xích

145

21

14,48

Các loại thịt hun khói

112

34

30,36

Thịt sống

43

1

2,33

Cá, tôm, cua, ốc

49

1

2,04

Bơ, sữa thanh trùng

45

1

2,22

Rau ăn sống

37

0

0

Sushi

52

1

1,92

Bánh mỳ kẹp thịt, hoa quả dầm

29

0

0

Nem chua

31

0

0

Tổng cộng

543

59

10,87

Có tổng số 59 543 mẫu được phát hiện là nhiễm L. monocytogenes. Trong đó các mẫu thịt
hun khói và xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao nhất.
3.1.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ
thực phẩm Việt Nam

Kết quả phân lập được 59 chủng L. monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống,
một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết
DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping
gene). Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen. Tổ hợp
các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone
complex - CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập.
Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được
trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen. Tổ hợp kiểu trình tự
7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và
thuộc một dòng giống. Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16
nhóm có kiểu ST khác nhau. Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình
tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã
từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới. Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô
5


hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000. Xây dựng được cây phân loại
như Hình 3-3.

Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L. monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm
Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L. monocytogenes phân
lập được từ thực phẩm Việt Nam
Chữ đen: Các chủng L. monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b
trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST

Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L. monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ
thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây
các vụ dịch lớn trên thế giới. Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt
với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại

Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997. Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng
phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993. Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các
chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các
vụ dịch nhỏ trên thế giới.
3.2.

Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP

3.2.1. Xây dựng phản ứng LAMP
3.2.1.1.

Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ

6


Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen inlJ của chủng chuẩn L.
monocytogenes EGD-e có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP. Kiểm tra độ
tương đồng của trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với các trình tự gen trên ngân hàng gen
bằng phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP của chủng
này có độ tương đồng khá cao với trình tự gen inlJ với các chủng L. monocytogenes đã được
công bố trên ngân hàng gen NCBI. Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi.
Lựa chọn các bộ mồi theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử
dụng phần mềm [ . Đã lựa
chọn được 8 bộ mồi như bảng 3-2.
Bảng 3 -2. Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ
Tên mồi
1-F3
1-B3

1-FIP
1-BIP
2-F3
2-B3
2-FIP
2-BIP
3-F3
3-B3
3-FIP
3-BIP
4-F3
4-B3
4-FIP
4-BIP
5-F3
5-B3
5-FIP
5-BIP
6-F3
6-B3
6-FIP
6-BIP
7-F3
7-B3
7-FIP
7-BIP
8-F3
8-B3
8-FIP
8-BIP

3.2.1.2.

Trình tự (5’-3’)
CATGGTTTCAAACCCGCT
AATGCTGCTGCTACCTCT
GTTGGTTGAGTTGAGCTTGTTTCTT-TTTAACATTCGCAGCAACG
ACACACTCAAAGCCGGTCAA-TTTT-AGCAAAATTGTCATCAGGAA
ACAAGCTCAACTCAACCAA
GTTATGGATGAATTATGGCAATC
TGTCATCAGGAAACCAGTCGTTA-TTTT-CTATAAAAAACACACTCAAAGCC
GCTTCAGAGGTAGCAGCAGC-TTTT-CTTGTTAGAGTAGCTAGTTGTTCT
GTTTCCTGATGACAATTTTGC
TTTGGCTAAGATCAAGGGT
AGTAGCTAGTTGTTCTTCGCTGAT-TTTT-AGAGGTAGCAGCAGCATT
TCATCCATAACCGATATGACTGGT-TTTT-GGTAATGTTGTTACTTGTGCA
TGCAAGCAACTGACACTA
GGGTTACGTCAAGGTTTGT
TACCAGTCATATCGGTTATGGATGA-TTTT-TCAGCGAAGAACAACTAGC
TTGCACAAGTAACAACATTACCACC-TTT-TTATTTGAATCACATGCCAGAT
GCGACACGAACAAACTCA
CAGTCTAAGGTTGTTAATTGAGT
ATTTCGGTTAAGGTGTTGCGC-TTTT-ATGTAAGTCAAAATCCACTGTT
ATGTCAGCCACAATACACAATTAAC-TTTT-GGTGTCACATCTAATTTGGTG
CCGCTTACAAAATTAACCTACT
AAGCTACAGTCTAAGGTTGT
TTGCGCGCGCAGTTTAAATAAG-TTTT-CGACACGAACAAACTCAC
CCGAAATAGATGTCAGCCACAATAC-TTTT-GGTGTCACATCTAATTTGGTG
GCACAGACAATCCAGCCGTA
GTTGCGTTATCTGGAGTAGTCG

GTCTTCTCCTTTGATGGGTTGAGG - ACGGAGCTATAGTAGGAACCGTA
TGGCGGATGATGAAGTTCTAAGC - CGCTAGAAGTATAAGGATCGTCCA
CATTACCACCCTTGATCTTAGC
AGGTTGTTAATTGAGTTTGTGG
TGTGAGTTTGTTCGTGTCG – CAAACCTTGACGTAACCCCGC
GCGCAACACCTTAACCGAAA – TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG

Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t

Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số
tinh khiết của L. monocytogenes EGD-e với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng. Sau đó,
điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-4.

7


Hình 3-4. Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L.
monocytogenes
Trong đ
, , ,
, 7, ,
0, ,
, ,
, 0,
, ,
7, ,
, ,

: , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific)
: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,

0 pg phản ứng
: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, 0: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi 7 lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng

Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn bộ mồi 8 cho các nghiên cứu tối ưu hóa tiếp
theo.
Phân tích tính phù hợp của mồi 8 cho thấy các mồi đều phù hợp tiêu chí thiết kế về khoảng
cách giữa các mồi, chiều dài mồi.
Để tìm các vị trí có thể biến đổi trong loài của trình tự nucleotit trên gen, chúng tôi tiến
hành so sánh trình tự mồi với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng GenBank của NCBI
bằng chương trình ClustalW và BlastN. Tại những vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi được
thay thế bằng nuceotit suy biến. Kết quả chạy kiểm tra các mồi được trình bày cụ thể trong
Bảng 3-3.
Bảng 3-3 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ tr n
ngân hàng gen NCBI

Trình tự

Tên
mồi
F3

CATTACCACCCTTGATCTTAGC

Vị trí thay đổi
CATTACTACTCTTGATCTTAGC

Số lƣợng
allele

Trình tự mồi sau thay
thế nucleotide suy biến

2

CATTACYACYCTTGATCTTAGC

1

CCACAAACTCAATTAACAACCT

2

CAAACCTTGAYGTAACCCCGC

CATTACCACCCTTGATCTTAGC
B3C

CCACAAACTCAATTAACAACCT

F2

CAAACCTTGACGTAACCCCGC

Mồi B3c nằm trong vùng bảo thủ
hoàn toàn
CAAACCTTGACGTAACCCCGC
CAAACCTTGATGTAACCCCGC

B2c

TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG

TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG
TCAGTTAATTGTGTATTGTGGCTG

2

TCRGTTAATTGTGTATTGTGGCTG

F1c

TGTGAGTTTGTTCGTGTCG

Mồi F1c nằm trong vùng bảo thủ
hoàn toàn

1

CGACACGAACAAACTCACA

B1

GCGCAACACCTTAACCGAAA

GCGCAACACCTTAACCGAAA
GCGCAACACCCTAACCGAAA

3.2.1.3.

2

GCGCAACACCYTAACCGAAA

T i ưu phản ứng LAMP

8


Ảnh hƣ ng của nhiệt độ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng
LAMP
Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betaine đến hiệu quả khuếch đại
của phản ứng LAMP. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-5.
Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9
M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3-5 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP.
Trong đ :

: DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific)
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, 7: Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
0, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, 7: Sản phẩm LAMP
C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng

Ảnh hƣ ng của th i gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP

Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 và 0,2
pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút. Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP
trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-6 dưới đây:

Hình 3-6 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP
Trong đ :
: DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);
: Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 pg phản ứng
, , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t

9


Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số
4). Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối
ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M.
3.2.1.4. Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP
Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L. monocytogenes. Kết quả
điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA
của các chủng thuộc loài L. monocytogenes là 100%.

Hình 3-7 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes
Trong đ :
: Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);
: Mẫu kiểm chứng âm t nh
, , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC
19117, L. monocytogenes EGD-e, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes
DSM20750;
đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm

Hình 3-8 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường
nhi m tạp trong thực phẩm
Trong đ :
: thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh
, , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC
19117, L. monocytogenes EGD-e, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes
DSM20750
đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L. innocua ATCC 0
L.
seeligeri ATCC 35967; L. welshimeri ATCC 35897; L. grayi ATCC 19120; L. ivanovii ATCC 19119;
Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B. subtilis 353B.

Xác định tính chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các loại vi khuẩn
thường nhiễm tạp trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B.
subtilis. Kết quả điện di (Hình 3-8) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100%
trên tập hợp các chủng thử nghiệm.
3.2.1.5.

ộ nhạy phản ứng LAMP

Tiến hành phản ứng LAMP ở các nồng độ DNA khác nhau. Kết quả cho thấy ngư ng phát
hiện của phản ứng LAMP là 50 fg/phản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng
(Hình 3-9).
10


Hình 3-9 Ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP đ i v i DNA tinh khiết của L. monocytogenes
Trong đ :
, , , , , và 7: Sản phẩm LAMP v i l n lượt , pg 0, pg
0 fg

của chủng L. monocytogenes EGD-e
8: Mẫu âm t nh
: Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific .

0 fg

fg

fg 1, fg DNA

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN
Trong đ :
7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt 0 fg

fg

fg

fg

fg

u

hu g L. monocytogenes

EGD-e

Kết quả trên cho thấy độ nhạy của hai phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP nghiên cứu
tương đương nhau.

3.2.1.6.

So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b

Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi
tham chiếu đã được công bố trình tự. Kết quả thể hiện trên Hình 3-10.

11


Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i các
phương pháp LAMP phát hiện L. monocytogenes đã được công b
Trong đ : -): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh
1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-7 dung dịch DNA ban đ u
2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-6 dung dịch DNA ban đ u
3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-5 dung dịch DNA ban đ u
4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-4 dung dịch DNA ban đ u
L: DNA ladder (Sangon Biotech)
A: Phản ứng LAMP v i mồi iap
B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA
C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA
D: Phản ứng LAMP v i bộ mồi LAMP inlJ trong nghiên cứu này

Kết quả trên cho thấy bộ mồi LAMP của gen inlJ trong nghiên cứu này cho độ nhạy tốt
nhất (kết quả dương tính ở độ pha loãng DNA là 10-6).
3.2.2. Xây dựng quy trình tăng sinh
nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trư ng L. monocytogenes

3.2.2.1.

Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau. Sau 16 giờ
nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR. Đánh giá khả năng tăng
sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể
hiện trên Bảng 3-4 sau:
Bảng 3-4

nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong
canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

Loại
môi
trƣ ng
cơ bản

TSBYE TSBYE
có
không
Kháng
có
sinh
kháng
sinh

BLEB
có
kháng
sinh

BLEB
không

có
kháng
sinh

Half
fraser
có
kháng
sinh

UVM
không
có
kháng
sinh

LEB
có
kháng
sinh

LEB
không
có
kháng
sinh

Ct

21,40

± 1,20

15,71
± 1,52

23,94
± 0,97

14,26
± 1,16

21,47
± 2,01

18,29
± 1,45

25,77
± 1,78

24,57
± 1,13

12


Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang
nhau. Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi
trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic
acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5.

Bảng 3-5

nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L.
monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

Loại
trƣ ng
Ct

môi BLEB có kháng sinh
31,57 ± 0,98

Half fraser có kháng sinh
33,29 ± 0,68

Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB được chọn là môi trường cơ bản cho tăng sinh
L. monocytogenes.
3.2.2.2.

nh hư ng của một s
monocytogenes

thành ph n môi trường đến sự sinh trư ng của L.

Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men

Hình 3-12 nh hư ng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes
trong môi trường LE

canh trường thu n

Tăng sinh với lượng giống ban đầu 3 x 104 CFU ml. Sau 4 giờ nuôi, đo độ đục canh
trường ở bước sóng 600 nm.
Từ kết quả Hình 3-13, nồng độ cao nấm men 6 g l được chọn cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Ảnh hưởng của nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển của L. monocytogenes

Nhiễm chủ động L. monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với
nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102 CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh
trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm. Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt
cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l. Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa
chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l.
3.2.2.3.

nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes

Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4
giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 3-14 sau:
13


Hình 3-13 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes trong môi trường LE

canh trường thu n

Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L.
monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý
nghĩa). Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế

của các kháng sinh ở nồng độ thấp.
3.2.2.4.

nh hư ng của kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi khuẩn khác

Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn
E. coli, Staphylococcus aureus và Lactobacillus plantarum ở 3 nồng độ 2,5; 5 và 10 mg l
trong môi trường BLEB đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, với nồng độ kháng sinh 5
mg l cho khả năng ức chế tốt trên cả 3 loài vi khuẩn nghiên cứu. Qua thí nghiệm này chúng
tôi chọn nồng độ 2 loại kháng sinh acriflavin và acid nalidixic đều là 5 mg l.
Bảng 3-6 nh hư ng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi sinh vật chỉ
thị trong môi trường LE

Loài vi khuẩn

E. coli

Th i gian tăng sinh
(gi )

canh trường thu n

0

3

5

7

Không kháng sinh

0,116

0,373

0,653

0,655

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,116

0,105

0,096

0,231

Acriflavin (5 mg/l)

0,124

0,144

0,138

0,138

Acriflavin (10 mg/l)

0,115

0,105

0,103

0,087

Nadilixic (2,5 mg/l)

0,122

0,142

0,104

0,123

Nadilixic (5 mg/l)

0,112

0,114

0,09

0,083

Nadilixic (10 mg/l)

0,121

0,134

0,071

0,109

Không kháng sinh

0,031

0,596

2,357

4,5

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,03

0,039

0,034

0,045

Acriflavin (5 mg/l)

0,039

0,041

0,037

0,047

Staphylococcus
Acriflavin (10 mg/l)
aureus

0,033

0,031

0,03

0,047

Nadilixic (2,5 mg/l)

0,024

0,035

0,036

0,038

Nadilixic (5 mg/l)

0,025

0,042

0,036

0,037

Nadilixic (10 mg/l)

0,025

0,036

0,036

0,047

Không kháng sinh

0,144

ND

2,254

2,959

Lactobacillus

14


plantarum

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,148

ND

1,722

1,743

Acriflavin (5 mg/l)

0,134

ND

0,114

0,147

Acriflavin (10 mg/l)

0,137

ND

0,162

0,131

Nadilixic (2,5 mg/l)

0,118

ND

0,541

0,943

Nadilixic (5 mg/l)

0,117

ND

0,142

0,055

Nadilixic (10 mg/l)

0,123

ND

0,138

0,052

ND: Không xác định

Thử nghiệm t ng sinh tr n mẫu thực phẩm

3.2.2.5.

Mẫu xúc xích hun khói được đồng hóa trong môi trường BLED, bổ sung 2 loại kháng
sinh là acriflavin và acid nalidixic với nồng độ mỗi loại là 5 mg l và 10 mg l. Nhiễm chủ
động với mật độ 10 CFU bình có chứa 100 ml hỗn dịch đồng hóa. Sau 12 giờ tăng sinh,
lấy 1 ml canh trường tăng sinh tiến hành tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR. Kết
quả thể hiện trên Bảng 3-7.
Bảng 3-7 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự t ng sinh của L. monocytogenes
trong môi trường LE c bổ sung cao n m men, pyruvate và v i sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong
mẫu c ch

Mẫu

Acriflavin và nalidixic acid

Acriflavin và nalidixic acid

(5 mg/l)

(10 mg/l)

22,7 ± 1,04

26,17 ± 1,17

Ct

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng
tăng sinh L. monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l.
3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA
Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết
đượ đá h giá thô g qu giá trị
Ct ủ phả ứ g re l-time PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết
à g lớ .
3.2.3.1. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết
o
hợp si u âm và gia nhiệt
C
Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần
lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian
gia nhiệt ở 95 °C (2-15 phút); thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa
DNA cho phản ứng Real-time PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3-8 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes.

Nồng độ triton X100 (%)
Ct

0,6

1,2

1,8

2,4

15,56 ± 1,01

15,41 ± 0,63

15,93 ± 1,20

15,98 ± 0,78

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

15


Bảng 3-9 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00

Th i gian xử lý
nhiệt (phút)
Ct

2

5

10

15

15,92± 0,51

15,56 ± 1,04

15,61 ± 1,12

15,73 ± 0,75

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-10 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00.

Th i gian siêu âm
(phút)

Không
siêu âm

0,5

1

2

4

Ct

21,22 ±
0,63

18,35 ±
1,01

17,74 ±
0,81

15,72 ±
0,53

16,23 ±
0,22

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ triton X100 là 1,2%;
gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút.
3.2.3.2.

Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp

o
si u âm và gia nhiệt
C

Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần
lượt thay đổi từng yếu tố: thời gian gia nhiệt ở 95 °C (5-20 phút); nồng độ NaOH (10mM 200mM), thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng
Real-time PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3-11 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian (phút)

5

10

15

20

Ct

21,53 ± 1,12

21,86 ± 0,45

21,13 ± 1,21

21,89 ± 1,04

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-12 nh hư ng của nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes

Nồng độ NaOH (mM)
Ct

10

30

70

100

150

200

22,73 ±
1,02

22,40 ±
0,64

21,86 ±
0,73

20,65±

0,52

20,79 ±
0,91

20,37 ±
0,85

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

16


Bảng 3-13 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian siêu âm (phút) 0
Ct

20,72
± 1,12

0,5

1

2

3

4

19,46 ± 17,72 ± 16,35 ± 16,81 ± 18,93
0,71
1,04
0,54
0,84
± 0,97

Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ NaOH là 100 mM;
gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút,
So sánh các phương pháp tách chiết nghi n cứu đ i v i canh trường L.
monocytogenes thu n không c mẫu thực phẩm
Dùng 3 phương pháp tách chiết DNA (2 phương pháp sử dụng NaOH và Triton X100 đã
tối ưu ở trên và 1 phương pháp sử dụng kít tách chiết thương mại GeneJET Genomic DNA
Purification Kit). Mỗi phương pháp tách chiết thực hiện trên 3 mẫu. Thực hiện phản ứng
real-time PCR với DNA thu được từ 3 phương pháp tách chiết trên. Kết quả trình bày ở
Hình 3-15
3.2.3.3.

Hình 3-14 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường thu n của
các quy trình sử dụng NaOH, Triton X 00 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA
Purification Kit.

Kết quả cho thấy trong canh trường thuần khả năng tách chiết DNA của 3 phương pháp
trên không chênh lệch nhau nhiều, Ct hơn kém nhau khoảng 1 chu kỳ.
3.2.3.4.

ánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đ i v i mẫu thực phẩm
t ng sinh

Thí nghiệm được thực hiện với mẫu xúc xích được nhiễm chủ động, tách chiết theo 4
phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết ở trên và phương pháp tách chiết
thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực hiện phản ứng Real-time PCR. Kết quả
trình bày tại Hình 3-16 sau.

17


33

Ct
30
27
24
21
18
15
NaOH

Tri ton

Ki t

Thông thường

Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh
mẫu

c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET

Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường.

Kết quả phân tích cho thấy khả năng tách chiết DNA từ mẫu xúc xích bằng phương
pháp sử dụng kít cho kết quả tách chiết tốt nhất. Hai phương pháp sử dụng NaOH và
phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết quả tách chiết tương đương nhau. Phương pháp
tách chiết DNA thông thường làm sạch DNA rất tốt, tuy vậy qúa trình tách chiết khá phực
tạp mất nhiều thời gian và sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích
trong thực tế khi số mẫu lớn.
Kết quả này cho thấy nếu mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ng n, mật độ ban đầu
thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh sạch cao (real-time PCR) thì cần sử
dụng phương pháp tách chiết DNA có công đoạn làm sạch tốt như phương pháp kít hoặc
phương pháp thông thường để đảm bảo kết quả phân tích không bị âm tính giả. Ngược lại
nếu mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen và thêm nữa có những phản ứng
nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh sạch không quá cao (LAMP) thì có thể sử dụng phương
pháp tách chiết đơn giản (NaOH hoặc Triton X100) cho đơn giản mà vẫn hiệu quả.
Trong nghiên cứu sử dụng bi từ g n kháng thể để cô đặc và làm sạch vi khuẩn sau giai
đoạn tăng sinh. Tuy nhiên hiệu quả làm sạch và cô đặc L. monocytogenes từ mẫu thực
phẩm sau tăng sinh cho hiệu quả không cao, nên kết quả cụ thể không được trình bày trong
phần kết quả của luận án này. Tuy nhiên trong thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ và
tách chiết DNA từ vi khuẩn thu được, kết quả cho thấy sử dụng đệm glycine-tris pH 8,3
theo khuyến cáo của nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả năng tách chiết DNA tốt hơn
so với NaOH 100 mM. Chính vì vậy trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành so
sánh khả năng tách chiết DNA từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo 2
phương pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện đã được tối ưu ở trên và sử dụng
đệm glycine-Tris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tương tự. DNA sử dụng cho phản ứng realtime PCR. Kết quả thể hiện trên Hình 3-17.

18


Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng

sinh mẫu

c ch khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH 8,3 và Triton
X 100

Từ kết quả trên phương pháp tách chiết được lựa chọn trong nghiên cứu này là sử dụng
đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 oC trong 5 phút, siêu âm 2 phút.
3.2.3.5.

nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP

Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU/25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho
phản ứng real-time PCR và LAMP. Kết quả thể hiện ở Bảng 3-14 sau:
Bảng Error! No text of specified style in document.-14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh
trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và
real-time PCR

Thể tích mẫu (ml)
Real time PCR

1

10
ức chế

+

20

30

ức chế

ức chế

LAMP (quan sát kết tủa sản Khó phát
phẩm phụ bằng m t thường)
hiện

+

+

+

LAMP (điện di sản phẩm)

+

+

+

+

Xác định sản phẩm LAMP
bằng phản ứng màu với HNB

+

+

+

+

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thể tích mẫu lấy đi phân tích là 10 ml
3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n các nền mẫu khác nhau
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14
giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP. Kết quả thể hiện trên Hình 319

19


Hình 3-17 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L.
monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ
Trong đ :
(- Mẫu âm t nh phản ứng LAMP
, , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L. monocytogenes.
, , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ. 7, , : l n lượt là mẫu
c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ.
0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ.
, : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu
sữa và mayonair là ≥ 12 giờ.

3.2.4. Đề xuất quy trình phân tích
Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích L. monocytogenes
dựa trên phản ứng LAMP như sau:
Tăng sinh chọn lọc
37oC/12 gi

Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g/3 phút, gia nhiệt 95 oC/5
phút, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g/2 phút)

Thực hiện phản ứng LAMP 65oC/40-60 phút; 80oC/5
phút

Đọc kết quả

Hình 3-18 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes được phát triển trong nghi n cứu này
20