“Nghiên cứu tạo sunfate betaglucan từ nấm mem saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem
saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều
trị ung thư”
Sinh viên thực hiện
Ngành
Giảng viên hướng dẫn

: Trần Thị Hồng
: Công nghệ sinh học
: TS. Lã Thị Huyền
Trưởng phòng công nghệ TB động vật
Viện Công nghệ sinh học
TS. Nguyễn Hữu Đức
Khoa Công nghệ sinh học
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

“Khóa luận đệ trình khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông
nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ
sinh học, năm học 2015 – 2016.”

HÀ NỘI, 2016
1

MỤC LỤC

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do chính tôi trực
tiếp thực hiện.
Các số liệu và kết quả được công bố trong khóa luận là hoàn toàn trung
thực, chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

Trần Thị Hồng

tháng

năm 2016



TÓM TẮT


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận
tịnh tôi hoàn thành luận văn này:
TS. Lã Thị Huyền, trưởng phòng Công nghệ TB động vật sinh học – Viện Công
nghệ sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh

nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
ThS. Nguyễn Thị Hạnh, kĩ thuật viên phòng Công nghệ TB động vật – Viện Công
nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí
nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ íchvà các cán bộ phòng Công nghệ
tế bào thực vật đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Đức – Phó
trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học động vật –
Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã luôn bên
cạnh, chỉ bảo, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa
luận.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học,
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá
trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ và toàn thể những
người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi
trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Trần Thị Hồng




Phần I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Thực tại, hàng năm trên thế giới từ các nhà máy chế biến rượu, bia, thực phẩm ủ
chua... đã thải ra một lượng bã thải khổng lồ. Hầu hết những sản phẩm lên men
này chỉ được dùng để chế biến thức ăn cho động vật, làm phân cải tạo đất hoặc để
xử lý nước thải tạo khí sinh học hay được dùng như một nguồn vật liệu rẻ tiền để
sản xuất dịch chiết nấm men tự phân. Trong khi đó, nguồn bã thải men bia cung
cấp một lượng rất lớn nấm men Saccharomyces cerevisiae giàu dinh dưỡng cần
tận dụng cho các mục đích khác như tách các beta-glucan, các peptids có hoạt tính
sinh học hay làm thức ăn chăn nuôi,…(Nguyễn Mạnh khải, 2012; Vương Thị Việt
Hoa và cs, 2006).
Trong thành tế bào nấm men beta-glucan chiếm 50-60% trọng lượng khô, nguồn
chất rắn này được bán làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi với giá thành rẻ. Chính
vì vậy mà việc sẳn xuất sản phẩm phụ có giá trị kinh tế như beta-glucan có thể
mang lại lợi nhuận cao cho các nhà máy, xí nghiệp, đồng thời còn góp phần làm
giảm thiểu tác động về mặt môi trường từ những khu công nghiệp này. Nhiều nước
trên thế giới như Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản.... cũng tiến hành tách chiết betaglucan sạch từ tế bào nấm men để sử dụng như một yếu tố kích thích miễn dịch
tiềm ẩn và tác động tích cực đến hệ thống bảo vệ vật chủ, tăng tính đè kháng của
vật chủ đối với phần lớn các loại bệnh nhiễm khuẩn, nấm,virus.
Ngoài ra, beta-glucan còn được chứng minh có khả năng điều hòa miễn dịch và
thay đổi sự tiến triển của bệnh ung thư thực nghiệm. Những quan sát này đã kích
thích nghiên cứu các ứng dụng y sinh học tiềm năng của polymer beta glucan. Một
trở ngại lớn cho việc sử dụng lâm sàng của beta glucan là khả năng hòa tan trong
nước. Các hạt beta glucan từ nấm men không hòa tan trong nước. Do đó năm
1991, William D.L và cộng sự đã công bố một phương pháp phosphoryl hóa


glucan tạo ra glucan hòa tan trong nước với hiệu suất gắn nhóm phosphate 70%.
Năm 1992, chính ông đã công bố trên tạp chí Carbonhydrate research về phương
pháp tạo sulfate glucan hòa tan với hiệu suất đạt 98%. Sau đó rất nhiều nghiên cứu
về hoạt tính sinh học của sulfate glucan áp dụng phương pháp tạo sulfate glucan
của Williams (được liệt kê dưới đây). Năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc

công bố một phát minh sáng chế số CN102633903A nêu ra một phương pháp khác
tạo sulfate beta-glucan.
Nhận thấy đây là một hướng đi hoàn toàn mới ở Việt Nam và có khả năng ứng
dụng rất cao nên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem saccharomyces serevisae
làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”

1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu.
1.2.1. Mục đích
- Tách chiết thành công beta-glucan từ thành tế bào nấm men bia
- Tạo thành công sunfate beta-glucan từ beta-glucan, đồng thời tìm phương
-

pháp xác định hàm lượng sunfate hóa sau phản ứng.
Kiểm tra sự tác động của sunfate beta-glucan tới sự phát triển của tế bào
ung thu nhằm góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho điều trị ung thư hiện
nay.

1.2.2. Nội dung
- Tách chiết hợp chất beta-glucan từ nấm men bia sacchromyces serevise.
- Sunfate hóa beta-glucan tạo sunfate beta-glucan.
- Nuôi cấy tế bào ung thư dạ dày, ung thư vú
- Bổ sung hợp chất sunfate beta-glucan với các nồng độ khác nhau vào môi
trường nuôi cấy tế bào ung thư để theo dõi sự tác động.

Phần II. Tổng quan tài liệu


2.1. Giới thiệu về chủng nấm men sacchromyces cerevisiae.
2.1.1. Định nghĩa

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất
có trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh vật thuộc
chiSaccharomyceslớpAscomycetesngànhnấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu
dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được
dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, và bia(Feldmann, Horst,
2010).
2.2.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm men sacchromyces cerevisiae
Tế bàonấm menSaccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng (Hình
1), có kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào
tử. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose,
saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng axit amin và muối amon
như nguồn nitơ.

Hình 1. Hình ảnh tế bào nấm men từ bã men bia được soi dưới kính hiển vi vật kính 40X,
thị kính 10X


2.2. Giới thiệu về hợp chất beta-glucan
2.1.2. Tổng quan về các loại beta-glucan từ nấm men bia saccharomyces
cerevisiae.
- β-Glucanlà các polysaccharide tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn
với nhau qua liên kết β-glycoside 1,2; 1,3; 1,4 hoặc 1,6,...
-

Các con số 1-6 là số thứ tự của các nguyên tử Cacbon (C) trong phân tử
glucose bắt đầu từ C của nhóm aldehyt CHO. Dạng đồng phân D hoặc L chỉ
dạng không gian “tuyệt đối”.

-

Căn cứ vào vị trí của H và OH ở C bất đối mang số thứ tự lớn nhất (nhóm
OH ở bên tay phải là cấu hình D). Các đường D-glucose trong dung dịch
chúng tồn tại chủ yếu là cấu trúc vòng, cấu trúc này hình thành do phản ứng
giữa nhóm aldehyt (C-1) với nhóm OH ở vị trí C5 tạo thành vòng 6 cạnh.
Khi tạo vòng, ở vị trí C-1 của glucose có thêm 1 nhóm OH, gọi là OH
glucosid, C này trở thành cacbon bất đối, do đó có thêm 2 đồng phân mới là
α và β. Gọi là α nếu OH-glucosid ở phía dưới vòng (cùng phía với OH của
C-5), gọi là β nếu OH-glucosid ở phía trên vòng (khác phía với OH của C5) (Hình 2). Nhóm OH-β-glucosid của C-1 kết hợp với OH của các C-3/C4/C-6 ở phân tử β-D-glucose khác tạo nên các liên kết β-D-1,3/1,4/1,6glycosid (Hình 3).

Hình 2. Cấu trúc của các dạng đồng phân Glucose


A

B
Hình 3. Cấu tạo của β-glucan
A: Cấu tạo của các (1,3/1,4) β-Glucan, các glucan này tìm thấy ở vỏ ngũ cốc, lúa
mỳ, yến mạch. B: Cấu tạo của các (1,3/1,6) β-Glucan, loại glucan này có nhiều ở
nấm men và các loại nấm ăn.

Hình 4. Các dạng cấu trúc khác nhau của β-glucan
Hình 4. Tổng hợp các dạng cấu trúc glucan khác nhau: bao gồm β-(1,3)-D-glucan
mạch thẳng, β-(1,3;1,4)-D-glucan mạch thẳng, mạch nhánh β-(1,3;1,2)-D-glucan,
mạch nhánh β-(1,4;1,6)-D-glucan, mạch nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, mạch nhánh


trên nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, β-(1,2)-D-glucan mạch vòng, β-(1,3;1,6)-Dglucan mạch vòng (Laura Barsanti et al., 2011). Beta glucan từ nấm men và các
nấm dược liệu được chú ý vì khả năng kích thích tăng cường miễn dịch của chúng.
2.2.2. Cấu tạo và chức năng của β-glucan thành tế bào nấm men
a. Cấu tạo của hợp chất beta-glucan.

β-glucan thành tế bào nấm men là β-(1,3/1,6)-D-glucan, có cấu trúc mạch chính là
(1,3)-β-D-glucan và mạch nhánh (1,6)-β-D-glucan. Các nhánh được gắn vào vòng
glucopyranose tại C-6 của mạch chính tạo thành một cấu trúc duy nhất (Lessage &
Bussey, 2006) (Hình 1.9). Các phân tử (1,3)-β-D-glucan hình thành cấu trúc chuỗi
xoắn ba (tridimension) với đặc điểm đàn hồi, đảm bảo sức mạnh của thành tế bào
nấm men (Klis et al., 2002) và khả năng hấp thụ các chất độc (Yiannikouris et al.,
2004). (1,6)-β-D-glucan là một cầu nối (linker) giữa (1,3)-β-D-glucan, chitin và
các mannoprotein (Kaptein et al, 1999; Kollar et al, 1997) đảm bảo ổn định toàn
bộ cấu trúc tế bào và là nguyên nhân chính của thành tế bào nấm men không tan.
Ngoài ra, nấm men còn chứa một hỗn hợp (1,4)-α-(1,3)-β-D-glucan, đây là một
loại glycogen giống tinh bột, hòa tan trong kiềm, là một polysaccharid dự trữ năng
lượng trong tế bào chất của tế bào, khó hòa tan trong axit, chúng đôi khi mắc kẹt ở
thành tế bào (Hình 6).
b. Chức năng của beta-glucan thành tế bào nấm men saccharomyces
serevisiae
Với cấu trúc phân nhánh β-(1,3/1,6)-D-glucan, β-glucan thành tế bào nấm men
được cho là có khả năng kích thích tăng cường miễn dịch mạnh nhất. Có rất
nhiều các thụ thể của chúng trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như đã trình
bày ở trên, do đó khi vào cơ thể chúng kích hoạt các tế bào này không những
tăng về số lượng mà còn làm cho các tế bào này hoạt động mạnh mẽ đáp ứng lại
những tác nhân nguy hại cho cơ thể. Bên cạnh đó, β-(1,3/1,6)-D-glucan cũng đã
được chứng minh có khả năng kích thích hoạt động hệ miễn dịch, hấp thụ các gốc


tự do, các chất độc giúp giải độc cho cơ thể cũng như làn da. β-(1,3/1,6)-Dglucan cũng đã được chứng minh làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu,…
Với những chức năng đó, β-(1,3/1,6)-D-glucan được ứng dụng trong rất nhiều
lĩnh vực: làm thực phẩm tăng cường miễn dịch, kem dưỡng da, thực phẩm hỗ trợ
điều trị mỡ máu, tiểu đường, tá dược cho vaccine,…
2.2.3.Các quy trình phân tách β-glucan từ nấm men Saccharomyces serevisiae
Trong số cácβ-glucan,Saccharomyces serevisiae được nghiên cứu nhiều nhất với

nhiều quy trình công nghệ tách chiết khác nhau. Do β-glucan định vị ở thành tế
bào nấm men nên để tách chiết β-glucan bước đầu tiên cần phải ly giải tế bào để
tách phần thành tế bào không hòa tan khỏi tế bào chất; bước thứ hai là tách chiết
β-glucan từ thành tế bào không hòa tan. Có một vài phương pháp để phân giải tế
bào nấm men bao gồm phương pháp hóa học, vật lý và phương pháp sử dụng
enzyme. Các chất hóa học thường được sử dụng là NaOH, HCl, acetic acid, citric
acid… Hầu hết các trường hợp sử dụng chất hóa học đều được xử lý ở nhiệt độ
cao (Pelizon et al., 2005; Hunter et al., 2002). Phương pháp vật lý được sử dụng là
siêu âm, đồng nhất với áp suất cao… (Shokri et al., 2008; Boonraeng et al.,
2000). Nhóm phương pháp cuối cùng để phá hủy tế bào nấm men là sử dụng
enzyme tự nhiên, các enzyme phá hủy thành tế bào nấm men, vì vậy mà phần hòa
tan của tế bào chất sẽ chui qua các lỗ hổng trên bề mặt tế bào. Phương pháp sử
dụng enzyme được chia làm 2 nhóm: thứ nhất là tự phân giải thông qua hoạt động
của enzyme nội sinh, quá trình này là sự thủy phân của các polymer sinh học nội
bào dưới tác dụng của các enzyme thủy phân liên quan đến sự chết của tế bào. Quá
trình tự phân giải được bắt đầu khi các lysosome giải phóng enzyme phân cắt vào
tế bào chất, và kéo dài trong vài ngày (Vosti et al., 1954). Thứ hai là dùng các vi
sinh vật có khả năng sử dụng polymer sinh học của thành tế bào nấm men như là
nguồn cung cấp dinh dưỡng, đồng thời chúng cũng sản xuất ra các enzyme để
đồng hóa thành tế bào nấm men (Ferrer, 2006; Adamisch et al., 2003). Arturas
Javmen và cộng sự (2012) đã sử dụng dịch nuôi cấy của chủng Actinomyces


rutgersensis 88 tạo ra phức hợp các enzyme để phân giải thành tế bào. Trong dịch
nuôi cấy Actinomyces rutgersensis 88 có các enzymes laminarinase (β-1,3),
licheninase (β-1,3; 1,4), gentibiosinase (β-1,6), β-glucanase (β-1,3; 1,6),
mannanase (α-1,6; 1,2; 1,3), galactomannanase (β-1,4), chitinase (β-1,4),
proteinase (-CO-NH-) (Гуреева, 1983).
Cụ thể, Hojjatollah Shokri và cộng sự (2008) đã phát triển một quy trình tối
ưu để tách chiết và tinh chế beta-glucan. Lúc đầu, các tế bào nấm men đã được

phát triển trong môi trường thạch dextrose sabouraud và sau đó được nuôi trong
môi trường chứa dịch chiết nấm men, peptone, glucose (YPG). Sau khi ủ, các tế
bào được thu hoạch, rửa và bị phá vỡ bằng các phương pháp siêu âm. Thành tế bào
thu được được dùng để thu nhận beta-glucan hòa tan bằng phương pháp xử lý với
kiềm/axit. Về vấn đề này, 2% sodium hydroxide (NaOH) và axit axetic 3% đã
được sử dụng trong chiết xuất axit kiềm, tương ứng. Kết quả sản phẩm còn chứa
2,4% protein. Trong bước tiếp theo, DEAE sephacel sắc ký đã được sử dụng để
loại bỏ các protein còn lại. Sau đó tiếp tục cho lên cột concanavalin A-Sepharose
để loại bỏ mannan.
Khác với Hojjatollah Shokri, Bahl và cộng sự (2009) chọn phương pháp tách
chiết tạo β-glucan trọng lượng phân tử thấp hòa tan thông qua việc xử lý tế bào
nấm men với kiềm và axit ở nhiệt độ cao để thu β-glucan tổng số, sau đó thủy
phân chúng với enzyme endoglucanase và dùng phương pháp lọc thu nhận phân tử
β-glucan trọng lượng nhỏ (Patent 7550584).
Xiao-YongLiu và cộng sự (2006) đã đưa ra phương pháp tách chiết β-D-glucan từ
thành tế bào S. cerevisiae bao gồm bước tự phân giải, xử lý với nước và dung môi
hữu cơ, đồng nhất và thủy phân bởi protease. So với các phương pháp truyền
thống, phương pháp này đã làm tăng hiệu suất, độ tinh sạch và giữ được cấu trúc
tự nhiên của β-D-glucan. Hơn nữa phương pháp này không làm ô nhiễm môi
trường và dễ thực hiện ở quy mô công nghiệp. Kết quả thu được hiệu suất 91%
thành tế bào nấm men ban đầu với độ tinh sạch là 93% (W/W).


Cho đến nay các nghiên cứu về beta-glucan nấm men vẫn đang tiếp diễn nhưng xu
hướng tập trung vào vấn đề kích thước của glucan cũng như độ hòa tan trong nước
của chúng. Sulfate beta-glucan hòa tan trong nước cũng được các nhà khoa học hết
sức quan tâm.

2.3.Sulfate beta-glucan từ nấm men Saccharomyces serevisiae
2.3.1.Tổng quan Sulfate beta-glucan

Beta glucan được phân tách từ các tế bào Saccharomyces cerevisiae như trên đã
trình bày chúng có rất nhiều tác dụng có lợi trong việc điều trị các bệnh do vi
khuẩn, virus và nấm gây ra. Glucan cũng đã được chứng minh có khả năng điều
hòa miễn dịch và thay đổi sự tiến triển của bệnh ung thư thực nghiệm. Những
quan sát này đã kích thích nghiên cứu các ứng dụng y sinh học tiềm năng của
polymer beta glucan. Một trở ngại lớn cho việc sử dụng lâm sàng của beta glucan
là khả năng hòa tan trong nước. Các hạt beta glucan từ nấm men không hòa tan
trong nước. Do đó năm 1991, William D.L và cộng sự đã công bố một phương
pháp phosphoryl hóa glucan tạo ra glucan hòa tan trong nước với hiệu suất gắn
nhóm phosphate 70%. Năm 1992, chính ông đã công bố trên tạp chí
Carbonhydrate research về phương pháp tạo sulfate glucan hòa tan với hiệu suất
đạt 98%. Sau đó rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của sulfate glucan áp
dụng phương pháp tạo sulfate glucan của Williams (được liệt kê dưới đây). Năm
2012, các nhà khoa học Trung Quốc công bố một phát minh sáng chế số
CN102633903A nêu ra một phương pháp khác tạo sulfate beta-glucan.
Vậy sulfate glucan là gì và có tác dụng như thế nào?
Sulfate beta-glucan là các (1,3/1,6)-β-D-glucan được gắn thêm nhóm sulfate vào
các vị trí C2, C4, C6 (Hình 6). Sau khi gắn nhóm sulfate chúng trở nên hòa tan
trong nước và thể hiện các hoạt tính riêng.


Hình 6. Cấu trúc của β-glucantrong thành tế bào nấm men (Godfrey C.C. et al.,
2009)
2.3.2. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của sulfate betaglucan
a. Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối
Sulfate beta-glucan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính
chống đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất.Hoạt tính chống huyết khối
của sulfate beta-glucan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình nghẽn tĩnh
mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm (Alban S và cộng sự, 1995). Sulfate
-1,3-glucan thể hiện hoạt tính chống đông máu thấp hơn heparin trên một số thử

nghiệm in vitro. Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính kháng huyết khối bằng hoặc
mạnh hơn heparin khi thực hiện thí nghiệm in vivo, điều này có thể được giải thích
do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối của
Sulfate-1,3-glucan.
Susanne Alban và Gerhard Franz(2001)đã nghiên cứu sử dụng sunfat glucan với
hy vọng chúng có tiềm năng thay thế heparin. Kết quả là sunfat glucan thể hiện
các hiệu ứng chống đông rõ rệt; một số trong đó là hoạt động như heparin. Theo
các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc hoạt động, khối lượng phân tử (MW), hàm


lượng sulfate (DS), mô hình sulfate và cấu trúc polysaccharide cơ bản là các thông
số rất quan trọng cho hiệu lực chống đông của nó. Hàm lượng sulfate có ảnh
hưởng lớn đến hoạt tính kháng đông tụ máu của sulfate beta-glucan, hàm lượng
sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng lớn. Vị trí của các nhóm sulfate
trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ của sulfate
beta-glucan. Theo các nghiên cứu beta-glucan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-4 có
hoạt tính kháng đông tụ. Trọng lượng phân tử sulfate betaglucan cũng có ảnh
hưởng lên hoạt tính kháng đông tụ máu của chúng. Với beta-1,3-glucan với DS>1
và trọng lượng phân tử tử 18 và 50 kDa được chứng minh là giải pháp phù hợp
nhất cho kết quả giống heparin (Susanne Alban và Gerhard Franz, 2001).
Như vậy, có thể thấy rằng sulfate betaglucan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm
thuốc chống đông máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và
dược liệu mà hầu như không có tác dụng phụ
b. Hoạt tính chống virus
Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của sulfate
beta-glucan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” yếu tố gây độc tế
bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem
xét sử dụng trong y học lâm sàng. Sulfate beta-glucan từ Pleurotus tuberregium cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2, RSV, virus cúm A mà
không gây độc cho tế bào (Zhang và cộng sự., 2004).
Các tác dụng ức chế đối với virus suy giảm miễn dịch ở người (virus HIV) trong

thử nghiệm in vitro của sulfate (1,3)-β-D-glucan đã được nghiên cứu. (1,3)-β-Dglucan, được sulfate bởi acid piperidin-N-sulfonic trong dimethyl sulfoxide cho
sulfate (1,3)-β-D-glucan với nhiều kích thước phân tử và các nhóm lưu huỳnh
khác nhau. Sulfate (1,3)-β-D-glucan với hàm lượng lưu huỳnh trong 14,4% ức chế
hoàn toàn việc lây nhiễm HIV trong một nồng độ thuốc thấp 3,3 µg/ml. Nhóm
sulfate được đưa vào vị trí C6, C4 và C2 tương ứng. Đây là một trong những
polysaccharide chống virus AIDS mạnh nhất (Takashi Yoshida và cộng sự, 1990).


Ngoài ra, sulfate beta-glucan có khả năng ức chế sinh sản của virus H1N1 SIV và
hoạt động của neuraminidase(Sun Ying-feng và cộng sự, 2015)
c. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch
Hoạt tính kháng u của nhiều polysacaride đã được công bố trong những năm gần
đây. Những thử nghiệm in vitro và in vivo đối với sulfate (1,3)-beta-D-glucan của
Poria cocos cho thấy dẫn xuất này có tác dụng chống u báng 180 (S-180) và làm
biến dạng tế bào ung thư biểu mô dạ dày (MKN-45 và SGC-7901), trong khi tác
dụng kháng u này không xuất hiện ở (1,3)-beta-D-glucan tự nhiên (Wang Y và
cộng sự, 2004). Sulfate glucan có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá
trình di căn khối u.
Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của sulfate glucan đã được thử
nghiệm in vivo. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sulfate glucan từ S.cerevisia có thể
kích thích sự tăng sinh tủy xương của chuột sau khi tiêm tĩnh mạch (Williams DL
và cộng sự, 1992). Ngoài rasulfate glucanở liều thích hợp có thể thúc đẩy đáng kể
các tế bào lympho tăng sinh, tăng cường kháng thể, làm tăng khả năng sản xuất
interleukin-2 (IL-2) và interferon-γ (IFN-γ) trong huyết thanh gà, cải thiện đáng kể
hiệu quả miễn dịch của vắc-xin, phòng bệnh Newcastle, và sẽ là ứng cử viên
chocác tá dược miễn dịch (Mi Wang và cộng sự, 2014). Sulfate glucantăng cường
các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào, tế bào giết tự nhiên
(NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu máu
cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo.
d. Hoạt tính chống oxy hóa

Rất nhiều công bố cho thấy rằng Sulfate beta-glucan thể hiện hoạt tính chống oxy
hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro và in vivo. Nó là một chất chống oxy
hóa tự tuyệt vời để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do. Tác dụng ức chế
sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) của Sulfate beta-glucan từ Saccharomyces cerevisiae đã được
nghiên cứu bởi Na Lei và cộng sự, 2015, kết quả cho thấy, Sulfate beta-glucan cải


thiện đáng kể catalase trong huyết thanh, các hoạt động của glutathione
peroxidase (GSH-Px) và giảm malondialdehyde (MDA) cấp ở chuột. Hoạt tính
chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của Sulfate
beta-glucan. Những kết quả này chỉ ra rằng Sulfate beta-glucan với thấp MW và DS
có chất chống oxy hóa tốt hơn và hoạt động miễn dịch tốt hơn.Cả khối lượng phân
tử và hàm lượng sulfate của sulfate beta-glucan đều đóng vai trò rất quan trọng
trong việc tác động lên các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane)
dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL.
e. Giảm lipid máu
Sulfate beta-glucan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axít sialic, nó có thể làm
tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của
cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Các
nghiên cứu in vivo trên chuột béo phì cho thấy Sulfate betaglucan sợi nấm
Ganoderma lucidum làm giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDLC mà không có tác dụng phụ gây tổn hại cho gan và thận (Kim và cộng sự, 2014).
Hoạt tính giảm lipid máu của Sulfate betaglucan phụ thuộc vào trọng lượng phân
tử của chúng, trọng lượng phân tử càng thấp thì hoạt tính càng cao.
f. Hoạt tính chống viêm
Năm 2006, Groth I và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của Sulfate
beta-glucan bán tổng hợp. Kết quả cho thấy Sulfate beta-glucan có khả năng ức
chế sự tăng số lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị viêm, hiệu quả chống viêm
của Sulfate beta-glucan trong mô hình này không bị ảnh hưởng nhiều bởi hàm
lượng sulfate. Ngoài ra Sulfate betaglucan còn bảo vệ dạ dày, Sulfate beta-glucan
như là một tác nhân chống viêm loét và ức chế kết dính với vi khuẩn Helicobacter

pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày), bảo vệ tế bào gan và ức chế sự
tăng sinh tế bào gan hình sao.
Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng
chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của Sulfate beta-glucan, Nghiên cứu về
hoạt tính sinh học của Sulfate beta-glucan đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho


ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm
chức năng, dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác
dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ
dày, tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, sản phẩm thuốc
kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch… Như vậy có thể thấy, Sulfate
betaglucan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng
hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự
quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới.

2.2.3. Phương pháp tạo sunfate beta-glucan từ beta-glucan nấm men
Phương pháp của D.L. Wiliams 1991, quá trình tạo sulfate glucan hòa tan đã được
chuẩn bị như sau: 2,4 g của vi hạt glucans nấm men được hòa tan trong 200 ml
dimethyl sulfoxide (DMSO) chứa 6 M urea. 32 ml axit sulfuric đậm đặc được nhỏ
dần dần vào dung dịch.Dung dịch được đun nóng đến 100 ° C trong 6 h. Một tinh
thể kết tủa (ammonium sulfate?) hình thành ở 90 phút. Sau đó, dung dịch được
làm lạnh đến nhiệt độ môi trường xung quanh và pha loãng trong 4 l nước tinh
khiết, Pyrogen-miễn phí, nước khử ion thu được từ một hệ thống lọc nước
(Millipore, Bedford, MA).


Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thực tập
Thời gian

 Khóa luận được tiến hành từ 08/2016 đến ngày 12/2016.

Địa điểm nghiên cứu
 Phòng Cộng nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học – Viện hàn lâm

khoa học Việt Nam.
 Khoa Công nghệ sinh học thuộc Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.

3.2. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn nấm men bia (saccharomyces serevisiae).

3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Vật liệu
3.3.2. Dụng cụ, hóa chất