Nghiên cứu tách protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên ircinia mutans theo phương pháp kết tủa bằng ethanol, acetone và ammonium sulfate

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
*************

TRẦN THỊ KIỀU TRANG

NGHIÊN CỨU TÁCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT HẢI MIÊN
Ircinia mutans THEO PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA BẰNG
ETHANOL, ACETONE VÀ AMMONIUM SULFATE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Nha Trang, tháng 7 năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
*************

TRẦN THỊ KIỀU TRANG

NGHIÊN CỨU TÁCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT HẢI MIÊN
Ircinia mutans THEO PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA BẰNG
ETHANOL, ACETONE VÀ AMMONIUM SULFATE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD: TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

Nha Trang, tháng 7 năm 2016


PHIẾU ĐÁNH GIÁ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Lớp: 54 CBTS

Họ và tên sinh viên: Trần Thị Kiều Trang

Ngành : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Tên đề tài: “Nghiên cứu tách protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải
miên Ircinia mutans theo phương pháp kết tủa bằng Ethanol, Acetone và
Ammonium sulfate.”
Số trang:66

Số chương: 04

Số tài liệu tham khảo: 53

Hiện vật: quyển đề tài tốt nghiệp, đĩa CD.
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................

Kết luận: ..........................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
Nha trang, ngày 18 tháng 7 năm 2016
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Ký và ghi rõ họ tên)


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập tại Trường đại học Nha Trang đến nay em đã hoàn
thành báo cáo tốt nghiệp. Để hoàn thành bài báo cáo này bên cạnh những nổ lực không
ngừng của bản thân em còn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của quý thầy cô và mọi
người xung quanh. Em xin chân thành cảm ơn:
* Ban giám hiệu trường Đại học Nha trang, ban chủ nhiệm khoa công nghệ thực
phẩm đã tạo điều kiện để em được thực hiện đề tài này.
* Các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em. Đặc
biệt là thầy TS.Huỳnh Nguyễn Duy Bảo người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
* Các cán bộ quản lí phòng thí nghiệm của trung tâm thí nghiệm thực hành, các
anh chị học viên cao học cùng các bạn sinh viên đã giúp đỡ để em hoàn thành tốt bài
báo cáo này.
* Gia đình, bạn bè và mọi người xung quanh đã khuyến khích, động viên em
vượt qua khó khăn trong suốt thời gian qua.
Trong suốt quá trình thực hiện cũng như hoàn thành bài báo cáo này mặc dù đã
rất cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót rất mong nhận được sự đóng
góp ý kiến của quý thầy cô cùng các bạn để bài báo cáo của em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 18 tháng 7 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Kiều Trang


ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...........................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài. ...................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................4
1.1. Giới thiệu về hải miên...........................................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc.......................................................................................................4
1.1.2. Phân loại hải miên ..........................................................................................4
1.1.3. Môi trường sống .............................................................................................5
1.1.4. Đặc điểm sinh học của hải miên. ....................................................................6
1.1.5. Hình thức sinh sản của hải miên.....................................................................8
1.1.5.1. Sự sinh sản vô tính ...................................................................................8
1.1.5.2. Sự sinh sản hữu tính .................................................................................9
1.1.6. Ứng dụng của hải miên.................................................................................10
1.1.7. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hải miên.......................................11
1.1.8. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới và Việt Nam. ..........................13
1.1.8.1. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới ..........................................13

1.1.8.2. Tình hình nghiên cứu hải miên tại Việt Nam.........................................15
1.2. Các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong hải miên...................................16
1.2.1. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa, khả năng chống oxy hóa của protein. ..... 16
1.2.1.1. Quá trình oxy hóa. ..................................................................................16
1.2.1.2. Chất chống oxy hóa................................................................................17
1.2.1.3. Khả năng chống oxy hóa của protein. ....................................................19


iii

1.2.2. Những hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa trong hải miên ........................20
1.2.2.1. Nhóm các hợp chất phenol .....................................................................21
1.2.2.2. Nhóm hợp chất sterol .............................................................................21
1.2.2.3. Nhóm hợp chất flavonoid.......................................................................22
1.2.2.4. Nhóm hợp chất saponin..........................................................................22
1.2.2.5. Nhóm hợp chất polypeptide ...................................................................22
1.2.2.6. Nhóm hợp chất glycoside.......................................................................23
1.3. Các phương pháp dùng để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa. ............................23
1.3.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH. ......... 23
1.3.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử ....................24
1.3.3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ
Lipid/FeCl/H202 ......................................................................................................24
1.3.4. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide ...25
1.3.5. Phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC).......................................................25
1.4. Các phương pháp định lượng protein..................................................................26
1.4.1. Định lượng protein theo phương pháp Biure................................................26
1.4.2. Định lượng protein bằng phương pháp Lowry ( Biure cải tiến)...................27
1.4.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford ..........................................27
1.4.4. Định lượng protein theo phương pháp quang phổ........................................28
1.5. Các kĩ thuật chiết tách hợp chất chống oxi hóa có trong hải miên. ...................29

1.5.1. Nguyên lí chung............................................................................................29
1.5.1.1. Phá vỡ tế bào ..........................................................................................29
1.5.1.2. Chiết rút protein......................................................................................29
1.5.2. Một số phương pháp chiết tách chất có hoạt tính sinh học trong hải miên ..29
1.5.2.1. Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)..29
1.5.2.2. Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao (Pressurised liquid
extraction)............................................................................................................30
1.5.2.3. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) .31
1.5.2.4. Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction)..32


iv

1.6. Các phương pháp tinh sạch chất có hoạt tính sinh học trong hải miên...............33
1.6.1. Các loại tạp chất............................................................................................33
1.6.2. Các phương pháp tinh sạch protein ..............................................................34
1.6.2.1. Kết tủa protein ........................................................................................34
1.6.2.2. Ly tâm.....................................................................................................37
1.6.2.3. Thẩm tích................................................................................................37
1.6.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel....................................................................39
1.6.2.5. Phương pháp sắc ký trao đổi ion ............................................................40
1.6.2.6. Phương pháp sắc ký ái lực......................................................................40
1.6.2.7. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein ................................................40
2.1. Nguyên liệu và hóa chất......................................................................................42
2.1.1. Nguyên liệu...................................................................................................42
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................42
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................42
2.2.1. Bố trí thí nghiệm chiết protein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans theo
điều kiện chiết tối ưu của Võ thị Kim Thuyền ( 2015)...........................................43
2.2.2. Bố trí thí nghiệm tách protein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans bằng

muối ammonium sulfate. ........................................................................................45
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tách proein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans bằng
ethanol và acetone...................................................................................................47
2.2.4. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm làm giàu protein bằng phương pháp lọc li tâm
qua màng 3 kDa Amicon® Ultra-0.5 và sấy chân không thăng hoa. ....................48
2.3. Các phương pháp phân tích.................................................................................50
2.3.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH ...............................50
2.3.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử...............................................50
2.3.3. Phương pháp Lowry .....................................................................................50
2.4. Các máy móc, thiết bị sử dụng ........................................................................50
2.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu thực nghiệm...........................................50
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................51


v

3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết hải miên Ircinia mutans. ...51
3.2. Ảnh hưởng của các phương pháp kết tủa đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy
hóa của protein tách từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans. ......................................52
3.3. Ảnh hưởng của phương pháp lọc li tâm qua màng 3 kDa Amicon® Ultra-0.5
đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của protein tách từ dịch chiết hải miên
Ircinia mutans theo các phương pháp khác nhau.......................................................54
3.4. Ảnh hưởng của phương pháp sấy chân không thăng hoa đến hoạt tính chống oxi
hóa của protein tách từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans theo các phương pháp kết
tủa khác nhau..............................................................................................................58
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .....................................................61
4.1. KẾT LUẬN .........................................................................................................61
4.2. ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ......................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................62
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
K í hiệu viết tắt

Diễn giải

DPPH

:

2,2 diphenyl-1picrylhydrazyl

DPPH-H

:

2,2 diphenyl-1picrylhydrazine

AS

:

Ammonium sulfate

VTM C

:

Vitamin C

CKTH

: Chân không thăng hoa

NL/DM

: Nguyên liệu / dung môi.


vii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Các kiểu xương gai ở hải miên........................................................................5
Hình 1.2. Tổ chức cơ thể hải miên .................................................................................7
Hình 1.3. Các kiểu hệ thống hút và thoát nước ở hải miên ............................................8
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH ....................23
Hình 1.5. Phản ứng Biure .............................................................................................26
Hình 1.6. Phản ứng lowry ............................................................................................27
Hình 1.7. Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối..................................35
Hình 2.1. Hải miên Ircinia mutans................................................................................42
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết protein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans...........43
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách protein từ dịch chiết hải miên Ircinia
mutans bằng muối ammonium sulfate...........................................................................45
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách protein từ dịch chiết hải miên Ircinia
mutans bằng ethanol và acetone. ...................................................................................47
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm làm giàu protein bằng phương pháp lọc li

tâm qua màng 3 kDa Amicon® Ultra-0.5 và sấy chân không thăng hoa.....................49
Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của dịch
chiết từ hải miên Ircinia mutans. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần
thí nghiệm ± SD.............................................................................................................51
Hình 3.2. Hiệu suất tách protein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans bằng các
phương pháp kết tủa bởi ethanol, acetone và ammonium sulfate. Số liệu trên đồ
thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). .................................................................52
Hình 3.3. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của protein
kết tủa từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans bằng các phương pháp khác nhau.
Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác
nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ..........................................53


viii

Hình 3.4. Hàm lượng protein tách từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans theo các
phương pháp khác nhau trước và sau khi lọc li tâm qua màng 3 kDa Amicon®
Ultra-0.5. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các
ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................55
Hình 3.5. Khả năng khử gốc tự do DPPH của protein tách từ dịch chiết hải miên
Ircinia mutans theo các phương pháp khác nhau, trước và sau khi lọc li tâm qua
màng 3 kDa Amicon® Ultra- 0.5. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3
lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê (P < 0.05). .................................................................................................................56
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của protein tách từ dịch chiết hải
miên Ircinia mutans theo các phương pháp khác nhau, trước và sau khi lọc li tâm
qua màng 3 kDa Amicon® Ultra-0.5. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của
3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (P < 0.05). .......................................................................................................57

Hình 3.7. Hàm lượng protein có trong 1mg mẫu protein sấy tách từ dịch chiết hải
miên Ircinia mutans theo các phương pháp khác nhau sau khi sấy chân không
thăng hoa. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các
ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................58
Hình 3.8. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của protein tách từ dịch chiết hải miên
Ircinia mutans theo các phương pháp khác nhau, trước và sau khi sấy chân không
thăng hoa. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các
ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................59
Hình 3.9. Tổng năng lực khử của protein tách từ dịch chiết hải miên Ircinia
mutans theo các phương pháp khác nhau, trước và sau khi sấy chân không thăng
hoa. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự
khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ..................................60


1

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đại dương là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với
hơn 300.000 loài thực động vật. Đây là nguồn cung cấp vô số các sản phẩm
tự nhiên quý giá từ các loài sinh vật biển như rong biển, ruột khoang, rêu
biển, thân mềm và các loài vi khuẩn biển. Trải qua hàng tỷ năm tiến hóa, các sinh
vật biển đã tự hình thành nên các hợp chất hóa học vô cùng phức tạp hoạt động
như một hệ thống phòng vệ hóa học. Rất nhiều hợp chất có những đặc tính quý
báu, tiềm tàng cho việc chế tạo thuốc chữa bệnh cho con người được phát hiện từ những loài
sinh vật biển đặc biệt, khác thường hoặc ở những điều kiện sống khắc nghiệt [10].
Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương, nơi có nguồn đa dạng sinh học
vô cùng phong phú. Biển Việt Nam với dải bờ chạy dài trên 3260 km, diện tích trên 1
triệu km2, hàng năm đem lại nguồn lợi trên 2 triệu tấn trong số hơn 90 triệu tấn hải sản
của thế giới, đồng thời cũng là hệ sinh thái rất đặc thù và được đánh giá là một trong

16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới. Cùng với các nghiên cứu tổng thể về
hệ sinh thái biển, các nhà khoa học cũng đã có những nghiên cứu cơ bản về tiềm năng
tài nguyên sinh vật biển. Kết quả đáng chú ý là đã xác định được danh mục gần 12.000
loài sinh vật biển Việt Nam, bao gồm cả động và thực vật. Các nghiên cứu đã chứng
minh nguồn lợi hải sản Việt Nam phong phú đa dạng bao gồm khoảng trên 2.000 loài
cá, gần 6.000 loài động vật đáy, 653 loài tảo, 5 loài rùa, 12 loài rắn biển.... Đây là một
điều kiện thuận lợi không chỉ để nước ta phát triển đa dạng các ngành kinh tế biển và
ven biển mà còn là điều kiện thuận lợi để chúng ta nghiên cứu, khai thác các chất có
hoạt tính sinh học từ nguồn sinh vật biển ở Việt Nam [10].
Hải miên là một trong số các loài sinh vật biển được xếp đầu danh sách đối với
việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng trong dược
phẩm do sự đa dạng trong các cấu trúc hóa học của chất chuyển hóa có trong chúng.
Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây phát hiện ra những hợp chất có hoạt tính
sinh học từ hải miên như chất chống oxy hóa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn,
chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV [48].


2

Ở Việt Nam có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài hải miên cùng với các động
vật ký sinh sinh sống và phát triển. Tuy nhiên các nghiên cứu về hoạt chất sinh học từ
hải miên vẫn còn khá mới mẻ, những nghiên cứu, đánh giá cũng như ứng dụng các
hoạt tính sinh học của hải miên ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa khai thác được
nguồn tài nguyên biển vô cùng quý giá này, mặt dù giá trị mà nó mang lại là rất lớn,
đặc biệt là giá trị vệ mặt y tế, dược phẩm. Để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên quý
giá này, việc nghiên cứu tách chiết và tinh chế các hoạt chất sinh học từ hải miên là rất
cần thiết và đó là lý do tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tách protein có hoạt tính chống oxi
hóa từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans theo phương pháp kết tủa bằng ethanol,
acetone và ammonium sulfate ”từ đó làm cơ sở để hoàn thiện quy trình tách chiết, tinh
chế các chất chống oxy hóa từ hải miên ứng dụng trong lĩnh vực y học.

2. Mục tiêu của đề tài
- Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa ( khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng
lực khử) và hiệu suất tách protein từ dịch chiết hải miên Ircinia mutans.
- Thử nghiệm làm giàu protein bằng phương pháp lọc tâm qua màng 3 kDa
Amicon® Ultra-0.5 và sấy chân không thăng hoa.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy tiềm năng của hải miên nói riêng và
các sinh vật biển nói chung.
+ Đóng góp thêm cơ sở khoa học về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ
hải miên Ircinia mutans ở vùng biển Việt Nam.
+ Góp phần khuyến khích các công trình nguyên cứu, tìm tòi các loài sinh vật
chưa được biết đến dưới đại dương nhằm bổ sung 1 lượng kiến thức khoa học lớn cho
nhân loại và nâng cao được giá trị của các loài sinh vật đó, cũng như lợi ích mà đại
dương đem lại cho chúng ta.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử
dụng các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết , tinh chế từ hải miên Ircinia
mutans cũng như các loài hải miên khác trong y, dược học và đời sống con người, góp


3

phần nâng cao giá trị sử dụng của hải miên. Thành công của đề tài mở ra một hướng
mới trong việc sản xuất các loại sản phẩm chức năng và các loại thuốc dùng trong y
học nhằm nâng cao sức khỏe con người.


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về hải miên
1.1.1. Nguồn gốc
Hải miên hay còn gọi là bọt biển thuộc ngành thân lỗ (Porifera), có nguồn gốc
từ trùng roi cổ áo, độc lập về nguồn gốc với các động vật đa bào nguyên thủy khác. Nó
thuộc ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách biệt. Cỏ thể gồm các
tế bào sắp xếp lỏng lẻo, giữa các tế bào ít có mối liên hệ thần kinh. Các tế bào cổ áo lót
trong các phòng tiêm mao và tạo nên dòng nước chảy từ ngoài qua thành cơ thể vào
xoang vị giả rồi qua lỗ thoát nước. Phần lớn sinh sống ở biển, được tìm thấy ở Đại
Dương sâu nhất. Chúng có lịch sử địa chất cổ xưa nhất trong thời kỳ tiền Cambri
(khoảng 750 triệu năm trước) [10].
Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5000 loài hải miên, nhưng người
ta cho rằng có hơn 8000 loài hải miên trên Trái Đất [29]. Ở Việt Nam đã phát hiện
khoảng 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú
Quốc, Côn Đảo.
Hải miên là một dạng sống chính ở đáy biển, bao gồm hệ sinh thái rạn san hô,
rất khó được biết đến vì thường lẫn trong các rạn san hô nổi bật hơn, hoặc sống trong
vùng nước sâu và trầm tích mềm. Tuy nhiên có rất nhiều loài hải miên hơn san hô.
Tốc độ tăng trưởng của hải miên và tuổi thọ của chúng rất khác nhau. Một số
loài thân mềm đang phát triển rất nhanh chóng và chúng được đo với số tuổi là hơn
1000 năm tuổi.
1.1.2. Phân loại hải miên
Đặc điểm cơ bản để phân loại hải miên là dựa vào hình thái cấu tạo của xương
gai (Hình 1.1); dựa vào đó có thể chia hải miên ra làm 3 lớp:
+ Lớp Calcarea (Hải miên đá vôi): đặc điểm là các gai xương cấu tạo bằng chất
vôi màu trắng đục, gồm hầu hết các hải miên có gai xương bằng CaCO3 sống bám trên
đá ven bờ biển.


5

+ Lớp Hexatinellida (Hải miên sáu tia/ Hải miên thủy tinh): gồm các hải miên
có gai xương trong suốt như thủy tinh, gai đặc trưng là có dạng sáu tia và được cấu tạo
bằng SiO2.

Hình 1.1. Các kiểu xương gai ở hải miên [7].
+ Lớp Demospongia (Hải miên sừng): gồm các hải miên có gai xương cấu tạo
bằng SiO2 hoặc sponging hoặc cả hai loại, một vài loài không có gai xương, lớp này
chiếm 80% số lượng loài hải miên và khoảng 50 loài tìm thấy ở nước ngọt.
1.1.3. Môi trường sống
Hải miên hầu như là có mặt trên toàn thế giới, chúng sống trong các môi trường
sống dưới đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới [15]. Đa số chúng sống ở
vùng biển yên tĩnh, bởi vì sóng hoặc dòng nước khuấy động lớp trầm tích sẽ chặn các
lỗ chân long làm cho chúng khó khăn trong việc ăn và thở [14]. Phần lớn hải miên


6

thường được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, tuy nhiên một số loài có thể gắn
vào các lớp trầm tích mềm.
Hải miên ở vùng biển ôn đới tuy dồi dào hơn nhưng lại ít đa dạng hơn so với ở
vùng nhiệt đới, có thể vì các nguồn thức ăn của hải miên ở vùng biển nhiệt đới có
nhiều loại và phong phú hơn [15]. Hải miên thủy tinh là phổ biến nhất ở vùng biển Bắc
cực, sâu trong vùng biển ôn đới và nhiệt đới, . Demosponges và hải miên đá vôi
phong phú và đa dạng ở các vùng nước không phân cực nông hơn [16].
1.1.4. Đặc điểm sinh học của hải miên.
Hải miên là động vật đa bào thấp, cấu tạo cơ thể không tương đồng với các
nhóm động vật đa bào khác như cơ thể chưa có kiểu đối xứng ổn định, chưa có lỗ
miệng, chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh. Ngày nay, các nhà khoa
học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người ta cho rằng có hơn 8.000 loài

hải miên trên Trái đất [29]. Phần lớn hải miên sống ở biển, chỉ có khoảng 150 loài
sống ở nước ngọt. Màu sắc, hình dáng và kích thước của cơ thể khác nhau tùy theo
loài, từ vài milimet tới vài mét. Trong cơ thể chúng có hai chức năng sinh lý khác nhau
là tiêu hóa và sinh sản, hai chức năng này được một số tế bào chuyên hóa đảm nhiệm
và hoạt động độc lập với nhau; các tế bào này xếp thành hai lớp của thành cơ thể: lớp
ngoài là lớp biểu mô gồm các tế bào biểu mô dẹt (pinacocytes) và lớp trong gồm các tế
bào cổ áo (choanocytes).
Mỗi tế bào cổ áo sinh ra một chiên mao hướng vào trong, sự hoạt động nhịp
nhàng của các chiên mao tạo nên các dòng nước từ ngoài xuyên vào bên trong cơ thể
theo các lổ hút nước và nước từ bên trong cơ thể được đưa ra ngoài theo lổ thoát nước
ở cực trên của cơ thể. Dòng nước vào mang theo oxy và thức ăn được các tế bào cổ áo
bắt lấy và tiêu hóa, các chất không tiêu hoá được sẽ theo dòng nước ra ngoài qua lổ
thoát nước (Hình 1.2).


7

A: Sơ đồ cấu tạo cơ thể kiểu Asconoid.

B: Chi tiết một tế bào cổ áo.

Hình 1.2. Tổ chức cơ thể hải miên [7].
Giữa lớp biểu mô và lớp tế bào cổ áo là lớp trung gian ở trạng thái keo không
có cấu tạo tế bào, rải rác trong lớp này có các loại tế bào như tế bào hình sao, tế bào
sắc tố, tế bào sinh gai và tế bào amip (cổ bào). Cổ bào là loại tế bào chưa phân hóa và
nó có chức năng hình thành những tế bào khác khi cần thiết.
Tùy theo tính chất phức tạp của hệ thống hút nước và thoát nước người ta chia
cấu tạo của hệ thống này ra làm bốn kiểu: kiểu asconoid, syconoid, leuconoid và
rhagon (Hình 1.3). Theo sự ước tính, mỗi cơ thể hàng ngày có thể lọc 4.000 lít nước để
lấy thức ăn và muối khoáng, mỗi năm có thể tạo được 100 gram gai xương mới.

8

Hình 1.3. Các kiểu hệ thống hút và thoát nước ở hải miên [7].
1.1.5. Hình thức sinh sản của hải miên.
Hải miên vừa có khả năng sinh sản vô tính vừa có khả năng sinh sản hữu tính;
sự sinh sản vô tính giống như ở các động vật bậc thấp còn sự sinh sản hữu tính được
thực hiện như những động vật đa bào bậc cao [7].
1.1.5.1. Sự sinh sản vô tính
Sự sinh trưởng và phát triển của hải miên đều có liên quan đến sự sinh sản vô
tính. Những loài sống ở nơi có dòng chảy mạnh và ở những nơi có nhiều sóng thường


9

có khả năng sinh sản vô tính rất cao. Loại tế bào có vai trò quan trọng trong quá trình
sinh sản vô tính là cổ bào (archaeocyte), nó là loại tế bào chưa phân hóa và có khả
năng phân hóa để hình thành nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể; do đó có khả
năng tổ chức lại cơ thể. Hai hình thức sinh sản vô tính gặp ở hải miên là sự nẫy chồi và
sự sinh mầm trong:
* Sự nẫy chồi (budding): Ðây là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở hải miên và
thường gặp nhất ở dạng asconoid và syconoid. Chồi là những khối u lồi lên ở khắp bề
mặt của cơ thể, nhưng thường xuất hiện ở phần đế nhiều hơn, chồi càng ngày càng lớn
lên và có đầy đủ hai lớp tế bào; khi sự phát triển đã hoàn tất chồi tự tách rời cơ thể mẹ
ở phần đế và bám vào đá hoặc các động vật trong nước và phát triển hình thành cơ thể
mới. Phần lớn chồi không tách rời cơ thể mẹ mà phát triển trên cơ thể mẹ hình thành
tập đoàn càng ngày càng có kích thước lớn.
* Sự sinh mầm trong (gemmule formation): Thường gặp ở những hải miên
nước ngọt. Vào mùa thu cổ bào tập trung thành mầm trong. Mầm trong có hai lớp vỏ

sừng đóng kín, giữa hai lớp vỏ là lớp không khí cách nhiệt. Ðến mùa đông hải miên
chết, mầm trong rơi xuống đáy nước sống tiềm sinh cho đến hết mùa đông; khi mùa
xuân đến, các tế bào phá vở 2 lớp vỏ sừng rồi chui ra ngoài và phát triển thành hải
miên mới.
1.1.5.2. Sự sinh sản hữu tính
Hầu hết hải miên là lưỡng tính. Trứng và tinh trùng được hình thành trong cùng
một cơ thể từ các cổ bào nhưng ở những thời gian khác nhau nên thời gian trưởng
thành của các giao tử khác nhau, tinh trùng trưởng thành trước nên phải xảy ra quá
trình thụ tinh chéo giữa hai cơ thể. Tinh trùng của cơ thể này sẽ theo dòng nước qua lỗ
thoát nước ra ngoài và tìm đến lổ hút nước của cá thể kia và theo dòng nước vào bên
trong tìm trứng và tiến hành thụ tinh. Quá trình thụ tinh diễn ra rất phức tạp.
Sự phát triển của hợp tử: Hợp tử phát triển trong cơ thể một thời gian rồi ra
ngoài hình thành ấu trùng sống tự do gọi là Amphiblastula. Sau một thời gian bơi lội
tự do, Amphiblastula bám vào các giá thể như vỏ ốc, đá, cành cây trong nước.... Sau
đó, ở vị trí của phôi khẩu, các phôi bào lớn phân cắt tạo nên lớp biểu mô dẹp và các


10

phôi bào nhỏ tạo nên lớp tế bào cổ áo ở bên trong, tiếp theo là sự hình thành một lổ đối
diện với miệng phôi đó là lổ thoát nước. Hải miên đầu tiên được hình thành có dạng
asconoid, sau đó mới phức tạp dần qua các dạng khác.
1.1.6. Ứng dụng của hải miên.
Phần lớn hải miên được ứng dụng trong lĩnh vực y học. Hải miên đã được sử
dụng với hơn 5.300 sản phẩm khác nhau và mỗi năm có hàng trăm hợp chất mới được
phát hiện. Hầu hết các hợp chất chứa hoạt tính sinh học từ hải miên có thể được phân
loại như kháng viêm, chống khối u, ức chế miễn dịch hoặc kháng virus, chống sốt rét,
thuốc kháng sinh [25]. Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên với sự hiện diện của các
chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải
miên. Các chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên với nhiều

chất chuyển hóa có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào,
chống viêm và hoạt tính kháng virus. Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành
công nghiệp dược phẩm để tạo ra các loại thuốc mới [6].
Bên cạnh đó hải miên còn được sản xuất thành các hợp chất chống hà. Một lớp
cuối cùng của hợp chất bioactivem từ hải miên được sử dụng làm sơn chống hà.
Chúng không liên quan đến việc phát triển các loại thuốc mới, nhưng có thể thay thế
thân thiện với môi trường. Sơn chống hà tự nhiên từ phân tử hải miên gần đây đã được
xem xét và có thể cung cấp cho hoạt động chống gỉ ít độc hại hơn và cụ thể hơn [27].
Ngày nay người ta còn có nhu cầu sử dụng hải miên làm “bông tắm”. “Bông
tắm” từ hải miên có thể được định nghĩa là bất kì loài hải miên nào sở hữu sợi chỉ
spongin đó là các sợi đàn hồi làm từ collagen. Chất lượng của miếng hải miên dựa trên
chất lượng của bộ xương xốp. Các sợi mềm, bền và đàn hồi tốt sẽ có mức giá cao.
Bông tắm hiện đang được sản xuất bằng cách sử dụng hải miên Coscinoderma
matthewsi với sản lượng khoảng 12.000 miếng xốp/năm được bán tại địa phương cho
người dân và du khách ở Pohnpei, Micronesia. Hải miên sản xuất từ tự nhiên 100%
không sử dụng hóa chất khi chế biến. Việc nuôi trồng hải miên C. matthewsi được
thực hiện bởi Viện nghiên cứu môi trường của Pohnpei [23],[40].


11

Ngoài ra hải miên còn là bậc thầy của các kĩ sư xây dựng. Một vài loài hải miên
có bộ xương mềm oặt, nhưng số khác lại chế tác những cái lồng thuỷ tinh khiến các
nhà khoa học vật liệu phải ngỡ ngàng. Chúng là ý tưởng để từ đó ra đời các vật liệu
phỏng sinh học.
Từ các nghiên cứu ứng dụng trên, nhất là các ứng dụng trong ngành dược phẩm
thì việc nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các hợp chất có hoạt tính sinh học có
trong hải miên ở vùng biển Việt Nam là hướng đi đầy triển vọng góp phần đẩy mạnh
việc nghiên cứu chuyên sâu về hải miên cũng như ứng dụng vào các ngành dược
phẩm, mỹ phẩm,….

1.1.7. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hải miên
Hải miên là nhóm sinh vật còn ít được nghiên cứu ở Việt Nam. Tuy nhiên một
số kết quả nghiên cứu đã được công bố cho thấy tiềm năng của các loài hải miên thu
được tại Việt Nam. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong hải miên có chứa các chất có
hoạt tính sinh học như: chất chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng
virus,…. Hai hợp chất axit béo đa nối đôi chứa brôm mới axit 20-bromo(11E,15E,19E)-eicosa-11,15,19-triene-7,9,17-triynoic

vàaxit

22-bromo-(17E,21E)-

docosa-17,21-diene-9,11,19-triynoic được phân lập từ loài hải miên Xestospongia
testudinaria thu thập tại Trường Sa. Các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định trên các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
và nấm mốc Fusarium oxyporum với giá trị MIC là 50 mg/ml. Hợp chất axit 20bromo-(11E,15E,19E)-eicosa-11,15,19-triene-7,9,17-triynoic

từ loài hải miên X.

testudinaria . Tiếp theo, cũng từ loài hải miên X. testudinaria thu thập tại Trường Sa,
ba hợp chất sterol mới là aragusterol I , 21-O-octadecanoyl-xestokerol A và 7βhydroxypetrosterol cùng với aragusterol B , xestokerol A , 7α-hydroxypetrosterol, 7oxopetrosterol và petrosterol với cấu trúc đóng vòng propan tại C-26/C-27 của mạch
nhánh đã được phân lập và xác định cấu trúc vào năm 2013. Hợp chất aragusterol B
thể hiện hoạt tính chống bám cặn (antifouling) mạnh [5]. Trong khuôn khổ đề tài
Nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình
phân lập các chất có hoạt tính kháng ung thư của một số loài hải miên ở Việt Nam” đã
phát hiện được hơn 50 hợp chất từ 8 loài Hải miên: Dysidea cinerea Keller,


12

1889;

Mycale

plumosa

Hoshino,

1981;

Petrosia

nigricans

Lindgren,

1897;Amorphinopsis excavans Carter, 1887; Clathria vulpina Lamarck, 1814;
Ianthella basta;Stylissa flabelliformis Hentschel, 1912 và Haliclona subarmigera
Ridley, 1884. Trong đó, đã công bố được 03 công trình trên các tạp chí chuyên ngành
quốc tế ISI với 12 hợp chất mới từ hai loài Hải miên D. cinereavà P. nigricans. Đáng
chú ý là các hợp chất sesqitecpen mới dạng khung muurolan có cấu trúc hóa học độc
đáo và hứa hẹn thể hiện hoạt tính sinh học đáng quan tâm như: (4R,5R)-muurol1(6),10(14)-diene-4,5-diol,(4R,5R)-muurol-1(6)-ene-4,5-diol,

(4R,5R,10R)-10-

methoxymuurol-1(6)-ene-4,5-diol, (4S)-4-hydroxy-1,10-seco-muurol-5-ene-1,10-dione
, (4R)-4-hydroxy-1,10-seco-muurol-5-ene-1,10-dione , (6S,10S)-6,10-dihydroxy-7,8seco-2,8-cyclo-muurol-4(5),7(11)-diene-12-oic acid và (6R,10S)-6,10-dihydroxy-7,8seco-2,8-cyclo-muurol-4(5),7(11)-diene-12-oic acid. Tiếp theo các nghiên cứu bài bản
nêu trên, trong khuôn khổ nhiệm vụ Trọng điểm nghiên cứu về dược liệu biển thuộc
loài Hải miên trong đề án “Nghiên cứu tiềm năng về dược liệu biển vùng Đông Bắc
Việt Nam” đang được tiến hành tại Viện Hàn lâm KH&CN VN, 07 loài hải miên bao
gồm Dysidea fragilis, Haliclona oculata, Haliclona varia, Ircinia echinata, Ircinia sp.,

Acanthella obtusa, Tethya aurantium đã và đang được nghiên cứu về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học. Trong đó đáng chú ý có 5 hợp chất mới dysinidine I ,
dysinidine II , dysinidine III , dysinidin A và dysinidin B đã được phân lập và xác
định cấu trúc từ loài hải miên Dysidea fragilis. Kết quả này đã được công bố trên 02
công trình quốc tế ISI. Từ loài hải miên Haliclona oculata (Linnaeus, 1759) năm hợp
chất steroit và hai lipit bị brôm hóa là 3β-hydroxy-5-cholenic acid methyl ester,
stigmasta-5,24(28)-dien-3β,29-diol,

24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol,cholest-5-

en-3β,7β-diol, 24-vinylcholest-5-en-3β,24-diol, xestospongiene A và xestospongiene J
đã được phân lập và xác định cấu trúc. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên
08 dòng tế bào ung thư là HepG-2, KB, LU-1, MCF-7, LNCaP, HL-60, SK-Mel2 và
PC-3 cho thấy: Hợp chất stigmasta-5,24(28)-dien-3β,29-diol thể hiện hoạt tính khá
mạnh trên tất cả 02 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là KB và LU-1 với giá trị
IC50 tương ứng là 8,74 và 9,32 µM [9].


13

1.1.8. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới và Việt Nam.
Hiện nay hải miên đang là đối tượng được quan tâm trong lĩnh vực tìm kiếm
những nguồn dược liệu có nguồn gốc từ tự nhiên và đã thu được các kết quả tốt trong
việc tìm ra các hợp chất chống ung thư và một số bệnh khác. Một số nơi như ở New
Zealand đã tiến hành nuôi trồng một số hải miên có giá trị phục vụ cho mục đích
thương mại cũng như cho việc nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học [12].
1.1.8.1. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới
Trên thế giới, hải miên đã được biết đến và nghiên cứu từ khá lâu nhưng các
công trình nghiên cứu mang tính chiều sâu thì chỉ mới xuất hiện trong vòng 20 năm trở
lại đây. Nhiều chất chuyển hóa thứ cấp trong hải miên đã trải qua một quá trình chọn

lọc trong quá trình tiến hóa và chúng phải khắc phục hiện tượng pha loãng của nước
biển trong quá trình lọc nước vì vậy các hợp chất thường rất mạnh để có hiệu quả
trong môi trường biển [44]. Từ đó các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các
hoạt tính sinh học có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn trong hải miên cũng
như nghiên cứu ứng dụng những khả năng đó của hải miên vào trong y học để nâng
cao sức khỏe của con người. Một số nghiên cứu có liên quan đến hoạt tính chống oxy
hóa và kháng khuẩn trong hải miên:
Halliwell (1994), Chairman (2012) đã nghiên cứu một số chất chuyển hóa có
nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và
các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và
vitamin C [20], [28].
Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất
từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với
hydroxytoluene butylated (BHT) [30].
Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids,
polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính
chống oxy hóa cao [46].
Liu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các alkaloid
chiết từ hải miên thuộc chi Iotrochota đến từ vùng biển phía nam Trung Quốc. Đối


14

tượng nguyên cứu là alkaloid purpurone được phân lập từ các miếng hải miên
Iotrochota sp. Kết quả khảo sát cho thấy alkaloid purpurone là một chất chống gốc tự
do mạnh.
Nghiên cứu của Sepcic (2010) về các hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất
từ hải miên nhiệt đới. Trong nghiên cứu này họ đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc 66
chiết xuất được chiết từ 35 loài hải miên từ biển Caribbean (Curaçao) và từ tám loài từ
Great Barrier Reef (Đảo Lizard). Dịch chiết xuất đã được chuẩn bị trong các dung môi

hữu cơ và dung dịch nước và đã được thử nghiệm cho tán huyết, hemagglutinating,
kháng khuẩn và các hoạt động chống acetylcholinesterase (AChE), cũng như khả năng
của chúng để ức chế hoặc kích hoạt protein phosphatase tế bào 1. Họ kết luận rằng hầu
như tất cả các chất chiết xuất từ hải miên trong nghiên cứu này cho thấy chúng có ít
nhất là một hoạt tính, nhưng chỉ có vài loài đại diện đầy tiềm năng cho các nghiên cứu
về thành phần hoạt tính của chúng. Hầu hết các thành phần này là các hợp chất hữu cơ
mà hoạt tính không bị phá hủy bởi nhiệt [47].
Reddy và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa, chống
viêm và chống nấm của loài hải miên Subergargoria suberosa. Kết quả cho thấy acid
subergargoric 1 có tác dụng chống oxy hóa và viêm cao nhất và cũng cho thấy hợp
chất 7 có hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm cao hơn hợp chất 2. Những kết quả
này gợi ý rằng acid subergorgic cũng như các dẫn xuất của nó tương tự hợp chất 2 và
hợp chất 7 có tiềm năng lớn như một chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng chống
oxy hóa và chống viêm [45].
Orhan và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu các chất chiết xuất từ hải miên
của nhiều loài khác nhau trên biển Địa trung hải thuộc địa phận Thổ Nhĩ Kỳ. Kết quả
các chất chiết xuất hải miên cho thấy tính kháng khuẩn đáng chú ý, hoạt động chống
AChE và gốc tự do DPPH hiệu quả [42].
Các nghiên cứu trên cho thấy các hợp chất trong hải miên đều có hoạt tính
chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất trong hải miên phụ thuộc
vào loài, đặc điểm môi trường sống, các phương pháp và kỹ thuật tách chiết,… Bên
cạnh đó các nghiên cứu cũng cho thấy các tiềm năng ứng dụng của hải miên là vô cùng lớn.