Phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tửW10.2E42

TUYỂN TẬP BÀI TẬP PHỔ THÔNG, ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC
LUẬN ÁN-ĐỒ ÁN-LUẬN VĂN-KHOÁ LUẬN-TIỂU LUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

{{{


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

: Base pairs

CNSH

: Công nghệ sinh học

CTCLQG

: Chương trình chống lao quốc gia

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng)

EMB

: Ethambutol.

HRS

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin

HRSE

: Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol

INH

: Isoniazid

IPTG

: Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Luria - Bertani

MDR

: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc)

PAS

: Paraminosalicylic acid

PAZ

: Pyrazinamid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RMP

: Rifampicin

RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng

rifampicin)

Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase

TCYTTG

: Tổ chức Y tế Thế giới

V

: Volume (thể tích)

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside


MỞ ĐẦU
Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một thế kỷ
nay. Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9 triệu người mắc
lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn
với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant - MDR), tức là thể lao
với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao mạnh nhất là isoniazid (INH) và
rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê của chương trình chống lao Quốc gia năm 2007,
thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000
trường hợp tử vong. Do những khó khăn trong việc điều trị những bệnh nhân mang các
chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa
thuốc sẽ trở nên rất quan trọng trong điều trị bệnh lao.

Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương pháp
nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh học phân
tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc. Cơ chế kháng
thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất hiện trong một số
gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn chỉ còn
vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn.
Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại
kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy
việc xác định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán
phát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng
isoniazid là do có liên quan tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng
kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung
tâm của gen rpoB.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện vi
khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc
thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng
phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.


Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu như
sau:
1.

Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2.

Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập tại
Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3.

Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát hiện
nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc.


Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. BỆNH LAO
Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi khuẩn
Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ
thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), xương và khớp.
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới
chưa bao giờ và không một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người
mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện
vào ngày 24/3/1882. Trong thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết
vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là một bước ngoặt quan trọng trong việc khống
chế và loại trừ căn bệnh này. Trước đây, lao được xem là một trong những căn bệnh truyền
nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các
nước thuộc châu Phi và khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu. Trong
khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số
bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao
ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh
phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như
vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công
tác phòng chống lao không những trong các năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có
thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện thêm vi

khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng lao kháng thuốc
được chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant - MDR) và lao kháng
thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc
này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của cộng đồng. Theo ước tính của Tổ
chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc,
chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là


khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa
kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình
hình lao siêu kháng thuốc cũng ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến
11/2005, WHO và Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ
40 quốc gia trên toàn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2%
trường hợp là kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống
lao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1,
3].
Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống lao
trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại
nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi thuốc trên trực
khuẩn lao không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) các
thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàng
đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại hai, thuốc chống
lao hàng thứ hai). Trong khi các thuốc chống lao loại một là những thuốc có hiệu quả nhất
và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống lao hàng thứ hai là những thuốc có tác dụng
kém hơn lại có độc tính cao và giá thành rất đắt. Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân
nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong khi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000
USD. Hiện nay số tử vong hàng năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốt
rét và các bệnh nhiệt đới cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã
quay trở lại và trở nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17].
Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm sau

khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại
streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para
– aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thời
gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quả điều trị lao, đặc
biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng có nhiều hợp chất
chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid [43]. Tuy nhiên, theo cơ
chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều chủng mới hơn có khả năng


kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95-100% đối
với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc
lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa
thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị
lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn
đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2 - 3
µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng phương pháp
Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm mất màu
carbonfuchsin. Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực khuẩn lao vẫn phát
triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi mycobacteria. Đặc điểm này rất quan
trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các
mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi
mycolic acid. M. tuberculosis có khả năng thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp
các vitamin, amino acid và các enzyme cofactor thiết yếu của tế bào. Mycobacteria có cấu
trúc gần giống với vi khuẩn Gram dương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩn
Gram dương do các phân tử gắn với thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay
polysaccharide. Do đó, chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram
[2, 5, 37, 38].

Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37 oC và dưới áp suất của O2 là 100
mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có áp suất O 2 từ
120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì áp suất O 2 ở đây là 100
mmHg. Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O2 thấp.
Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào, trong
điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một lần trên môi
trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46]. Tốc độ phát triển chậm có thể là do tính


thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc
độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2).

Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M.
tuberculosis
( />be_gallery/tuberculosis)

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát
triển trong môi trường nuôi cấy.
( />ory?id=3079114&page=1)

Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có được. Dưới
kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính như sau (hình 1.3):
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid gồm 2
nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu trúc này tạo
nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của vỏ ngoài trực
khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền tín hiệu đến bộ
máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình
trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho quá trình vận chuyển các
chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách
ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme ngoại bào, sao chép DNA [2, 4,

37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử mycolic
acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất
định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có
một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglucan
ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn E. coli là 20 - 30% [38]


- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất phức
tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm tăng khả
năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môi
trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch
[38].
- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid. Nó
đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện tượng thực
bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn khó bi tiêu diệt.

Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis
( cell.htm)

1.3.2. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau: thường là
đường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt. Sau khi gây tổn thương tiên
phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu để đến gây tổn thương thứ
phát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xương, hạch nhưng thường bị hơn cả là đỉnh
phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao.
Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là
chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mạn tính [7].

Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịch qua
trung gian tế bào. Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và các nguyên bào
sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào. Chức năng của
các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà còn tạo môi trường tại
chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên trong các u hạt, tế bào
lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại thực bào khiến chúng diệt
khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các tế bào bị nhiễm. Nhưng điều
quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm
khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv được giải trình tự,
phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều guanine và
cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein
và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein)
[28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium, trước hết là của
vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong (M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt
trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu
kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương
trình để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng không
giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc chống lao
chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP), ethambutol
(EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM). Đây là những thuốc kháng lao hiệu quả và
cũng ít độc tính nhất. (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốc chống lao có tác dụng
kém hơn và có độc tính cao, không được dùng trong phác đồ điều trị lao nhưng lại được
dùng trong các trường hợp điều trị thất bại do vi khuẩn lao kháng lại các loại thuốc chống

lao loại một. Các thuốc này gồm có: ethionamide, prothionamide, paraminosalysilic acid
(PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…
Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tế bào. Các
thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợp protein. Các
thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic acid. Thuốc
paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38].
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc
Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại kháng sinh
dùng điều trị chúng. Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những trường hợp vi
khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampicin,
pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35]
Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:
-

Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó các
thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn.

-

Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn sản
xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức chế hoàn
toàn vi khuẩn lao.

-

Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên
trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt tới nồng độ
tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên phát)

hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát là
hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự
nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập
vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phát
xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng
quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao
khang thuốc [1, 38].


Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đa
thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc
chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các chủng lao kháng thuốc phổ
rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng kháng đa thuốc và có
thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là capreomycin, kanamycin, amikacin
[49].
Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ chế
kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng. Trong hình 1.4 mô tả
các cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Trong đó, kháng isoniazid
được cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng streptomycin có thể là
do đột biến ở gen rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến gen pncA. Kháng quinolone
có thể liên quan tới gen gyrA. Kháng rifampicin được xác định là liên quan đến đột biến ở
vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của RNA polymerase [7, 25]. Trong luận
văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn
lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều
đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG.


Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao
( />
1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng

Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl] (hình
1.5A). Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh được chiết xuất
từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn mạnh, tiệt khuẩn, thuốc
diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có hiện tượng kháng thuốc chéo
với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory
concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in vitro). Đây là thuốc ức chế RNA
polymerase mạnh nhất [29, 48].

A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động của
RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn vị khác
nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD [7,
20].
Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế các
hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các hoạt động
sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi khuẩn lao (hình
1.6).


Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

Gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase
(Tuberculosis, 2007). Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thường xảy ra trên đoạn
gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ ba 507 đến
533, người ta gọi đây là vùng “nóng” – “hot-spot region” (hình 1.7). Đột biến ở bộ ba thứ

526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ ba 510, 515 và 512 thì
cho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47]. Đoạn nucleotide của vùng nóng
gồm:
507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG
CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào để
tạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41].


Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng” của
gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu phần β
của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP với tiểu phần
này giảm đi. Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao giảm hoặc mất đi. Như
vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn lao trở nên kháng thuốc với
rifampicin.
- 90 - 95 % các chủng M. tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các đột biến
trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB. Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi khuẩn lao không có
đột biến trên vùng này của gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải xác định thêm những đột biến
khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác định chính xác và toàn bộ cơ chế
kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc chống
lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M. tuberculosis và các loại Mycobacterium không
điển hình khác như M. bovis, M. kansasii. Isoniazid diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ thuốc
ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn. Cơ chế tác dụng của isoniazid có liên
quan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinic-NADH và như đã trình bày ở trên chúng ức
chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao.

Gen katG có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này hoạt hóa
INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acyl isonicotinicNADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo
đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng hợp acid béo. Quá
trình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao.

Hình 1.8. Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao
( />
Cơ chế phân tử của tính kháng INH chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất
đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 (Ser à
Thr) của gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base
thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến đổi thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm
hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase, do đó M. tuberculosis sẽ trở thành
kháng thuốc INH (hình 1.8) [14]. Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này trong gen katG
có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng
M. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
*) Đặc điểm lâm sàng


Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không khác
nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.
Trường hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp tính
hơn, sốt cao hơn.
Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính, được
điều trị ít nhất 2 lần. Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số bệnh nhân lao
kháng đa thuốc. Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay gặp dò phế quản –
màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng

- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên phát có
mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc. Đối với kháng
thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm HIV (+) thì tỷ lệ phản
ứng này âm tính khá cao.
- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao phổi
giữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm với thuốc không
có sự khác biệt. Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thì gặp nhiều là thể
xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang, kích thước của hang
lớn hơn.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở vi
khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp
peptidoglycolipid ở ngoài cùng). Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế bào
cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc. Khuẩn lạc của vi khuẩn kháng
thuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]
+ Về số lượng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốc thứ
phát có số lượng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhân thông
thường. Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiên phát và
bệnh nhân thông thường. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc số khuẩn lạc mọc ở
bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc nhanh hơn so với


kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩn lạc lại cao hơn ở bệnh
nhân thông thường [7].
+ Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thường kháng hay kháng với
nồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thường kháng với nồng độ cao hơn. Kháng
thuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc thứ phát thường tỷ lệ kháng
cùng lúc với nhiều thuốc cao hơn [7].
Như vậy không thể dựa vào lâm sàng hay thời gian điều trị hiệu quả để chẩn đoán
bệnh nhân lao kháng thuốc được. Các xét nghiệm cận lâm sàng khác chỉ có giá trị gợi ý.

Chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc hiện nay vẫn phải lấy kết quả kháng sinh đồ làm tiêu
chuẩn.
1.5.2. Xác định kiểu hình
Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp xác định
tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phương pháp khác
[13]. Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi
trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vi
khuẩn lao đang nghiên cứu [12]. Nhược điểm của các phương pháp này là vi khuẩn lao mọc
chậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6 tuần. Sử dụng hệ thống môi
trường lỏng được cải tiến như MGIT, BATEC cũng mất 2 tuần. Điều này làm cho công tác
điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnh lao kháng thuốc còn khó khăn.
1.5.3. Xác định kiểu gen
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi
khuẩn lao kháng thuốc [1, 4], giải trình tự gen [6] , lai trên pha rắn [36], Real – time PCR
[14]
Các phương pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến ở
các gen có liên quan tới tính kháng thuốc tương ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao, đòi hỏi
thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thời gian chẩn đoán
bằng phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG) hiện
nay giải trình tự gen vẫn là phương pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thời gian cho


kết quả từ 3 - 5 ngày. Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ chủng lao nghiên
cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với trật tự nucleotide
chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16].
Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid bằng kỹ
thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần nghiên cứu, mang
lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng
thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ các

vùng địa lý khác nhau. Qua đó làm tiền đề xây dựng một số bộ kit real-time PCR, nhằm phát
hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid tại Việt Nam.
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay
sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí
nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bước thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để
xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch
đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại. Như vậy, nên có thể nói
real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa
vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với
phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.
Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trong phản
ứng, trong đó chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầu tiên mà
người làm real-time PCR cần quan tâm. Chất huỳnh quang này phải làm thế nào để ống
phản ứng có thể phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích một khi
trong ống phản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích, và sẽ không
thể phát được huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại trong ống. Cho đến nay,
nhiều chất huỳnh quang như vậy đã được tìm ra và sử dụng rộng rãi. Trong phạm vi khóa
luận này, chúng tôi chỉ xin trình bày chất huỳnh quang thường được sử dụng nhất đó là
Taqman probe [8].
Probe hay còn gọi là “đoạn dò” là những đoạn oligonucletides sợi đơn có trình tự có
thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là sản phẩm


khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Đoạn dò này với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang
(gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất dập tắt huỳnh quang tương ứng (gọi là quencher) để
dập tắt được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. Cơ chế của sự phát tín hiệu
huỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại là nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease của enzyme
Taq polymerase có khả năng cắt bỏ các probe khi các probe bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu
3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung (hình 1.9)

Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của real-time PCR sử dụng Taqman probe
( />
Trên hình 1.9 minh họa nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR.
Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào
sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq polymerase cắt bỏ để
kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa
quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản
phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó
cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh
quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích. Ngược lại, khi không


có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn
nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher của probe hấp phụ
(dập tắt tín hiệu) do đó ống thử nghiệm sẽ không phát được tín hiệu huỳnh quang khi nhận
được nguồn sáng kích thích [8].
Multiplex real-time PCR là một dạng thay đổi của phản ứng real-time PCR thông
thường, ở đó trong cùng một lúc hai hay nhiều gen đích được khuyếch đại bằng cách sử
dụng đồng thời các cặp mồi và các probe khác nhau.
Kỹ thuật multiplex real-time PCR cho phép tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai
trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình
DNA và phân tích định lượng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu ích cho việc phát
hiện trực tiếp các đột biến của M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng.

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc (kháng một
loại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốc dòng thứ nhất là INH
và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống lao hiện tại) được thu thập từ các
vùng miền khác nhau như Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (TP Hồ Chí Minh), Bệnh viện
Trung ương Huế và bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương. Các chủng lao được phân lập
từ các loại bệnh phẩm của bệnh nhân lao như: đờm, dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, dịch
màng bụng... Ngoài ra, trong nghiên cứu có sử dụng chủng chuẩn quốc tế H37Rv làm đối
chứng.
DNA tổng số của các chủng lao nghiên cứu được tách chiết tại Học viện Quân y.
Nồng độ DNA được đo trên máy NanoDrop ® để tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu
như nhau để khi đưa vào hỗn hợp phản ứng PCR cùng một thể tích DNA khuôn, và đạt
khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng.
Kết quả đo nồng độ DNA tổng số của từng mẫu nghiên cứu được trình bày trong
phần phụ lục 2.
2.1.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng
Pepton

Fermentas (Mỹ)

Yeast Extract

Fermentas (Mỹ)

NaCl

Fermentas (Mỹ)

Agar

Fermentas (Mỹ)

Ampicilin

Fermentas (Mỹ)

X-gal

Fermentas (Mỹ)

IPTG

Fermentas (Mỹ)


Accuprep plasmid Mini Extraction Kit

Fermentas (Mỹ)

BamHI

Fermentas (Mỹ)

Vector tách dòng pBT

Viện CNSH

Thang chuẩn DNA

Fermentas (Mỹ)

Taq-DNA-polymerase

Fermentas (Mỹ)

*) Các máy và thiết bị chính
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính

Tủ ấm ổn nhiệt

Tên máy, thiết bị

Hãng sản xuất
Sanyo (Nhật Bản)

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)

Applied BioSciences (Mỹ)

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Heraeus (Mỹ)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Thommas Scientific (Mỹ)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Dolphin (Mỹ)

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Nuaire (Mỹ)

Máy quang phổ tử ngoại khả biến NanoDrop

Analitika (Đức)

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-Avant

Applied BioSciences (Mỹ)

2.1.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Dựa trên trình tự gen rpoB và katG của chủng dại H37Rv (Accesion: NC_000962)
đã được công bố trên ngân hàng giữ liệu gen quốc tế NCBI. Trên cơ sở đó, các mồi đặc hiệu
được thiết kế:
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen
đích
katG
rpoB

KT

Mồi

Trình tự nucleotide

katG-F
katG-R

5’- GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG - 3’
5’- GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT - 3’

684

rpoB-F
rpoB-R

5’- ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT - 3’
5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT - 3’

528

(bp)


Trong đó, cặp mồi katG-F và katG-R nhân đoạn gen katG có chứa codon 315 liên
quan kháng thuốc isoniazid, cặp mồi rpoB-F và rpoB-R nhân đoạn gen rpoB có chứa đoạn
nóng 81 bp liên quan tới kháng thuốc rifampicin.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Thiết kế mồi

DNA vi khuẩn lao
Gắn gen đích BamHI
PCR vào vector pBT

BamHI

gen đích
Amp
BamHI

Gen đíchBamHI

Đọc trình tự

Amp

So sánh và phân tích kết quả
nhận được
2.2.2. PCR nhân đoạn gen đích
Multiplex real time PCR
Thiết kế các probe phát hiện
Phản ứng PCR nhân đoạn
độtgen
biếnkatG và rpoB đặc
hiệu được thực hiện:
Bảng 2.4. Thành phần cho một phản ứng PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

Thể tích (µl)

1X

2,5

2,5 mM

2,5

1

Dung dịch đệm (PCR Buffer 10X)

2

dNTPs (2,5 mM)

3

MgCl2 25 mM

2 mM

2

Mồi xuôi (10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

Mồi ngược (10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

5

Template (50 ng/µl)

100 ng

3

6

Taq polymerase (5 unit)

1,25 unit

0,25

4

7

H2O deion

12,75
Tổng

25

Theo chu kỳ nhiệt như sau
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bước

Phản ứng

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

1

Biến tính

95

5 phút

2

Biến tính

94

1 phút

3

Gắn mồi

56

45 giây

4

Kéo dài chuỗi

72

1 phút

5

Hoàn tất kéo dài

72

10 phút

6

Kết thúc phản ứng

4

Chu kì
1

32

1

∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 0,8%. Để phục vụ
cho giải trình tự gen, đoạn gen katG và rpoB được tinh sạch và dòng hóa vào vector tách
dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp.
2.2.3. Tạo dòng gen
*) Tạo sản phẩm nối ghép
Bảng 2.6. Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép

STT
Thành phần
Thể tích (µl)
1
Dung dịch đệm (T4 Buffer 10X)
1

2
pBT Vector
1
3
Sản phẩm PCR
5
4 oC T4
DNA
Ligase (5 unit)
1
Ủ ở 22
trong
1 giờ.
5
Nước deion
2
Tổng
10

*) Biến nạp và nuôi cấy tế
bào có vector tái tổ hợp
Sản phẩm nối ghép được biến

nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α (đã đươc xử lý bằng CaCl 2 theo phương pháp
chuẩn) bằng sốc nhiệt 42 oC trong 90 giây. Sản phẩm biến nạp được bổ sung 200 µl LB
lỏng, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37 oC và trải trên đĩa thạch có bổ sung ampicillin