DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN

Trình bày được
• Định nghĩa & Phân loại tannin
• Cấu trúc của 2 loại tannin chính
• Các tính chất lý hóa chính của tannin
• Các phương pháp chiết xuất tannin
• Các phương pháp định tính, định lượng tannin
• Tác dụng và Công dụng của tannin
• Ba* dược liệu tiêu biểu có tannin
(Ngũ bội tử, Măng cụt, Ổi)
2

6. Định tính Tannin

1. Khái niệm & Định nghĩa về tannin
2. Phân loại các tannin

6.1. Định tính vật lý

2.1. Theo tính thuộc da (tannin thực & pseudo)

6.2. Định tính hóa học

2.2. Theo cấu trúc hóa học

6.3. Định tính sắc ký

2.3. Theo khả năng thủy phân*

7. Định lượng Tannin

3. Cấu trúc hóa học

3.1. Tannin pyrogallic

7.1. Phương pháp dùng bột da

(TG)

7.2. Phương pháp oxy-hóa (Lowenthal)

3.2. Tannin pyrocatechic (TC)

7.3. Phương pháp dùng Đồng acetat

3.3. Tannin phức hợp

7.4. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin

4. Tính chất của Tannin

7.5. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu

4.1. Lý tính

7.6. Phương pháp dùng HPLC

4.2. Hóa tính
5. Chiết xuất Tannin

3

8. Tác dụng & Công dụng của Tannin

4


Đến 12/2014:
160 K hợp chất tự nhiên

Phenol đơn giản
Phenylpropanoid

30 K

Flavonoid

18%
Alkaloids

Lignanoid
45%

42 K
27%

Phenolics

Tanninoid

72 K

Stilbenoid

Steroids &
Terpenoids

Xanthonoid
10%
Khác

16 K

Quinonoid
... ... ... ...

A. Theo E.C. Bate-Smith (1962): Tannin là

• Về nguồn gốc, tannin là những hợp chất biến dưỡng thứ cấp

- các hợp chất phenol, MW # 500 − 3.000 đvC

của các thực vật bậc cao, có bản chất polyphenol.

- cho các phản ứng thông thường của phenolic.
- tạo tủa với alkaloid, gelatin và các protein khác.

• Về cấu tạo, tannin có thể là

B. Theo Edwin Haslam (1989): Tannin là

- các ester của galloyl (và dẫn chất) với nhiều loại polyol khác

- các hợp chất polyphenol, MW # 500 – 20.000 đvC

nhau (glucose, acid quinic, catechin,...).

- cho các phản ứng thông thường của phenolic.

- các oligomer hoặc polymer của PAC* (và dẫn chất từ PAC),

- tạo tủa với alk., gelatin, protein khác và 1 số polysaccharid.

với các liên kết flavanyl (C − C)

C. Theo Peter Horvath (1981): Tannin là
- các hợp chất polyphenol, MW lớn.

• Về từ nguyên, tanna = gỗ Sồi (Oak, Fir) trong tiếng Đức cổ.

- chứa n × φOH & các nhóm thích hợp khác (carboxyl)

Tiếng Anh: to tan, tanning (Pháp: tanner) = (sự) thuộc da...
7

- tạo phức với protein & nhiều đại phân tử khác trong đk. đặc biệt.


(Goldbeater's skin test)

Có nhiều cách phân loại tannin:
2.1. Theo khả năng kết hợp với protein (≈ tính thuộc da)
→ Tannin thực (true) và tannin giả (pseudo-tannin; ψT)

2.2. Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử)
→ Tannin pyrogallic (TG) và tannin pyrocatechic (TC)

2.3. Theo tính thủy phân (trong tannase hoặc acid loãng)
→ Tannin thủy phân được và tannin ko thủy phân được
= Tannin ngưng tụ = condensed tannin
9

10

Có thể chia các “tannin thực” thành 4 nhóm chính
A1. Tannin gallic (= gallo-tannin)*
Thường là polyester của vài mono-, di-, tri-galloyl (hay ∆’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...)

TG

TC

A2. Tannin ellagic (= ellagi-tannin)*
Thường là polyester của acid ellagic, luteolic, HHDP (hay ∆’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...)
B. Tannin [pyro]catechic (= tannin ngưng tụ, condensed tannin)
= PAC, là các oligomer, polymer của Flavan-3-ol (nối C → C)
thường gặp kiểu liên kết (C4 → C8) hay (C4 → C6). . .
C. Tannin phức hợp (complex tannin)
Là các glycosid phức hợp từ 3 nhóm trên.

11

12


Dựa vào tính thủy phân, tannin có 2 loại chính:

3.1. Cấu tạo các pseudo-tannin: thuộc da (−)

• Tannin thủy phân được (gồm gallo-tannin & ellagi-tannin).
• Tannin ko thủy phân được (= tannin ng. tụ, pyrocatechic).

3.2. Cấu
́ tạo các tannin thực:
thủy phân được
(tanin pyrogallic)

gallo-tannin

( acid gallic)n

ellagi-tannin

ellagic, luteolic

thuộc da (+)

3.2.1. Tannin pyrogallic (TG) = Tannin thủy phân được.
a. Gallo-tannin (polyol + ∆’ acid n-gallic)
b. Ellagi-tannin (polyol + ∆’ acid ellagic)

ko thủy phân được

(tanin pyrocatechic)

c. hỗn hợp
n x catechin (flavan 3-ol; 3,4-diol)n

(polyol + acid n-gallic + acid ellagic)

3.2.2. Tannin pyrocatechic (TC): Không thủy phân được.
3.2.3. Tannin phức hợp: (catechin − polyol − gallic/ellagic)

Điều kiện thủy phân: enzym tannase hay acid loãng
13

Tiếng Hy lạp: phloios (φλoιὀς) = vỏ cây (bark)

acid gallic

acid m-digallic

galloyl

digalloyl

baphe (βαφή) = chất nhuộm màu (dye)
HO

HO

Hai định nghĩa thông dụng về phlobaphen:

depsid

G1

• Trong hóa thực vật học:

HO
HO

Phlobaphen là các hợp chất phenol có màu đỏ chiết từ thực vật.

G2

COOH

HO
HO

+ OH/glc

O

CO
HO

+ OH/glc
COOH

HO

Các hợp chất này tan trong cồn nhưng không tan được / nước.
HO

HO

• Trong công nghệ thuộc da:
G3

Phlobaphen là những sản phẩm có màu đỏ (= đỏ tannin) được
tạo thành khi xử lý các dịch chiết có tannin với các acid vô cơ.

depsid
HO

CO
HO

O

HO

HO
CO

COOH
O

depsid

Các hợp chất này không tan đươ•c trong nước.

+ OH/glc

HO

acid m-trigallic
15

trigalloyl
16


1

Là các polyphenol đơn giản, phân tử (và MW) nhỏ. Tính chất:

phloroglucinol

pyrocatechin

• cho các ph.ứng chung của polyphenol (ph.ứng của vòng thơm,

HO

diazo-hóa, phản ứng của -OH như tạo phức với Pb2+, Fe3+...)

HO

HO

HO

• không cho phản ứng thuộc da; Chỉ khi ở nồng độ cao, đôi khi

pyrogallol

OH

HO

HO

chúng mới có thể tạo tủa với dung dịch protein (khác tannin).

HO

HO

• khả năng tạo phức với các đại phân tử thì rất kém (khác tannin)

HO

HO
HO

• Về cấu trúc hóa học, thường gặp chúng ở dạng:

CO
HO

COOH

HO

O

HO

- các dẫn chất acid phenol đơn giản.

HO

COOH

HO

HO

acid pyrocatechic

- các tổ hợp (n-caffeoyl−acid quinic); các flavo-lignan...
- mono và dimer, trimer của acid gallic.

acid gallic

acid m-digallic
HO

COOH

COOH

- mono và dimer của catechin và ∆’-catechin.

HO

17

acid cinnamic

acid hydroxycinnamic

acid caffeic

2

HO

4

1
3

caf

(OH)

HO

5

COOH

HO

OH

1

4
3

O

2

HO

acid chlorogenic
(3-caffeoyl quinic)

COOH

HO

4

OH

1

3

COOH

HO

OH

HO

OH

4

caf

cynarin
(1,3-dicaffeoyl quinic)

acid quinic

O

O

O

caf

O

OH
5

3

O

CH2OH
OMe

O
OH

OR
OH

(OR)

∆’ flavan-3-ol

OH

O

flavo-lignan (silybin)

(OH)
H

caf

O
4

1
3

HO

OH
CO

HO
5

HO

O

HO

5

COOH
OH

18

3

HO
5

COOH

HO

(≥ trimer được xếp vào nhóm PAC/ tannin ngưng tụ)

HO

COOH

HO

H

HO

4
3

HO

1
2

O

OH
2

COOH
4

OH

3

(OH)
OH

OH

OH
HO

acid iso-chlorogenic = (5-caffeoyl quinic)

8

O

2

3

OH

HO

O

2

3

OH

OH
O OC

OH

O
OH

OH

OH

19

OH

OH

dimer-(epi)catechin

OH

epi-gallocatechin-3-O-gallat


G

G
G

a. Các gallo-tannin

O

Vị trí trung tâm là 1 glycon ( ) có cấu trúc polyol.

6
5

G

3

1
2

O

O

O

O

O

4

O

G

O

G

G

G
O

G

O
3

O
G

penta-galloyl glucose (PGG*)

Mỗi -OH/polyol này có thể nối ester với 1 nhóm -COOH

G

của phần acid n-gallic (thường thì n = 1 → 3).

HO

6
5

3

1

O

2

trong Ngũ bội tử (Galla chinensis), Sồi (Quercus spp.)...

G

O

G

G
O

O

OH

H

OH

OH

hamameli-tannin
(∆’-hamamelose)

aceri-tannin
(2,6-digalloyl-1,5-anhydro-D-glucitol)

21

G
O

O

H

G

O

M = 180 + 10(152) = 1700

O

4

HO

Điển hình là các polygalloyl glucose và acid tannic có

O

O

penta-digalloyl glucose (PDGG*)

M = 180 + 5(152) = 940

- rất ít khi là ∆’ glucitol, hamamelose...

1
2

G

Polyol - thường gặp nhất là βD-glucopyranose (βD-Glc)
- ít khi là ∆’ acid quinic, acid caffeic, shikimic...

6
5

O

G

G

O

4

22

b. Các ellagi-tannin

Là các tannin pyrogallic có phần aglycon là acid ellagic

OH
HO
OH

HO

OH

OH
HO

HO

COO
COO 4
COO

HO

6

COO

OH

G

O
G

4

O

3

O OC

OH

O

1

2

G

G

OH

OOC

G

OH

OH
OH

acid meta-trigallic

HO

HO

4

HO

4)

O
1

OH

G
O

OH

OH
1C
4

G

G

HO
6

O

O

1

O
4

4

OH
4C
1

G
6 CH2O

1

OH
HO

CO

OH

OH

O

HO

HO

OH

1C

G

(G = galloyl)

OH
HO

Vị trí trung tâm thường là βD-Glc (4C1 &

O

5

O

1

βD-glc

HO

6

O
OOC

2

hay acid luteolic, hexahydroxy diphenic acid (HHDP).

O

O

5
3

G

1

O

2

4

3

2

O

O

O

O

G

G

G

G

HO

Khi aglycon là HHDP, nó sẽ ưu tiên nối với glucose ở dạng 1C4
Nhóm -COOH / acid meta n-gallic nối ester với 1 nhóm -OH / glc.

Các ellagi tannin thường có M = 2000 → 5000.

Các đơn vị acid gallic nối meta với nhau bằng đường nối depsid.

Ellagitannin có trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula),
23

vỏ quả Lựu, vỏ Sồi (Quercus spp.), lá Trà...

24


• Khi không mở vòng: nhóm -OH (♥) của acid ellagic có thể
nối với -OH của polyol (như glucose…) và tạo 1 O-glycosid.
O

O
OH

(♥)

↑

HO

(♥)
HO

O

HO

OH

OH

HO

OH

O

acid ellagic

OH
HO

OH

HO

OH

( )

G

OH

COO

HO HO

( ) ( )

O

6

O

O
G

1

COO

OH

O
G

1

O

(G = galloyl)

HO
OH
HO

HHDP

acid luteolic

G

O

COO

HO

COOH COOH

COOH

6

COO
OH

↑

OH

↑

HO

HO

O
O

OH

HO

OH
OH

• Khi mở 1 vòng (→ acid luteolic):

tạo 1 nhóm COOH mới ( )
• Trong phân tử acid ellagic : nối ester kiểu depsid (kém bền nhất)

• Khi mở cả 2 vòng lacton (→ HHDP): tạo 2 nhóm COOH mới ( )

• Giữa acid ellagic và glucose : nối acetal (tạo O-glycosid; kém bền)

Các nhóm -COOH ( ) này sẽ nối ester với các nhóm -OH của

• Giữa acid monogallic và glc : nối ester (tạo ψ-glycosid; kém bền)

polyol (như glucose…), tạo pseudo-glycosid (# ellagi-tannin).

• Giữa 2 vòng thơm

: nối C − C ( , rất bền!)

25

(Tham khảo)

(Tham khảo)

Mỗi ph. tử HHDP có 2 nhóm -COOH. Chúng có khuynh hướng tạo
một diester với 2 nhóm -OH/glc gần nhau trong không gian, ví dụ:

G

- dạng 4C1-glc → diester ở (2 + 3), ở (4 + 6), hay ở (3 + 4)...

G

- dạng 1C4-glc → diester ơ› (6 + 1), ở (6 + 3), hay ơ› (2 + 4)...

4

HO
HO

6

HO

6

(kém bền)

O

5
3

HO

2

OH
1

4C

1

1C

4

5
4

OH

OH
OH
O
3

G
O

OH

6

OH

O
G

O

1

4

G

G

HO
6

O

O

1

O

O

O
G

OH

O

G
6 CH2O

1

O

2

4

3

2

O

O

O

O

G

G

G

G

Khi thủy phân các ellagi-tannin (nước nóng, acid yếu...) thì:

1

• Các liên kết ester giữa HHDP với glucose (kém bền) dễ bị cắt đứt.

2

OH

• Liên kết C − C ( ) giữa 2 vòng thơm (rất bền) không bị cắt.
Sản phẩm thủy phân ngừng ở acid ellagic (ko tới được acid gallic!)

hai dạng ghế của D-glucopyranose

Enzym tannase (ví dụ từ môi trường nuối cấy Aspergillus niger)
thì không cắt (thủy phân) được nối ester giữa HHDP & glucose.

27

• Phần HHDP sau thủy phân sẽ nhanh chóng sắp xếp lại cấu trúc
(xoay và đóng vòng) để tạo acid ellagic (ko tới được acid gallic!)

28


Phần aglycon vừa có acid gallic, vừa có acid ellagic / luteolic / HHDP

Còn gọi là tannin catechic (TC), tannin ngưng tụ (condensed tannin),
hay proanthocyanidin (PAC), phlobatanin (ít dùng).

OH

HO
OH

OH

OH

HHDP

HO

HO

HO

CO
O

CO
O

6

glucose

G

OH

HO

O

4

O

O
3

2

O

CO

CO

OC

OH

COOH
G

1

OH

HHDP

HO

COOH

HO
HO

acid gallic

OH

G

COOH

Là tổ hợp nhiều đơn vị [flavan-3(4)-ol] nhờ liên kết (C−C) rất bền ( ).

G

COOH

PAC có thể thẳng (

OH

OH

nối 4/6)...

HHDP
(OH)

G

OH

G

HO

8

OH
HO

nối 4/8) hoặc tạo nhánh (

O
4

extension

OH
(OH)

OH

OH

OH

OH

HO

n

• Gallic có thể là mono, di, hoặc tri-galloyl

4

OH
OH

(OH)
OH

OH

• Ellagic có thể là ellagyl, luteolyl, HHDP-yl...
• Có thể có liên kết giữa các đơn vị gallic & ellagic gần nhau

8

O

HO

8

O
4

29

terminal

OH
OH

30

OH

Lưu ý: Tuy chỉ là monomer, nhưng cả epigallocatechin-gallat (EGCG),
epicatechin-gallat (ECG) vẫn được gọi là “tannin catechic” / Trà xanh.
R

8

HO

O

OH

Do mật độ [-OH] cao, chúng có khả năng tạo tủa với protein và các

R

hợp chất đại phân tử khác (polysaccharid...)

OH

4

OH

OH
HO

8

O

gallocatechin

OH

n

OH

OH

4

R

8

HO

HO

OH

R

epi

O

O

HO

8

O

8
4

gallat

gallat

OH

OH
OH

OH

R

OH

4

epi

OH

6
4

catechin

OH

OH

(EGCG)

R

(ECG)

OH

OH

Với d.dịch FeCl3 loãng, E(G)CG cũng → xanh đen (# tannin gallic!)
31

32


Tham khảo

Tham khảo

Acid tannic là một hỗn hợp chủ yếu gồm các ester của βD-glucose*

Tannic acid is a tannin derived from plants and in general prepared from Chinese

với acid n-gallic (n = 1, 2, 3). Acid di- hay trigallic tạo bởi nối depsid.

gall or nut gall. Although tannic acid has long been used, its structure has not yet

βD-glucose đóng vai trò trung tâm, xung quanh là các acid n-gallic.
G6
G4

O
G3

O

4

6

G6

5

O

2

3

O

O
O
O

O

6

3

4

1

O

G2

G4

formula of the principal component of tannic acid is as follows:

1

O

5

G1

Shoji Tomoda (1982), Plant Pharm. Chem., p. 93, discloses that the structural

G1

O

G3

been well-defined and hence it varies depending on articles.

2

O

G2

6 CH 2O

galloyl

Acid tannic = poly-galloyl-βD-glucose = C6H12O6 . (C7H4O4)5→10

O
O

MW = 180 + (760→1520) = (940→1700)

galloyl

Σ.G = 7 → 9 units galloyl

O
O

2

O

galloyl

Do được khai thác từ các nguồn khác nhau, công thức của acid tannic
cũng có nhiều công bố khác biệt (về giá trị n của phần acid n-gallic).

Cũng có tài liệu nói đến sự có mặt của acid quinic (thay cho một số
vị trí của glucose).

galloyl

MW = (1244 → 1548) Da

1

Mm = *1396* Da

(galloyl) 3, 4, 5

Tannic acid (theo S. Tomoda, 1982)
34

Tham khảo
Tác giả mô tả

Gn (nối với các OH glucosyl)

Σ galloyl

MW

Acid tannic có trong các tổ chức sùi ra (galls) ở lá & cành non của

1700

- một số loài Sồi, Sến (Quercus infectoria, Q. lusitanica...)

rất nhiều

(2010s)

5 × digalloyl = (PDGG)

= 10

S. Tomoda

(1982)

7 → 9 galloyl

=8±1

Brewster

(1948)

5 × digalloyl = (PDGG)

= 10

1700

Britton

(1966)

4 × galloyl + trigalloyl / G2

=7

1244

E. Fisher

(1912)

5 × galloyl

=5

940

Hagerman

(2002)

= (PGG)

= (22/3)

- một số loài Muối tạo Ngũ bội tử (Rhus chinensis = R. semialata...)

*1396*

Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và βD-glucose.

Acid tannic còn có trong hạt cây Caesalpinia spinosa Fabaceae.
Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và acid quinic.

*1294*
4

HO

6

6

O

HO
HO

5
3

2

OH
OH

1

βD-glucose
Dung dịch acid tannic 10% / nước có pH = (2,3 ± 0,1)

35

5

4

HOOC
1

OH

2

COOH

OH

OH

5

OH
4

3

OH

acid quinic

6
3

OH

OH

1

OH

2

acid quinic
36


Cấu trúc rất phức tạp. Có thể có hoặc không có polyol (glucose...).

4.1. Lý tính

Phần aglycon đa dạng (các ∆’ catechin, các ∆’ acid gallic, ellagic...).

4.1.1. Chung của TG và TC

Vd: Các guavin / lá Ổi, camellia-tannin / lá Trà, stenophyllanin A / Sồi...
OH
HO

4'

G
G

OH
O

3

2

O
O
HHDP
O
G

4.1.3. Riêng của TC

OH

OH

O

O

∆’ acid caffeic

3'

galloyl
G

catechin

O

5

8

Hax

4.1.2. Riêng của TG

OH

O

7

8

O

2

3

7

OH

4.2. Hóa tính

OH

4.2.1. Chung của TG và TC

OH

4.2.2. Riêng của TG

OH

OH

4.2.3. Riêng của TC
Stenophyllanin A
(trong Quercus stenophylla)

Cinchonain
(trong Cinchona spp.)
37

38

• Độ tan của các tannin

4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC

- (epi)-catechin monomer và dimer: dễ tan / EtOAc.

- thường là bột vô định hình, màu vàng ngà đến nâu sáng.

- các PAC oligomer: kém tan / EtOAc.

- không mùi hoặc mùi rất nhẹ; có vị chát.

- các PAC polymer có MW quá lớn: rất khó tan / EtOAc.

- gây săn se niêm mạc, kích ứng niêm mạc dạ dày.
• Với các dung dịch nước của protein (albumin, gelatin...):

- MW # 500 → 5.000+ (TG); 900 → 20.000+ (TC).

- tạo phức tủa bền → có tính thuộc da

- tính chất thay đổi tùy xuất xứ, tùy cách chiết.

làm da bền, ít thấm nước, không bị thối rữa

- dễ tan / kiềm loãng, cồn-nước, aceton-nước.

(khả năng tạo tủa sẽ tối ưu tại pHi của protein)

- tan được* / EtOAc, glycerin, propylen glycon.
- không tan / d.môi kém ph.cực (hexan, EP, Bz, Cf, Et2O)

39

Khi thử nghiệm tính tạo tủa của tannin với protein:
cần điều chỉnh pH của môi trường!

40


4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC (cont.)

4.1.2. Lý tính của Tannin thủy phân được (TG)

Nói chung, tannin là những hợp chất rất phân cực, phân tử lớn.

- dễ tan trong nước *, cồn-nước, aceton-nước.

• Sắc ký hấp phụ (ví dụ với Si-gel NP): Tannin thường bị hấp phụ chặt
vào pha tĩnh và rất khó giải hấp (≠ cơ chế phân bố trên Si-gel RP).

OH

- MW trung bình: có thể kết tinh được.

OH

- MW càng lớn thì càng kém tan trong nước.

→ SKC si-gel NP: tannin di chuyển rất chậm; SKLM: Rf thấp + kéo vệt.

OH

- MW thường 900 – 5000, hàm lượng / cây: thường lớn.
- chưng cất khô ở # 200 oC → các pyrogallol* (tri-OH).

O

O

O

H

OH

H

OH

OH

OH

Si

O

Si

- khả năng tạo tủa với protein: rõ rệt với ≥ triester của

TC

TG

O

O

Si

OH
O

Si

O

OH

H

OH

OH

Si

O

Si

[≥ 3 nhóm OH / glc] & [≥ 5 đơn vị galloyl] (MW ≥ 940)
O

(n) x galloyl (2) = 304 (3) = 456 (5) = 760 (8) = 1216 (10) = 1520
• Sắc ký rây phân tử: ví dụ với Sephadex (Pharmacia*)

+ 180 = MW

- với Sephadex LH-20: Rửa giải tannin với (aceton + nước).
EtOH không rửa giải các tannin được (nên dùng để loại tạp!)
- với Sephadex G-25: Rửa giải bằng nước hoặc cồn + nước.

41

4.1.3. Lý tính của các tannin ngưng tụ (TC)

484

636

940

1396

1700

(glucose = 180; acid gallic = 170; galloyl = 152 Da)

42

4.1.4. Phổ UV & Phổ IR của tannin

- tan trong cồn, trong aceton (giống TG).
- khó tan / nước, khó kết tinh (khác TG).
- MW = 500 − 20.000 (lớn hơn tannin gallic).

• Phổ UV (và phổ IR) của tannin thực tế ít được khai thác.

(OH)

- các TC có MW thấp: tan được / EtOAc.

OH
HO

- Cất khô → phloroglucinol (A), pyrocatechin (B)
Lưu ý: TC không → glucose (khác TG)
- các trimer trở lên (n ≥ 3) mới có tính thuộc da

B

OH

Nếu có, chỉ là 1 trong các tiêu chuẩn kiểm nghiệm tannin.

OH

A

• Với các tannin catechic, nếu vòng B có nhóm -OH ở

OH
OH

- 3’,4’

sẽ có λmax ~ vùng 280 nm, ví dụ (epi)catechin.

- 3’,4’,5’ sẽ có λmax ~ vùng 270 nm, ví dụ (epi)gallocatechin.

(mới được coi là Tannin Catechic chính thức)
- Tính thuộc da của các TC >> TG.

• Phổ UV của các phức màu [tannin + thuốc thử] thường

- TC chiếm # 90% tổng sản lượng tannin toàn cầu.

được khai thác hơn để định lượng tannin, polyphenol

- TC có trong lá Trà, vỏ Canhkina, hạt Nho, vỏ Thông, Quebracho,

(PP so màu th. thử vanillin-HCl, DMACA, Folin-Ciocalteu...)

cây Dẻ, Keo Acacia & nhiều cây gỗ vùng nhiệt đới.
43

44

Phổ UV của phức màu [Polyphenol + Folin-Ciocalteu Reagent]

PAC

MeOH/HCl
∆

Catechin
(ko màu)

+

Cyanidin
(màu đỏ)

45

46

47

48


B. Riêng của tannin catechic (TC)
A. Chung của 2 loại tannin TG và TC

4.2.6. Ph.ứng với ROH / H+

(OH)

OH

4.2.1. Ph.ứng tạo tủa với protein

HO

O

4.2.2. Ph.ứng kiềm phân

OH
3

4.2.3. Ph.ứng thủy phân

O

R

4.2.7. Ph.ứng với aldehyd / H+
4.2.8. Ph.ứng với aldehyd / OH−
4.2.9. Ph.ứng với dung dịch Brom.

OH

4.2.4. Ph.ứng Oxy hóa

4.2.0. Ph.ứng với

4.2.5. Ph.ứng với muối kim loại

C. Riêng của tannin gallic (TG)
Gn

B. Riêng của tannin catechic (TC)

Gn

O

O
Gn

O

4.2.b. Ph.ứng v

O
Gn

C. Riêng của tannin gallic (TG)

4.2.a. Ph.ứng v

O

O

Gn

4.2.c. Ph.ứng v
4.2.d. Ph.ứng v

49

4.2.1. Phản ứng của polyphenol/tannin với protein

protein
protein

NH

polyphenol OH

O

C
NH

R
OH

O

C
R

OH

O

tannin

R

C
NH

protein

51

52


4.2.2. Phản ứng kiềm phân
• Phức tủa [protein − tannin] sẽ dễ hình thành khi môi trường

Với kiềm đặc và nóng, tannin → các mảnh đơn giản.
(dùng để nghiên cứu cấu trúc tannin)

có pH # pHi (đẳng điện) của protein tương ứng.

(gallo)catechin

acid n-gallic, ellagic, luteolic, HHDP

• Trong m. trường kiềm, các -OH → (O−); protein cũng ở dạng

(OH)

anion: tủa phức [protein − tannin] không được tạo thành.

Gn
Gn

OH

O
O

O
Gn

HO

O

O

OH

O

• Để tạo tủa với protein, k’ thước (và MW) của các tannin phải:

Gn

Gn

O

3

O

R

OH

- đủ bé để xâm nhập được vào khe của các sợi protein.
- đủ lớn để liên kết với chuỗi peptid ở nhiều vị trí.

pyrocatechol
phloroglucinol

pyrogallol
acid gallic

53

54

OH
HO

4.2.3. Phản ứng thủy phân (bởi acid loãng, tannase)
- PG bị thủy phân → acid phenol + (glucose, acid quinic...)
- PC bị trùng hiệp → các phlobaphen màu đỏ

OH
3

CO O
HO

CO O

HO

♦

CO O

HO

OH

OH
O
OH

HO

HO

O

OH

O OC

♥
nối ester (khá bền)

OH

♦

OH

nối ester (khá bền)
OH

OH

O OC

OH

OH

ester depsid (kém bền)

OH
O

HO

HO

(OH)

HO

HO

♥

OH
OH

HO

OH
OH
HO

3

O

OH

♣

OH
OH

1''

OH
HO

OH

OH

♠
O

OH

O

OH

OH

ester ở C-3 (như EGCG, ECG...) vẫn có thể bị cắt tại vị trí ester này;
nhưng tannase, acid/kiềm loãng ko cắt được nối C − C (C4 → C6/8).

OH
OH

O

Lưu ý:
Tuy thuộc nhóm tannin ko thủy phân được, nhưng các PAC có nhóm

O

OH

OH

nối glycosid (khá bền)

nối (C − C) flavanyl (♠, rất bền)


thủy phân ko hoàn toàn

G
G

O

G

O

G

O

O

G

O

4

5
3

G

G

O

2

O

HO

G

4 x methyl gallat

pentagalloyl glucose

6

COO Me

HO

1

O

4

O
G

O

HO

6

O

O

MeOH/đệm acetat

G

O

5
3

G

G

G

O

2

O

MeOH H2SO4

1

O

G
HO

MeOH/H2SO4
thủy phân hoàn toàn

HO 4
HO

HO

6

O
5
3

HO

OH

2

COO Me

HO

1

• Nếu dùng MeOH: acid gallic thành methyl gallat

HO

glucose

9 x methyl gallat

• Nếu dùng EtOH: acid gallic thành

ethyl gallat

57

acid ellagic

X

HHDP

4.2.4. Phản ứng Oxy hóa

acid gallic

- oxy hóa yếu (không khí, dung dịch Fehling…),

O
HO

OH

OH

HO

OH

HO
CO

CO

luôn kèm theo sự trùng hiệp, tạo các sản phẩm
OH

acid / base

O

có phân tử lớn không tan / nước.
- oxy hóa mạnh (K2Cr2O7, KMnO4)

OH

O

O
O
HO

O

HO

OH

OH
OH

kèm phá vỡ cấu trúc → mảnh phân tử nhỏ hơn

OH

O

βD-glucose

HO
HO

58

O
OH
OH

Trong m.trường acid hay base, ellagi-tannin sẽ bị cắt liên kết ester → HHDP.
HHDP nhanh chóng được sắp xếp lại, đóng vòng và chuyển thành acid ellagic.
Acid ellagic này sẽ tan / môi trường (nước) và không tiếp tục cho ra acid gallic.

59

60


4.2.5. Phản ứng tạo phức với muối kim loại (của 2 loại tannin)

3+

Tannin tạo phức tủa màu với các muối Pb2+, Cu2+, Fe3+, Al3+...

O

Màu phức sẽ thay đổi tùy theo

* loại muối:

B

+
Fe

O

O

muối sắt → xanh rêu đến xanh đen.
muối chì → trắng ngà đến vàng.

O

O

* số lượng nhóm OH phản ứng (ortho-di-OH, gallo-tri-OH)
• Ứng dụng

O

4'

O

Fe

B

O

O

O − O

4'

B

Fe

B

3−

3'

O

O

3'

O

O
+
Fe

B

- loại bỏ tannin (+ tạp polyphenol) khỏi dịch chiết.
- sơ bộ nhận định số lượng nhóm –OH.

Càng nhiều nhóm -OH lân cận, màu phức sẽ càng xanh đen. Ví dụ:

• Chú ý

• Các gallo-tannin

- các phức [polyphenol - kim loại] có thể tan lại / cồn cao độ.

• Các gallo-catechin (nhóm tannin ngưng tụ, 3 nhóm OH / vòng B)

Do đó muốn loại tạp polyphenol bằng dung dịch chì acetat

hay ester 3-galloyl

(tr. tính hoặc kiềm) thì dịch cần loại tạp phải có độ cồn < 25%.
- phản ứng này không đặc hiệu cho tannin.

(nhóm tannin thủy phân được)

61

62

3+

4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)
(OH)

(OH)

B

8

HO

O

B

O

O

Fe3+

OH

A

B
O

O

(HO)

OH

- catechin & TC → sản phẩm trùng hợp không tan / nước

O
Fe

OH

4

4.2.7. Phản ứng với th’ thử Stiasny (Formol + HCl đđ; 2 : 1)

4'

OH

4'

-

4'

O

(OH)

4.2.8. Phản ứng thế trên nhân thơm (của TC)

B

- TC + halogen (nước brom …) → sản phẩm thế khó tan

Fe3+

HO

O

7

OH

O

B
2

3

5

4'

OR

O

O

B
O

- TC + HCHO/OH− → phức keo (làm keo dán gỗ!)

5'

4'

Fe
3'

4.2.9. Phản ứng với formaldehyd/kiềm (của TC)

(OH)

(OH)
5'

TG → không tạo tủa (ph. biệt với tannin TC).

2

3'

RO

3

O

7

5

OH

OH

63

64


⊕

Trong môi trường (MeOH + HCl) hay (BuOH + HCl) nóng,

4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)

các PAC (ko màu) sẽ bị cắt đứt nối C − C ( ) để cho ra:

Với MeOH, EtOH, n-BuOH trong môi trường acid (HCl...)

1. các AC⊕ có màu đỏ

a. ở nhiệt độ phòng là đủ

(từ phần “ngọn” = extension) và

2. ∆’ catechin không màu (từ phần “gốc” = terminal)

Catechin (flavan 3-ol và ∆’) → AC (màu đỏ/H+)

OH

b. ở nhiệt độ nóng (phải đun vài giờ)
8

HO

Đây còn được gọi là phản ứng alcol-phân (≠ thủy phân),

4

HO

* MeOH + acid yếu (hay dd. đệm): chỉ cắt được nối depsid
* MeOH + acid vô cơ mạnh: cắt được cả nối depsid & ester.

3

OH
O

HO

OH
3

OH

8

- Các catechin monomer, dimer... cũng cho tủa (rất lưu ý!).

O

4

O

6

OH
OH

+ HCHO / H+

methylolation

HO

(a). các vị trí H-6 / H-8 này sẽ cộng hợp với phân tử H-CHO,

B

HO

(c). để cho nhiều tổ hợp phức polymer có màu nâu đỏ gạch.

O

8

O

OH

A

OH

6

OH

8-methylol + 6-methylol

8/8-dimer

OH

8

B

O

OH
3

OH

ví dụ: 8/8-dimer

8/6-dimer

6/6-dimer

OH

CH2
HO
6

67

HO

6

A

Thuốc thử Stiasny (Formaldehyd 37% + HCl đđ.)

8

condensation

A

HO

(b). sau đó ngưng tụ lại theo nhiều cách khác nhau

3

66

OH

HO2HC

OH

TC (+) là do vòng thơm A còn có H tự do (H-6 và/hay H-8):

OH

OH

catechin

- Đây là 1 phản ứng đơn giản để phân biệt TG và TC.

3

OH

A

OH

- Các tannin pyrogallic (TG) thì không cho tủa vón nặng.

8

HO

OH

6

OH

catechin (277 nm)

CH2OH

OH

A

H

O

ROH/H+ ∆

OH

8

HO

2

OH

H

[Dịch TC loãng] + [th’.thử Stiasny] → tủa vón nặng, màu đỏ gạch.

được mô tả với 2 tỉ lệ (2 : 1) hay (1 : 1) tùy tài liệu.

OH

procyanidin (λmax 280 nm)

4.2.7. Phản ứng với thuốc thử Stiasny* 1905, (HCHO + HCl)

cyanidin
(280; 535 nm)

OH

OH

OH

65

3

2

4

(ko cắt được nối ester bình thường) trong tannin gallic.

OH

OH

8

(gốc)

4

ROH/H+ ∆

OH

OH

là một phản ứng oxy-hóa cắt mạch (oxidative cleavage).

O

1

O

(ngọn)

8

HO

OH

Tannin catechic (PAC) → → AC (màu đỏ/H+).

1

OH

polymerization
↓ tổ hợp sản phẩm ↓

Theo T. Takano et als (2008), J. Wood Sci., 54, 329-331


Tham khảo: Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz)
của [catechin − HCHO] và [catechin].

Các aldehyd thơm thường dùng: dimethyl-amino-cinnamaldehyd
8

HO

catechin

7

(DMACA) hay vanillin. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid.

O

A

Các catechin (và PAC, TC) có H tự do ở 6/8 sẽ tạo phức với

6
5

adehyd thơm này.

OH

MeO

CHO

Me

HCHO

DMACA:

N

HO

: VANILLIN

CHO

Me

H

O

8

CH2
8

HO

CHO H

A

catechin-HCHO

8

HO
A

Ar

O

H

8

HO

Ar

6

OH

A
CH
OH

H

−H2O

Ar

6

8

HO

OH

A
6

OH

OH

69

OH
HO

O

OH

H
Ar

C

H

O

HO

8

HO
CHO H

O

OH

H
Ar

HO

−H2O

Ar

OH
OH

CH
OH

OH

−H2O
6

O

OH

OH

OH
HO

O

6

OH

OH

Me

p-dimethylamino-cinnamaldehyd = DMACA

A

CH

CHO

Me

OH
8

HO
V

ảo
kh

OH

H

MeO

OH

C
OH

OH

OH

OH

HO

O

6

OH

am
Th

N

A

+

V

MeO

OH

OH

H

70

O

8

HO
V

OH

H
O

OH

A

MeO

OH
OH

72


ảo
kh
m
a
Th
DMACA is a dye particularly useful for localization of PACs in plant
histology. The use of the reagent results in blue staining.

It can also be used to titrate PACs. A colorimetric assay based upon
the reaction of A-rings with the chromogen.

am
Th

ảo
kh

p-Dimethylaminocinnamaldehyd = DMACA

DMACA has been developed for flavanoids (monomer) in beer that
can be compared with the vanillin procedure.
The DMACA reagent may be superior to the vanillin procedure for
the detection of catechins (monomer!).
DMACA (+) to monomer & polymer of catechins!
The DMACA reagent changes color over several days when exposed
to air but when refrigerated can be stored for up to 2 weeks.
The DMACA reagent # the Renz & Loew reagent.
73

74

4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3

4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3
Với [MeOH + H2SO4], các TG sẽ cho glucose và methyl gallat.
Methyl gallat tiếp tục bị oxy hóa bởi KIO3 → phức màu đỏ.
(đo màu ở 525 – 550 nm).
Tham khảo: methalolysis

4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)
Sau thủy phân, acid gallic tự do được tác dụng với dung dịch
rhodanin/MeOH, trong môi trường kiềm, để cho các sản phẩm
có màu hồng đỏ. (đo màu ở 520 nm).

75

LOD = 1,5 µg methyl gallat

76


Lưu ý chung: Do có nhiều nhóm -OH nên tannin rất phân cực !

4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)

Nên chọn dung môi chiết, rửa tạp theo hướng sau:

Nói chung, hiệu suất chiết tannin sẽ:
- tăng theo to và pH, theo độ mịn của bột dược liệu.
- tăng nếu được hỗ trợ bởi siêu âm, vi ba (microwave).
- tăng khi có mặt # (5 – 10%) Na2CO3
- giảm khi có mặt của NaCl, NH4SO4
77

Nếu chiết bằng CO2 siêu tới hạn, cần phải có thêm EtOH, MeOH.

Có thể “thử & sai” theo 1 số cách sau

Trong nghiên cứu, việc chiết xuất / phân lập tannin nhằm mục đích:

A. Loại bỏ tannin như 1 tạp phân cực

1. Kết tủa tannin bằng dung dịch protein (gelatin, BSA...)

Phương pháp: Kết tủa tannin với protein, muối kim loại, NH4SO4...

Cho dd. protein vào dịch chiết giàu nước, khuấy đều, đun nóng,

B. Thu được dịch chiết / phân đoạn giàu tannin (hỗn hợp)

và dễ dàng được tách khỏi dịch chiết.

Phương pháp: Chiết xuất bằng dung môi phân cực &

Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.

rồi để nguội. Tannin sẽ bị vón lại (nổi lên khi dùng lòng trắng trứng)

Loại bỏ tạp kém ph.cực bằng dung môi kém ph.cực.
2. Hấp phụ tannin vào diatomite (= diatomaceous earth, Kieselguhr)

C. Thu được 1 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm tannin

Với Celite® 545 (Sigma-Aldrich): Dịch chiết + 5% bột Celite (w/w)

Phương pháp: Chiết lấy phân đoạn giàu tannin,

Khuấy đều, để lắng, gạn và lọc thu dịch.

Kết tủa hoặc kết tinh phân đoạn.

Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.

Có thể kết hợp với sắc ký (hấp phụ, rây phân tử...)

Nếu tăng % Celite®: có thể bị hấp phụ mất 1 phần chất nghiên cứu.

Đôi khi: Sắc ký HPLC-chế hóa.
79

80


3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat (cont.)

3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat

Tùy mức độ chọn lọc cần thiết, cho 1 lượng thừa CAK (hay CAT) vào

• Chì acetat kỹ thuật (= đường chì) thường còn lẫn 1 ít PbO.

dịch chiết (có độ cồn < 25%, vì tủa polyphenol-chì có thể tan lại 1
phần trong môi trường chứa nhiều cồn).

• Khi hòa tan / nước (max 30%) sẽ tạo Pb(OH)2 làm dung dịch đục

Khuấy kỹ, để lắng > 12 giờ. Gạn, rồi lọc bỏ tủa bùn (polyphenol-chì)

và có tính kiềm (gọi là dung dịch chì acetat kiềm, CAK).

Dịch lọc tiếp tục được loại bỏ chì thừa bằng dd. Na2SO4 15%...

• CAK + AcOH đến khi trong suốt → dd. chì acetat trung tính (CAT).

......

• CAK có thể kết tủa với hầu hết các polyphenol (CAK ít chọn lọc).

Chú ý:

• CAT ưu tiên kết tủa các polyphenol có nhiều nhóm OH kế cận nhau

- Muối chì rất độc! Nên thận trọng & rất hạn chế sử dụng.

như o-diphenol, ∆’ catechin, ∆’ galloyl, gallat... (CAT chọn lọc hơn).

- Dịch chiết cồn thường được cô thu hồi bớt cồn, rồi thêm nước.
81

4. Kết tủa tannin bằng (NH4)2SO4

82

Không có 1 quy trình chung để chiết xuất các tannin từ mọi
dược liệu. Tuy nhiên, có thể dựa vào sơ đồ chung như sau:

5. Các phương pháp loại bỏ tannin khác
Có thể kết tủa tannin bằng dung dịch PVPP ở pH ~ 3

- Chiết tannin = nước nóng, MeOH/EtOH-nước, aceton-nước

- Cô thu hồi bớt dung môi.
- Kết tủa tannin với d. dịch ammoni sulfat bão hòa, lọc lấy tủa.
- Chiết tannin từ tủa này với aceton, lọc lấy dịch aceton,
cô thu hồi aceton → cắn tannin thô.
- rửa cắn tannin thô với Et2O → tannin tinh khiết hơn.

83

84


Trên thực tế, hay sử dụng ammonium sulfat dưới dạng phân hóa học
SA (phân muối diêm), dạng rắn, để kết tủa tannin...

HPLC
85

86

1

(PAC)

87

88


2

3

89

90

91

92

Trên thực tế, rất ít khi phân lập 1 tannin tinh khiết (acid tannic).
Rất khó phân lập tannin thành từng cấu tử tinh khiết riêng biệt,
ngay cả khi dùng các kỹ thuật như pHPLC...
Thường sử dụng nhất: Hỗn hợp toàn phần, chứa khoảng < 50%
tannin (công nghiệp thuộc da, keo dán gỗ, nước giải khát...).
Có khi sử dụng ph.đoạn giàu tannin tách từ hỗn hợp dịch chiết.
Có thể tham khảo một sơ đồ nguyên tắc chung như sau:


6.1.3. Phản ứng với dung dịch gelatin-muối

6.1. Định tính chung
6.1.1. Phản ứng với muối kim loại (không chuyên biệt)
- với d.dịch FeCl3 loãng

→ xanh rêu / lá / xanh đen

- với d.dịch chì acetat

→ tủa trắng ngà / vàng

dd. chì acetat tr.tính → (+) với các ortho-diphenol,
dd. chì acetat kiềm

→ (+) với mọi -OH phenol

(chì acetat kiềm mạnh hơn chì acetat trung tính).

- 2 loại tannin + d.dịch gelatin-muối → đều cho tủa
(dùng để loại bỏ cả 2 loại tannin TC + TG ra khỏi dịch chiết)
6.1.4. Phản ứng thuộc da (Goldbeater’s skin test)
- ngâm da sống vào HCl 2%, rửa = H2O
- nhúng da vào dung dịch tannin trong 5 phút, rửa = H2O
- + d.dịch FeSO4 loãng → màu nâu, đen (có TG hay TC)

6.1.2. Phản ứng với d.dịch muối alkaloid (quinin ...)
- dịch tannin + d.dịch muối alkaloid → tủa bông trắng.

6.1.5. Phản ứng với dung dịch Phenazon (ít thông dụng)
- d.dịch tannin + Na2HPO4 + Phenazon 2% → tủa màu

Nhận diện các pseudo-tannin
6.2. Định tính phân biệt (tannin gallic vs tannin catechic)
Tính chất

TG

TC

thủy phân

được

không

độ tan/nước

dễ tan

kém tan

kiềm chảy →

pyrogallol

pyrocatechin

+ FeCl3

xanh đen

xanh lá *

+ Stiasny

không

↓ vón nặng

+ nước Brom

không

↓

94


Nhận diện tannin gallic & acid (di)gallic tự do

Nhận diện catechin tự do, tannin catechic
Thường dùng phản ứng trên gỗ của que diêm (có lignin):
• Nhúng 1 que diêm gỗ (có lignin) vào 1 d.dịch tannin catechic (TC).
• Nhúng tiếp vào d.dịch HCl, hơ nóng kế ngọn lửa → màu hồng pink.
Cơ chế: TC, catechin bị phá vỡ cấu trúc bởi HCl nóng → phloroglucinol.
phloroglucinol + Lignin (của gỗ que diêm)

→ màu hồng

OH
HO
HO

HO

O

Gn

HO

COOH

HO

CO

O

HO

HO

(G2)

(G1)

OH

O

OH

O

O
3

COOH

O

OH
A

+ lignin

màu đỏ hồng

OH

Gn

1

Gn

HO

HO

+ HCl ∆

OH

6

O

Gn

Gn

HO

O
A

97

98

6.3. Sắc ký các tannin (SKLM)
Tannin rất phân cực → khó sắc ký / silica gel NP.
• Chuẩn bị mẫu: chiết mẫu bằng aceton-H2O, (ROH-H2O), cô.
Loại chlorophyll & chất béo (thêm nước, lắc với EP, CF, DCM).

chebulinic acid
chebulagic acid

Chiết lấy phần tan trong EtOAc (mono & oligomer TC...).
Có thể hòa trong AcCN (acid ellagic sẽ không tan)
• Dung môi khai triển
- với PG:

Bz – aceton

(6:1)

- với (PG + PC):

Bz – HCOOEt – formic (2:7:1)
CF – HCOOEt – formic (1:7:1)
Toluen – CF – aceton

(1:1:1)

• Hiện màu: với PG + PC → phun FeCl3 1% (xanh, xanh đen)
với PC → dùng thuốc thử AS (→ đỏ gạch)

100