Nghiên cứu quy trình tổng hợp imatinib mesylate dùng làm thuốc điều trị ung thư máu (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

Nguyễn Thị Thu

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP IMATINIB MESYLATE
DÙNG LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƢ MÁU
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN QUỐC VƢỢNG

Hà Nội - năm 2015

MỤC LỤC


LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
CÁC KÍ KIỆU VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 6

1.1. BỆNH UNG THƢ MÁU VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ................................ 6
1.1.1. Những hiểu biết về bệnh ung thƣ máu .............................................................. 6
1.1.2. Phân loại bệnh ung thƣ máu và phƣơng pháp điều trị .................................... 7
1.2. Imatinib mesylate .................................................................................................. 9
1.2.1. Lịch sử hình thành và quá trình phát triển .................................................... 10
1.2.2. Cơ chế tác dụng ................................................................................................. 11
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................... 22
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22
2.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ......................................................................... 22
2.1.2.Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng, phân lập và tinh chế sản phẩm ................... 23
2.1.3. Phƣơng pháp pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ............ 25
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 26
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM.................................................................................. 28
2.1. Hóa chất và thiết bị............................................................................................... 28
2.1.1 Hóa chất ............................................................................................................... 28
3.2. Tổng hợp nguyên liệu đầu ................................................................................... 29
3.2.1. Tổng hợp 3-(Dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (7) .............. 29
3.2.2 Tổng hợp 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (21) .......................................... 31
3.3. Tổng hợp các hợp chất trung gian ...................................................................... 33
3.3.1 Tổng hợp N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl) pyrimidin-2amine (8) ........................................................................................................................ 33
3.3.2 Tổng hợp chất 6-methyl-N-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine
(9) ................................................................................................................................... 36


3.3.3.

Tổng

hợp

4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)

pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide (12) ............................................................ 42
3.4. Phản ứng amine hóa điều chế imatinib base (2) ................................................ 46
3.5. Phản ứng tạo muối imatinib mesylate (3)........................................................... 49
3.6. Phƣơng pháp tinh chế imatinib base .................................................................. 51
3.7. Phƣơng pháp HPLC xác định hàm lƣợng của sản phẩm imatinib
mesylate ........................................................................................................................ 51
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 52
4.1. Quy trình tổng hợp nguyên liệu đầu ................................................................... 55
4.1.1. Hợp chất 3-(Dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (7)............. 55
4.1.2.Hợp chất 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (21).......................................... 56
4.2. Quy trình tổng hợp các sản phẩm trung gian .................................................... 59
4.2.1. Hợp chất N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine(8) .......... 59
4.2.2. Tổng hợp 6-Methyl-N-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine
(9) ................................................................................................................................... 62
4.2.3.

Tổng

hợp

4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-

yl)pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide (12) ........................................................ 63
4.3. Quy trình amine hóa điều chế imatinib base (2)................................................ 65
4.4. Quy trình tạo muối imatinib mesylate (3) .......................................................... 68
4.5. Việc tinh chế imatinib base .................................................................................. 69
4.6. Hàm lƣợng imatinib mesylate theo kết quả HPLC ........................................... 69
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 71

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 74


MỞ ĐẦU
Bệnh ung thư máu hay còn gọi là bệnh ung thư bạch cầu xuất hiện
300,000 ca bệnh mới mỗi năm trên thế giới (chiếm 2,8% trong số tất cả các
bệnh ung thư) và 220,000 người chết vì bệnh ung thư máu hàng năm. Độ tuổi
thường gặp đối với bệnh ung thư máu dưới 15 tuổi là 21,7% và trên 15 tuổi là
78,1% và chủ yếu từ 35 - 69 tuổi, đa số các bệnh nhân bị bệnh bạch cầu cần
được điều trị với liệu pháp chữa bệnh bằng hóa chất (còn gọi là hóa trị), một
số khác điều trị bằng phóng xạ (xạ trị), ghép tủy xương hoặc sử dụng liệu pháp
sinh học.
Trước đây trong việc điều trị ung thư, người ta thường áp dụng phương
pháp "ném bom rải thảm" nhưng sau này với tiến bộ khoa học liệu pháp nhằm
trúng đích đã được đưa ra đem đến hiệu quả cao và đỡ gây hại cho người
bệnh, liệu pháp này có tên là "liệu pháp nhắm trúng phân tử". Liệu pháp nhắm
trúng đích tác động trực tiếp vào các phân tử đặc biệt trong cơ chế sinh ung và
sự tăng trưởng của khối u do đó làm dừng sự tăng trưởng và phân đôi của tế
bào ung thư. Liệu pháp này có thể dùng các loại thuốc riêng lẻ hoặc kếp hợp
với nhau hoặc kèm thêm các liệu pháp xạ trị, quang trị… Hiện nay có hàng
trăm sản phẩm loại này đang được thử nghiệm lâm sàng trong đó có một số đã
được cấp phép lưu hành, cụ thể là biệt dược gleevec (glivec), hoạt chất chính
là imatinib mesylate hay gọi tắt là imatinib. Imatinib là chất ức chế proteintyrosinekinase, nó ức chế đặc hiệu Ber-Abltyrosine kinase (phân tử bất thường
gây bệnh bạch cầu tuỷ mạn) bằng cách ngăn không cho Ber-Abl gắn kết với
A.T.P. Nó tác động chính xác lên phân tử gây bệnh, tỷ lệ đáp ứng về mặt
huyết học và di truyền học tế bào rất cao có khả năng đưa người bệnh trở lại
cuộc sống bình thường.
Hiện nay, bệnh ung thư máu đang có chiều hướng gia tăng nhanh ở nước ta.
Việc ra đời của của imatinib như là thần dược đối với các bệnh nhân ung thư máu,

tuy nhiên chi phí điều trị cho 1 bệnh nhân rất cao, khoảng 2000 đô la mỗi tháng
đang là trở ngại lớn về tài chính đối với người bệnh. Để đáp ứng nhu cầu cấp thiết


ngày càng tăng của người bệnh, Chương trình hóa dược - Bộ Công thương đã phê
duyệt thực hiện đề tài tổng hợp thuốc chống ung thư máu imatinib mesylate do
Viện Hóa sinh biển chủ trì.
Với mong muốn đóng góp đạt được mục tiêu của chương trình Hóa dược,
trong khuôn khổ của một luận văn Thạc sĩ chúng tôi đã lựa chọn thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu quy trình tổng hợp imatinib mesylate dùng làm thuốc điều trị ung
thư máu”.
Các mục tiêu chính của luận văn là:
-

Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất đầu, các hợp chất trung gian và tổng
hợp imatinib base

-

Nghiên cứu phản ứng tạo muối imatinib mesylate từ imatinib base

-

Xác định cấu trúc các hợp chất đã tổng hợp bằng phương pháp phổ
hồng ngoại, phổ cộng hưởng hạt nhân, và phổ khối lượng.

-

Xác định hàm lượng của imatinib tổng hợp bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. BỆNH UNG THƢ MÁU VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ
1.1.1. Những hiểu biết về bệnh ung thƣ máu
Ung thư máu hay còn gọi là ung thư bạch cầu là một loại bệnh ác tính
có tính dòng vô tính ở tế bào gốc tạo huyết. Tế bào bệnh ung thư máu trong
dòng vô tính làm mất đi khả năng phân hóa và ngưng lại ở các giai đoạn khác
nhau trong quá trình phát triển tế bào. Trong tủy và những cơ quan tạo máu
khác, tế bào bệnh ung thư máu tăng sinh và tích tụ với một lượng lớn rồi xâm
nhập vào những cơ quan và bộ phận khác gây ức chế sự tạo máu bình thường
[1]. Khi bệnh ung thư máu phát triển, cơ thể sản sinh một số lượng lớn những tế
bào bạch cầu dị thường, đó là những tế bào non không thực hiện được chức
năng của bạch cầu bình thường. Việc tăng nhanh chóng số lượng lớn bạch cầu
dị thường làm giảm hồng cầu và tiểu cầu trong cơ thể làm cho người bệnh bị
thiếu máu dẫn đến chết. Đây là căn bệnh ung thư duy nhất không tạo ra u (ung
bướu), bệnh nhân thường chỉ sống thêm khoảng từ 6 tháng đến 4 năm kể từ khi
xuất hiện các triệu chứng mệt mỏi và sút cân. Đến nay đã có một số biện pháp
điều trị bệnh ung thư máu nhưng hiệu quả không cao và rất tốn kém như tiếp
máu, hóa trị liệu,xạ trị, quang trị hoặc thay tủy v. v. Việc điều trị ung thư máu
hay chữa trị bệnh ung thư máu dựa vào các giai đoạn của bệnh. [29, 30, 31]
Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh ung thƣ máu: Nguyên nhân bệnh
ung thư máu ở người vẫn chưa rõ, có thể có liên quan tới các nhân tố sau: nhân
tố virus, bức xạ điện ly, nhân tố hóa học (benzene, chất alkylating trong thuốc
chống ung bướu, bimolane chuyển hóa từ ethylenedeiamine tetracetylimide,
chloramphenicol, phenylbutazone…), nhân tố di truyền (hội chứng Down, hội
chứng Bloom, chứng thiếu globulin loại C bẩm sinh,…), những bệnh máu


khác cuối cùng có thể phát triển thành bệnh ung thư máu. Sắc thể có thể liên

quan tới bệnh nhưng không phải nguyên nhân gây ra bệnh. [1, 30]
1.1.2. Phân loại bệnh ung thƣ máu và phƣơng pháp điều trị
Dựa vào mức độ hoàn chỉnh của tế bào bệnh ung thư máu và bệnh trình
tự nhiên, bệnh ung thư máu có thể chia làm hai loại lớn, cấp tính và mãn tính.
Tế bào bệnh ung thư máu cấp tính ngưng phân hóa ở giai đoạn khá sớm, phần
lớn là tế bào nguyên thủy và tế bào non thời kỳ đầu, bệnh tình phát triển
nhanh, bệnh trình tự nhiên chỉ vài tháng. Tế bào bệnh ung thư máu mãn tính
ngưng phân hóa ở giai đoạn khá muộn, phần lớn là tế bào non khá hoàn thiện
và tế bào trưởng thành và bệnh ung thư máu ở tế bào nhung mao hiếm thấy,
bệnh ung thư máu ở tiền tế bào lympho… Bệnh tình phát triển chậm, bệnh
trình tự nhiên là vài năm. Bốn dạng bệnh bạch cầu thông thường là: Bệnh
Bạch Cầu Nguyên Bào Cấp Tính (Acute Lymphoblastic Leukaemia – ALL);
Bệnh Bạch Cầu Bạch Huyết Bào Mạn tính (Chronic Lymphocytic Leukaemia
– CLL); Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Cấp Tính (Acute Myeloid Leukaemia –
AML) và Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Mạn tính (Chronic Myeloid LeukaemiaCML)
a. Bệnh bạch cầu nguyên bào cấp tính (Acute lymphoblastic Leukaemia ALL. Còn gọi là acute lymphocytic hay acute lymphatic leukaemia)
Bệnh bạch cầu ALL thường xảy ra với trẻ em, nhưng cũng xảy ra với
người lớn, là bạch huyết bào còn non – tức là bạch cầu thuộc hệ bạch huyết,
do đó, gọi là nguyên bào bạch huyết bào (lymphoblasts).
Trị liệu: Bệnh bạch cầu dạng này thường có thể trị liệu hữu hiệu bằng
liệu pháp hóa học. Đối với trẻ em, ALL có thể tương đối dễ trị, có đến 75% trẻ
em bị bệnh bạch cầu dạng này, khi được trị liệu, bệnh thuyên giảm hoàn toàn
và sau đó dứt hẳn, ALL cần phải được trị liệu đặc biệt, gọi là cách điều trị não
bộ hay hệ thần kinh trung ương dự phòng (brain hay central nervous system
prophylaxis).Nhiều hóa chất dùng để trị ALL bị màng não cản lại, nhưng tế
bào bệnh bạch cầu thì đi qua được để tránh trường hợp này sử dụng trị liệu não
và trị liệu màng não không cho tế bào bệnh bạch cầu ẩn núp tại những nơi này


trong lúc điều trị bằng hóa chất, rồi tiếp tục phát triển sau khi ngưng điều trị.

Cách trị liệu này là chích thuốc vào cột sống, ở lưng, hay có khi điều trị bằng
cách rọi tia bức xạ vào não hay cột sống, nhưng cách này ít được sử dụng hơn,
bệnh nhân sau khi trị liệu lần đầu, bệnh tái phát, thì có thể trị bằng phương
pháp ghép tế bào mầm.
b. Bệnh bạch cầu bạch huyết bào mạn tính (Chronic lymphocytic leukaemia –
CLL. Còn gọi la chronic lymphatic hay chronic lymphoid leukaemia)
Đây là dạng bệnh bạch cầu mạn tính hay tiến triển chậm, tương tự như
ALL, bệnh này ảnh hưởng đến bạch huyết bào, thường gặp ở người lớn tuổi
hiếm gặp ở trẻ em, tuy nhiên bệnh vẫn có thể mắc phải ở mọi lứa tuổi. Vì bệnh
tiến triển chậm, bạch huyết bào và các tế bào khác không bị tràn ngập nhanh
như trường hợp bệnh cấp tính, như vậy, bệnh nhân bị CLL có thể không cảm
thấy có triệu chứng gì lạ, mãi cho đến khi bệnh đó khá phát triển rồi mới phát
hiện ra, có những trường hợp không phải trị liệu.
Trị liệu: Nếu bệnh tiềm ẩn thì không phải trị liệu và bệnh nhân có thể
sinh hoạt bình thường nhiều năm, khi bệnh hoành hành, thì có thể trị bằng liệu
pháp hóa trị hay xạ trị. Nói chung, không thể trị dứt hẳn CLL, nhưng bệnh
nhân thường vẫn sống khỏe mạnh trong nhiều năm.
c. Bệnh bạch cầu tủy bào cấp tính (Acute myeloid leukaemia – AML. Còn
gọi là acute myelocytic, acute granulocytic hay acute myelogenous
leukaemiabệnh)
Bệnh bạch cầu tủy bào cấp tính ảnh hưởng đến các tế bào thuộc gia đình
tủy bào. Gia đình tủy bào gồm có bốn loại tế bào máu:bạch cầu hạt, bạch cầu
đơn nhân to, hồng cầu, tiểu cầu. Bệnh bạch cầu dạng này có thể xảy ra với trẻ
em và thanh thiếu niên nhưng thông thường thì người lớn dễ bị bệnh này hơn.
Trị liệu: Khi trị liệu, bệnh AML của một số người thuyên giảm hoàn
toàn (tức là không bị bệnh dài hạn). Tuy nhiên, những cách trị liệu mới có thể
nâng cao xác suất sống còn của bệnh nhân.


d. Bệnh bạch cầu tủy xƣơng mãn tính (CML) (Chronic myeloid leukaemia CML. Còn gọi là chronic myelogenous, chronic granulocytic hay chronic myelocytic

leukaemia)
Bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính (CML) là một loại ung thư phổ biến
của các tế bào máu. Thuật ngữ "mãn tính" trong bệnh bạch cầu mãn tính tủy
xương chỉ ra rằng bệnh ung thư này có xu hướng tiến triển chậm hơn so với
các hình thức cấp tính của bệnh bạch cầu. Thuật ngữ "tủy xương" trong bệnh
bạch cầu mãn tính tủy xương dùng để chỉ các loại tế bào bị ảnh hưởng bởi
bệnh ung thư này.
Bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính cũng có thể được gọi là bệnh bạch
cầu myeloid cấp mãn tính và bệnh bạch cầu mãn tính granulocytic. Bệnh bạch
cầu tủy xương mãn tính thường ảnh hưởng đến người cao niên và hiếm khi
xảy ra ở trẻ em, mặc dù nó có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi.
Trị liệu: Mục tiêu của điều trị bệnh bạch cầu mãn tính tủy xương là loại
trừ các tế bào máu có chứa các gen BCR - ABL bất thường gây ra những dư
thừa của các tế bào máu bị bệnh. Đối với hầu hết mọi người, nó không thể loại
bỏ tất cả các tế bào nhiễm bệnh, nhưng điều trị có thể giúp đạt được một thuyên
giảm lâu dài của bệnh.
1.2. Imatinib mesylate
CTCT, CTPT, tên IUPAC
N
H
N

N

N

N
HN
N

CH3SO3H
O

Imatinib mesylate
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của imatinib mesylate
Công thức phân tử của imatinib mesylate: C29H31N7O.CH4SO3
Trọng lượng phân tử: 589,71


Tên IUPAC: 4-[(methylpiperazin-1-yl)methyl]-N-[4-methyl-3-[(4-pyridin-3yl) pyrimidin-2-yl)amino]phenyl]benzamide mesylate.
Imatinib mesylate được tạo thành từ dạng imatinib base trung hòa với
methane sulfonic acid để tăng khả năng tan trong nước.

Imatinib base

Imatinib mesylate

Hình 1.2: Sự tạo muối của imatinib base thành imatinib mesylate
Cấu tạo phân tử imatinib base bao gồm hệ vòng dị tố
pyridinepyrimidine, nhân methylphenylamine, nhóm methylbenzamide và
nhóm methylpiperazine liên kết với nhau bởi các liên kết amine và amide .
1.2.1. Lịch sử hình thành và quá trình phát triển
Lịch sử hình thành
Imatinib được ra đời vào cuối những năm 1990 bởi 3 nhà khoa học:
Nicholas Lydon- Nghiên cứu viên về Hóa sinh của hãng Novartis, Brian
Druker nghiên cứu về ung thư học của trường Đại học Sức khỏe và Khoa học
Oregon (Mỹ) và Charles Sawyers của Trung tâm ung thư Kettering. Imatinib
được phát triển theo quá trình thiết kế thuốc dựa vào những hiểu biết về sinh
học và kỹ thuật sinh học phân tử, sự phân tích ảnh hưởng của cấu trúc phân tử
đến tác dụng của nó thông qua các mô hình từ đó phán đoán xây dựng cấu trúc

mới với chức năng xác định. Sau khi phát hiện ra sự hình thành nhiễm sắc thể
bất thường philadelphia và hỗn hợp protein bcr-abl là nguồn gốc gây bệnh ung
thư máu, các nhà khoa học đã điều tra sàng lọc thư viện hóa học để tìm ra
thuốc ức chế protein đó và xác định được cấu tử 2-phenylaminopyrimidine.
Cấu tử dẫn đường này đã được kiểm tra và biến tính với sự đưa vào nhóm
methyl và benzamide để tăng cường tính liên kết và kết quả đã thu được
imatinib base.


Hình 1.3: Quá trình của sự sàng lọc các dẫn suất của
phenylaminopyrimidin dẫn tới imatinib base
Quá trình phát triển
Năm 1993, hoạt chất Imatinib mesylate được đưa thử nghiệm.
Năm 1996, Imatinib mesylate được cấp bằng sáng chế, hết hạn vào 2015.
Năm 2001, Imatinib mesylate được FDA chấp thuận sử dụng tại Hoa Kỳ và
được đưa ra thị trường dưới tên: Gleevec ở Hoa Kỳ, Glivec ngoài Hoa Kỳ,
Imatinib Mesylate.
Năm 2013, được FDA chấp thuận sử dụng điều trị ung thư bạch cầu cấp Acute
Lymphoblastic Leukemia (ALL) trong nhi khoa.
1.2.2. Cơ chế tác dụng
Hầu hết các tế bào máu phát triển từ những tế bào tủy xương được gọi
là tế bào gốc (stem cell), những tế bào gốc trưởng thành, hoàn thiện trở thành
tế bào gốc myeloid hoặc lymphoid rồi phân tách chuyển hóa thành những loại
tế bào máu khác nhau, mỗi loại có một chức năng đặc biệt. Tế bào gốc
myeloid phân tách thành: Các tế bào bạch cầu (white blood cells) trợ giúp
chống truyền nhiễm; Các hồng cầu(red blood cells) chuyên trở oxy đến các mô
trải khắp cơ thể; Các tiểu cầu (platelets) trợ giúp sự đông máu để kiềm chế sự
chảy máu; các tế bào này sinh ra khi cơ thể cần đến chúng sau đó chúng sẽ
chết đi và các tế bào mới thay thế chúng. Sau khi rời tủy xương, tế bào hồng
cầu sống được khoảng 4 tháng, bạch cầu chỉ sống được một vài tiếng, tiểu cầu

sống được vài ngày. Trong người bệnh ung thư bạch cầu, tủy xương tạo ra
những bạch huyết cầu bất thường, những bạch huyết cầu bất thường này


không chết đi khi chúng nên chết mà chúng chiếm chỗ, lấn át các hồng huyết
cầu và tiểu cầu gây khó khăn cho việc thực hiện nhiệm vụ của các tế bào máu
bình thường. Đối với bệnh ung thư bạch cầu mãn tính (chronic leukemia), ở
giai đoạn đầu người bệnh không có bất cứ triệu chứng nào về bệnh mà thường
được phát hiện qua khám bệnh định kỳ. Khi số lượng tế bào ung thư bạch cầu
gia tăng đến độ nhất định bệnh nhân sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh và bệnh
nhân thường chỉ sống thêm được 4 đến 5 năm nữa. Đối với bệnh ung thư bạch
cầu cấp tính (Acute leukemia), số lượng ung thư bạch cầu gia tăng nhanh và
tình trạng bệnh xấu đi nhanh chóng, bệnh nhân có thể chết sau vài tháng phát
bệnh. Trong ung thư bạch cầu mạn, do sự hợp nhất các gene bcr và abl (là các
gene bình thường trên các nhiễm sắc thể 22 và 9 tương ứng) hình thành lên
nhiễm sắc thể bất thường philadelphia bcr-abl có hoạt tính mới khó kiểm soát.
(Hình 1.4)

Hình 1.4: Sự hoán vị bất thường hình thành nhiễm sắc thể philadelphia


Hình 1.5: Chức năng của protein kinase [ADP , adenosine diphosphate;
ATP adenosine triphosphate]
Trong cơ thể, các men tyrosine kinase giữ vai trò quan trọng là chuyển
các nhóm phốt phát từ adenosine triphosphate (ATP) vào protein trong tế bào.
Các nhóm phốt phát này gắn vào các amino acid trên protein. Quá trình phốt
phát hóa của protein bởi các men tyrosine kinase là cơ chế rất quan trọng về sự
truyền thông tín hiệu trong tế bào liên quan đến các hoạt động của tế bào như
sự phân chia, sự sống và phát triển của tế bào. Imatinib là dẫn xuất của 2phenylaminopyrimidine có chức năng ức chế đặc biệt một số men tyrosin
kinase, nó chiếm cứ vị trí hoạt động của tyrosin kinase (TK) dẫn đến làm giảm

hoạt động của tế bào. Imatinib đặc hiệu đối với sự chiếm hữu TK trong abl
(the albelson proto-oncogene) là gen gây đột biến ung thư (Hình 1.5, hình
1.6).


Hình 1.6: Imatinib chiếm cứ vị trí hoạt động tyrosine kinase của tế bào
Vì vậy imatinib điều trị đặc biệt hiệu quả với bệnh ung thư bạch cầu
(bệnh ung thư máu).
1.2.3.Các phƣơng pháp tổng hợp imatinib mesylate
Sự hình thành của imatinib mesylate

Hình 1.7: Sơ đồ tổng hợp ngược của imatinib mesylate
Imatinib mesylate được tạo thành từ imatinib base bởi sự trung hòa với
methanesulfonic acid như trong Hình 1.7, để tổng hợp imatinib mesylate trước
hết phải tổng hợp imatinib base. Phân tử Imatinib basecó thể chia ra làm 4


phần: phần1 là phần gốc gồm hệ vòng dị tố pyridinepyrimidine, phần 2 là
nhân methylaminphenyl, phần 3 là nhóm methylbenzamide và phần 4 là nhóm
methylpyperazine liên kết với nhau qua các liên kết amine và amide. Các phản
ứng bao gồm phản ứng ngưng tụ đóng vòng tạo hệ vòng dị tố pyridine pyrimidine
(phần 1), phản ứng kết hợp amine với arylhalide để tạo liên kết phần 1 và phần
2 hay với alkylhalide tạo liên kết amin C-N liên kết phần 3 và phần 4, phản
ứng axyl hóa amine tạo liên kết amide CONH- liên kết phần 2 và phần 3
(nhóm benzamide). Các hướng tổng hợp có thể bắt đầu từ tổng hợp phần 1 và
phần 2 bao gồm hệ vòng dị tố pyridinepirimidine (Phần 1) và nhóm
phenyldiamine bằng phản ứng ngưng tụ, sau đó lần lượt kết hợp với phần 3 và
phần 4: Hoặc cũng có thể bắt đầu từ phản ứng kết hợp để tổng hợp phần 3 và
phần 4 trước sau đó kết hợp với các phần 2 , 1 còn lại; Hoặc cũng có thể bằng
phản ứng kết hợp phần 2 và phần 3 trước sau đó tiến hành phản ứng ngưng tụ

đóng vòng với tác nhân phù hợp để tạo hệ vòng dị tố pyridinepyrimidine sau
đó kết hợp với phần 4 thu được imatinib base.
Phương pháp của Zimmermann: Imatinib được tổng hợp đầu tiên bởi
Zimmermann vào năm 1993 (Hình 1.8). [25,26]
Phương pháp này đi từ 2 nguyên liệu đầu là 2-amino-4-nitrotoluene 4
để tổng hợp hợp chất 3-Nitro-2-methylphenylguanidine 5 và nguyên liệu đầu
thứ hai là 3-acetylpyridine 6 để tổng hợp enaminone 7. Tác nhân cyanamide
độc hại đã được sử dụng trong phản ứng ngưng tụ với 2-amino-4-nitrotoluene
4 cho hợp chất 3-Nitro-2-methylphenylguanidine 8. Sự tổng hợp của
enaminone 7 đã được thực hiện qua 3 bước bao gồm cả sử dụng natri
kim loại ở nhiệt độ thấp trong phản ứng ngưng tụ của 3–acetylpyridine
6, một hợp chất có nhóm methylene hoạt động, với ethylformiate. Tiếp
theo

là

phản

ứng

ngưng

tụ

đóng

vòng

của

3-nitro-2-

methylphenylguanidine 5 với pyridinenamineone 7 trong NaOH với sự hồi lưu
của isopropyl alcohol thu được hợp chất trung gian chìa khóa N-(2-methyl-5nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine 8 (gồm phần 1 và phần 2).


Hình 1.8: Phương pháp tổng hợp imatinib base của Zimmermann

Như vậy theo phương pháp này hệ vòng pyridinepyperazine được tổng
hợp trước, hợp chất nitrophenylpyrimidine 8 trung gian này được khử về
amine sử dụng xúc tác Pd/C trong THF cho aminophenylpyrimidine 9. Phản
ứng amit hóa nhóm amine tiếp theo của hợp chất 9 với 4-(4methylpiperazinomethyl)-benzoyl chloride 10 (đã bao gồm phần 3 và phần 4)
cho sản phẩm imatinib ba sơ 2 và cuối cùng là sự mesylate hóa imatinib ba sơ
với tỉ lệ mol 1/1 thu được imatinib mesylate, trong công bố này, Zimmermann
không đưa ra số liệu về hiệu suất các bước phản ứng.
Phương pháp của Loiseleur (Hình 1.9):
Ông và cộng sự đã cải tiến phương pháp không sử dụng cyanamide mà
sử dụng hệ vòng pyridinepyrimidine có sẵn và sử dụng các xúc tác đắt tiền ở
các bước tổng hợp như xúc tác Pt/C trong phản ứng amine hóa khử giữa
aldehyde 11 với methylpiperazine. Trong bước kết hợp tạo liên kết C-N trong
phản ứng Buchwald- Hartwig đã sử dụng những xúc tác đắt tiền như
Pd2(dba)3CHCl3 và tác nhân cơ phốt pho rac- BINAP như là một ligand. [17,
18]


Hình 1.9: Phương pháp tổng hợp imatinib base của Loiseleur
Với những điều kiện phản ứng như trên phương pháp của Loiseleur
không thể áp dụng triển khai với lượng cân lớn được.
Các phương pháp cải tiến:
* Năm 2006, nhóm nghiên cứu Poland [24] sau khi nêu ra các hạn chế

của các phương pháp trước, nhóm đã cải tiến phương pháp trong một số bước
phản ứng như (hình 1.10): Ở bước tổng hợp eneaminon 6 đã sử dụng
dimethylformamide dimethylacetal (thay vì phải qua 3 bước với sử dụng natri
kim loại nguy hiểm) và ở bước khử hợp chất trung gian nitro 8 về amine 9 đã
sử dụng tác nhân khử hydrazine hydrate với sự có mặt của Ni Raney, bước gắn
nhóm benzamide đã thay việc sử dụng dung môi pyridine độc hại bằng các
dung môi thông dụng ít độc hại hơn. Với việc sử dụng những tác nhân thông
dụng và quá trình xử lý sản phẩm đơn giản đạt hiệu suất toàn phần cao (đạt tới
khoảng 45% tính từ nguyên liệu đầu 3-acetylpyridine) phương pháp cải tiến này
hứa hẹn sự ứng dụng cho triển khai lượng lớn.


Hình 1.10: Phương pháp cải tiến của nhóm nghiên cứu Poland
* Ngoài ra các nghiên cứu cũng đã đi theo hướng tổng hợp hệ vòng
pyridine pyrimidine sau [17,18]. Xuất phát từ chất đầu là hợp chất gồm phần 3
và phần 4, sau phản ứng kết hợp với nhóm amine của hợp chất 3-nitro-4methyl aniline 14 nhóm nitro của sản phẩm 15 được khử về amine và nhóm
amine này kết hợp với cyanamide cho sản phẩm 17 là phân tử có nhóm
guanidine để ngưng tụ đóng vòng với pyridineamineone 7 cho sản phẩm
imatinib basơ với hệ dị vòng pyridinepyrimidine.


Hình 1.11: Phương pháp tổng hợp vòng pyrimidine sau
Năm 2006, Huang Anli và cộng sự công bố patent sử dụng urea kết hợp
với hợp chất pyridineamineone 7 để tạo vòng pyridine pyrimidine. [11]

Hình 1.12: Phương pháp của Huang Anli và cộng sự
Phương pháp của Huang Anli và cộng sự tuy không sử dụng tác
nhân cyanamide nhưng phải thêm bước và hiệu suất toàn phần thấp vì
thế cũng khó để áp dụng cho sản suất lượng lớn.

Năm 2008, Liu Xing và các cộng sự [15] công bố cải tiến bước tổng
hợp nhóm benzamide bằng phản ứng trực tiếp giữa acid với amine sử dụng
tác nhân kết hợp N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethyl-carbodiimide (EDC)
cho hiệu suất phản ứng 76% cũng đáng chú ý.

Hình 1.13: Phương pháp cải tiến bước tổng hợp nhóm benzamide của Liu
Xing và cộng sự
Phương pháp của Wang C. L. và Cộng sự: [16]
Năm 2008, Wang C. L. và cộng sự đã tổng kết lại các phương pháp
tổng hợp của Zimmermann, Loiseleur, Compella và Srakacs và đưa ra qui
trình tổng hợp imatinib không sử dụng tác nhân độc hại cyanamide trong bước
tổng hợp vòng pyrimidine. Hợp chất enaminone 7 đã được tổng hợp bằng
phản ứng trực tiếp giữa 3-acetylpyridine với tác nhân formyl hóa N,Ndimethylformamide dimethyl acetal cho hiệu suất cao 92,6% [17, 27]. Sản
phẩm enaminone 7 được ngưng tụ đóng vòng với guanidine nitrate để cung
cấp hệ vòng dị tố pyridinepyrimidine 20. Phản ứng kết hợp tiếp theo giữa
nhóm amine của pyrimidine 20 với phenylbromide tạo liên kết N-C đã được
thực hiện dưới điều kiện phản ứng Ullmann [4, 5, 9, 14, 23] sử dụng xúc tác
CuI với ligand N,N’-dimethylethylenediamine cho hợp chất trung gian N–(2methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidine-2-amine 8 với hiệu suất
82%. Trong phản ứng khử nhóm nitro, các điều kiện khử tốn kém, sử dụng H2/
Pd/C hay H2/Pt/C đã được thay bằng tác nhân khử hydrazine/FeCl3 với hiệu
suất 83,8%. Phản ứng acyl hóa nhóm amine tiếp theo cung cấp nhóm
benzamide xảy ra dễ dàng với hiệu suất 93% . Cuối cùng là phản ứng kết hợp
của alkylchloride 12 với piperazine cho hiệu suất 91,4%. Như vậy hiệu xuất


toàn phần của quy trình vào khoảng 40% tính theo 3-acetylpyridine.

Hình 1.14: Phương pháp tổng hợp imatinib của Wang và cộng sự

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
Qua phân tích các phương pháp tổng hợp imatinib mesylate trên thế
giới chúng tôi thấy: Phương pháp của Wang và cộng sự đáp ứng được các yêu
cầu môi trường và hiệu suất toàn phần của qui trình (khoảng 40% tính theo 3acetyl pyridine). Hơn nữa, các sản phẩm phụ của các bước đều có thể kiểm
soát được. Vì vậy phương pháp của Wang và cộng sự được chúng tôi sử dụng
nghiên cứu tổng hợp imatinib mesylate. Các bước tổng hợp liên quan đến các
phản ứng cộng loại lưỡng phân tử tạo vòng pyridinepyrimidine, phản ứng
Ullmann tạo liên kết C-N, phản ứng khử nhóm nitro thơm thành amine, phản
ứng acyl hóa amine và phản ứng amine hóa alkylhalide.
2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ
2.1.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp vòng dị tố pyrimidine
Con đường chung nhất và được áp dụng rộng rãi nhất để tổng hợp vòng
dị tố pyrimidine là dựa vào sự kết hợp của các tác nhân chứa khung N-C-N với
tác nhân chứa các đơn vị C-C-C. Phương pháp tổng hợp dị tố này được gọi là
2 ái nhân cộng với 2 ái electron (double nucleophile plus double electrophile),
trong đó, cả 2 nguyên tử nitơ của tác nhân N-C-N hành xử như nucleophile
còn tác nhân C-C-C hành xử như electrophile. Thông thường các tác nhân
urea, thiourea và guanidine được sử dụng như tác nhân N-C-N còn những dẫn
xuất ketone hay axit α, β-không no được sử dụng như tác nhân C-C-C ( Hình
4.4).
2.1.1.1. Phản ứng Ullmann
Phản ứng Ullmann cổ điển là phản ứng thế nucleophile vòng thơm qua
trung gian Cu, là phản ứng kết hợp arylhalide với Cu hình thành biaryl. Phản
ứng Ullmann cổ điển đã được phát triển cho việc hình thành các liên kết aryl
amine (C-N), aryl ete ( C-O), hoặc aryl thio ete C-S) được gọi là phản ứng
ngưng tụ Ullmann, phản ứng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ cao và thời gian phản
ứng kéo dài.

Phản ứng Ullmanncổ điển đã phát triển thành phản ứng “Ullmann –type” với
việc thay xúc tác Cu bằng xúc tác Pd hoặc thêm các ligand để tăng độ hòa tan của
xúc tác Cu, phản ứng xảy ra ở điều kiện êm dịu hơn và thời gian phản ứng ngắn hơn.

Phản ứng khử hợp chất nitro thơm về amine thơm
Tác nhân khử
Ar-NO2
Ar-NH2
Phản ứng acyl hóa amine thơm
ArNH2 + RCOCl

RCONHAr

Phản ứng amine hóa alkylhalide
R1CH2Cl +

R2NH

R1NR2

2.1.2.Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng, phân lập và tinh chế sản phẩm
Các phương pháp sắc ký: sắc ký là một phương pháp hoá lý dùng để tách các thành
phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau
vào 2 pha (không trộn lẫn) luôn luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: một pha tĩnh và
một pha động.
Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính:
+ Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh.
+ Cho pha động chạy qua pha tĩnh.
+ Phát hiện các chất.

Phương pháp phân tích sắc ký có thể được phân loại thành 2 loại chính, bao
gồm:
- Sắc ký lỏng: lỏng - lỏng, lỏng - rắn.


- Sắc ký khí: khí - lỏng, khí - rắn.
Phương pháp sắc ký hay được dùng phổ biến trong phân lập hợp chất
hữu cơ là sắc ký lỏng - rắn: sắc ký bản mỏng và sắc ký cột.
a. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và
xác định số lượng các chất khác nhau có trong đối tượng nghiên cứu. Dựa trên
nguyên tắc các chất khác nhau có độ phân cực khác nhau nên tách ra ở những vị
trí khác nhau. Đây là phương pháp phân tích vi lượng, hiệu quả tách cao và thời
gian thực hiện ngắn.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254,
dày 0,25mm, sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để khảo sát và
chọn ra một hệ tách tốt nhất dùng cho sắc ký cột.
Các vệt chất được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (λ = 254 nm và λ =
366 nm) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo là hơ nóng ở nhiệt độ cao.
Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho
độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn dung
môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản mỏng và có Rf càng xa
nhau càng tốt.
Bình triển khai : là bình thủy tinh có nắp đậy kín, có thể sử dụng các
loại bình triển khai có kích thước khác nhau phù hợp với kích thước bản mỏng
chạy sắc ký. Dưới đây là hình ảnh bình chạy sắc ký bản mỏng


b. Sắc ký cột
Sau khi khảo sát sắc ký bản mỏng, tiến hành sắc ký cột để tinh chế mẫu nghiên

cứu.
Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất
tuỳ theo các tính chất hóa lý của chúng. Có 3 phương pháp sắc ký cột thông
thường:
- Column Chrotomatography (CC): sắc ký cột thường.
- Flash Chrotomatography (FC): sắc ký cột nhanh.
- Medium Pressure Liquid Chrotomatography (MPLC): sắc ký lỏng trung áp.
2.1.3. Phƣơng pháp pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ
a. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)
Các nhóm chức trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở
những tần số trong các vùng từ 10000 đến 100 cm-1 (1-100µm) và biến thành
dao động của phân tử.
Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại có định lượng nhưng phổ hồng ngoại
không biểu hiện thành các đường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ
khác nhau bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi
năng lượng dao động quay.
Phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ 2 dạng năng lượng đó là năng lượng dao
động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng
tương đối của các nguyên tử, hằng số lực các dãy nối và cấu trúc hình học của
nguyên tử.
Như vậy, phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm
chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng
của các nhóm chức đó.