Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây phong quỳ sa pa anemone chapaensis gagnep , họ hoàng liên (ranunculaceae)

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................... ………….3
1.1.TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................ 3
1.1.1.Tổng quan về chi Anemone ................................................................................ 3
1.1.1.1. Thực vật học ......................................................................................... 3
1.1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 3
1.1.1.3. Tác dụng sinh học................................................................................. 6
1.1.2.Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) ............... 7
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................. 7
1.1.2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học ........................................... 8
1.1.2.3. Công dụng ............................................................................................ 8
1.2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM, GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXI HÓA…….…..8
1.2.1. Viêm .................................................................................................................. 9
1.2.1.1. Khái niệm ............................................................................................. 9
1.2.1.2. Nguyên nhân ......................................................................................... 9
1.2.2. Gốc tự do, chất chống oxi hóa ........................................................................ 10
1.2.2.1. Nguồn gốc của gốc tự do .................................................................... 10
1.2.2.2. Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa ........................................... 10
1.2.2.3. Chất chống oxi hóa............................................................................. 11
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...12
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 12
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................ 12
2.2.1. Hóa chất và dung môi ..................................................................................... 12
2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ............................................................................. 13


2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 14

2.3.1. Nghiên cứu thực vật học ................................................................................. 14
2.3.1.1. Nghiên cứu về hình thái...................................................................... 14
2.3.1.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học ........................................................... 14
2.3.2. Nghiên cứu chiết xuất và sàng lọc tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá
Phong quỳ Sa Pa........................................................................................................ 14
2.3.2.1. Chiết xuất cắn toàn phần và phân đoạn ............................................. 14
2.3.2.2. Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH (1,1- Diphenyl-2picrylhydrazyl)các phân đoạn dịch chiết .............................................................. 15
2.3.2.3. Sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase invitro các phân
đoạn dịch chiết ...................................................................................................... 16
2.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học lá Phong quỳ Sa Pa ................................. 18
2.3.3.1. Phân lập các hợp chất ........................................................................ 18
2.3.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập........................................... 19
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................................................. 19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 20
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT .......................................................... 20
3.1.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài nghiên cứu .............................. 20
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Anemone chapaensis Gagnep............................... 22
3.1.3. Đặc điểm bột của loài Anemone chapaensis Gagnep. .................................... 25
3.2. KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN
DỊCH CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA .………………………………………...28
3.2.1.Chiết xuất lá Phong quỳ Sa Pa. ........................................................................ 28
3.2.2. Kết quả sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn dịch chiết .... 31
3.2.3. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro các phân
đoạn dịch chiết .......................................................................................................... 32
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
TỪ LÁ PHONG QUỲ SA PA ................................................................................. 32
3.3.1.Định tính cắn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng. ............................................ 32
3.3.2.Phân lập một số hợp chất trong lá Phong quỳ Sa Pa........................................ 34

3.3.2.1.Phân lập .............................................................................................. 34
3.3.2.2.Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập ................................................... 37
3.3.3.Nhận dạng các chất phân lập............................................................................ 39
3.3.3.1.Hợp chất PQLE1 ................................................................................. 39
3.3.3.2. Hợp chất PQLE2 ................................................................................ 42
3.3.3.3 Hợp chất PQLE4 ................................................................................. 45
3.3.3.4. Hợp chất PQLE6 ................................................................................ 46
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 49
4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ........................................................................... 49
4.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học của loài nghiên cứu .............. 49
4.1.1. Đặc điểm vi học của loài nghiên cứu .............................................................. 51
4.2. VỀ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH
CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA ........................................................................... 51
4.2.1. Về chiết xuất ................................................................................................... 51
4.2.2. Về tác dụng dọn gốc tự do DPPH ……………………..................................52
4.2.3. Về tác dụng ức chế XO in vitro ...................................................................... 52
4.3. VỀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ................. 53
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 57
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
BuOH

n-Butanol

13

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

C-NMR

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ESI-MS

Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethyl acetat

GF254

Gypsum fluorescent 254nm

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

HSQC

Hetoronuclear Single Quantum Coherence

IC50

Half (50%) maximal Inhibitory Concentration

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectroscopy

PQL

Cắn toàn phần lá Phong quỳ

PQLB

Cắn phân đoạn n-butanol lá Phong quỳ

PQLE

Cắn phân đoạn ethyl acetat lá Phong quỳ

PQLH

Cắn phân đoạn n-hexan lá Phong quỳ

PQLW

Cắn nƣớc lá Phong quỳ

Rf

Retardation Factor

RP18

Reversed Phase 18

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

UV-VIS

Ultra Violet - Visible

UV254nm

Ultra Violet 254nm

UV365nm

Ultra Violet 365nm

XO

Xanthin oxidase


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 3.1. Khối lƣợng các cắn phân đoạn từ dịch chiết
ethanol lá Phong quỳ Sa Pa

31

2

Bảng 3.2. Khả năng dọn gốc tự do DPPH của các phân
đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa

31

3

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro
của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa

32

4

Bảng 3.4. Kết quả SKLM của 4 chất với 3 hệ dung môi

39

5

Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất
PQLE1

40

6

Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất
PQLE2

43

7

Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất
PQLE4

46

8

Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất
PQLE6

47


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1. Một số Flavonoid phân lập từ chi Anemone

5

2

Hình 1.2. Một số saponin phân lập từ rễ cây Anemone rivularis

5

3

Hình 1.3. Một số Saponin phân lập từ rễ cây Anemone tomentosa

6

4

Hình 1.4. Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep

8

5

Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn và sàng lọc tác dụng

15

6

Hình 3.1. Hình ảnh cây Phong quỳ Sa Pa

21

7

Hình 3.2. Một số bộ phận của cây Phong quỳ Sa Pa

21

8

Hình 3.3. Vi phẫu gân lá Phong quỳ Sa Pa

22

9

Hình 3.4. Vi phẫu phiến lá Phong quỳ Sa Pa

23

10

Hình 3.5. Vi phẫu cuống lá Phong quỳ Sa Pa

23

11

Hình 3.6. Vi phẫu thân cây Phong quỳ Sa Pa

24

12

Hình 3.7. Vi phẫu rễ cây Phong quỳ Sa Pa

25

13

Hình 3.8. Một số đặc điểm bột thân, lá Phong quỳ Sa Pa

26

14

Hình 3.9. Một số đặc điểm bột hoa, quả Phong quỳ Sa Pa

27

15

Hình 3.10. Một số đặc điểm bột rễ Phong quỳ Sa Pa

28

16

Hình 3.11. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá Phong quỳ Sa Pa

30

17

Hình 3.12. Sắc ký đồ cắn ethyl acetat (hệ I) ở các điều kiện quan
sát

33

18

Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl
acetat.

36

19

Hình 3.14. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6,
PQLE4 hệ I

37

20

Hình 3.15. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6,
PQLE4 hệ II

38


21

Hình 3.16. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6,
PQLE4 hệ III

38

22

Hình 3.17. Sản phẩm PQLE1 phân lập đƣợc

39

23

Hình 3.18. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE1

42

24

Hình 3.19. Sản phẩm PQLE2 phân lập đƣợc

42

25

Hình 3.20. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE2

45

26

Hình 3.21. Sản phẩm PQLE4 phân lập đƣợc

45

27

Hình 3.22. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE4

46

28

Hình 3.23. Sản phẩm PQLE6 phân lập đƣợc

47

29

Hình 3.24. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE6

48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, quanh năm nóng ẩm nên có hệ thực
vật vô cùng phong phú và đa dạng, với hàng nghìn loài cây đƣợc sử dụng làm thuốc
theo kinh nghiệm của dân gian. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung
cấp nguyên liệu cho nền y học dân gian, ngoài ra còn cung cấp thực phẩm, gia vị,

hƣơng liệu, mỹ phẩm. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
đƣợc phân lập từ cây cỏ đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng
nhƣ nông nghiệp, chúng đƣợc dùng để sản xuất thực phẩm chức năng, thuốc chữa
bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm. Vì
vậy, nguồn cây thuốc dân gian cũng nhƣ vốn sử dụng phong phú của đồng bào các
dân tộc vẫn là kho tàng quý giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu
lực trong phòng và chữa bệnh. Xu hƣớng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật làm dƣợc phẩm chữa bệnh
đang ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ƣu điểm của
chúng là sẵn có, rẻ tiền, độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể.
Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) là một loài mọc hoang ở Sa
Pa, đƣợc nhà thực vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên năm 1929 [81]. Trong dân
gian, chi Phong quỳ đƣợc ngƣời dân dùng rễ để điều trị viêm họng, viêm túi mật,
đau dạ dày, đau răng, phong thấp đau nhức. Tuy nhiên, những nghiên cứu về Phong
quỳ Sa Pa ở cả Việt Nam và thế giới còn rất ít, mới chỉ có nghiên cứu mô tả sơ lƣợc
về hình thái thực vật [78], chƣa có tài liệu nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực
vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây.
Nhằm mục đích tìm hiểu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của
cây Phong quỳ Sa Pa, một cây đặc hữu của địa phƣơng, để có thêm tri thức và nâng
cao giá trị sử dụng cây thuốc, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hƣớng tác dụng chống oxy hóa
của cây Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng liên
(Ranunculaceae)” với các mục tiêu:

1


1. Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học
của mẫu nghiên cứu.
2. Chiết xuất và sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH và ức chế xanthin

oxidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa.
3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 1-2 chất trong lá Phong quỳ Sa Pa.

2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1.1. Tổng quan về chi Anemone
1.1.1.1. Thực vật học
- Vị trí phân loại
Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên
(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
[2], [4].
- Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống nhiều năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi. Lá
mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít. Hoa đều, đơn độc hay thƣờng thành tán có
một bao chung gồm 3 lá chét. Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5-10
phiến; tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy. Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp
thành đầu [4].
- Phân bố
Chi Anemone phân bố chủ yếu ở vùng có khí hậu ôn đới, mát mẻ nhƣ miền
bắc Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Bắc Mỹ… [25], [68]. Theo
các công bố trên thế giới, hiện nay chi Anemone có khoảng 120-150 loài [5], [59],
[81], trong đó có khoảng 50 loài đƣợc tìm thấy từ Trung Quốc [68].
Ở Việt Nam, Anemone đƣợc gọi là chi Phong quỳ, mọc khá phổ biến ở vùng
núi phía Bắc nhƣ: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang và vùng núi cao miền trung [1],

[2], [4]. Theo các tài liệu thì Việt Nam có 05 loài là A. japonica, A. rivularis, A.
chapaensis, A. polilanei, A. sumatrana, trong đó có 02 loài đƣợc biết nhiều là A.
japonica và A. rivularis [1], [2], [4], [8].
1.1.1.2. Thành phần hóa học
Một số nghiên cứu đã cho biết thành phần hóa học chính trong các loài thuộc
chi Anemone là saponin và flavonoid, trong rễ và lá của các loài nhƣ A. tomentosa,
A. taipaiensis, A. rivullaris, A. anhuiensis, A. flaccida, A. raddeana, A. hupehensis,
A. coronaria… [15], [19], [21], [27], [28], [45], [67], [72], [74], [75], [77]. Ngoài ra
trong các loài Anemone còn chứa diterpenoid glycosid, coumarin, một số acid béo
3


đƣợc tìm thấy trong hạt [9] và acid béo, acid béo đã khử

5 trong mô lá của

Anemone leveillei L. [51].
a. Các flavonoid

quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside

quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside

Astragalin

quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside

4

quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside

Hình 1.1. Một số Flavonoid phân lập từ chi Anemone
b. Các saponin
Cho đến nay, đã có khoảng 60 saponin trong chi Anemone đƣợc nhận biết và
xác định cấu trúc thuộc saponin triterpenoid, trong đó chủ yếu là dẫn xuất của 2
aglycone oleane và hederagenin. Các saponin này đƣợc phân lập từ bộ phận thân rễ
của các loài trong chi Anemone.

1

2

3

45

5

6

7

8

9

10

R1

S1

S1

S1

Rha I

Rha I

S1

Rha I

S1

S1

H

R2

Glc I

Glc I

S2

Glc I

S2

H

Glc I

Glc I

H

H

R3

CHO

CHO

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CHO

R4

H

H

H

OH

OH

H

H

H

H

H

R5

Glc II

S3

Glc II

S3

S3

H

H

H

S3

S3

CH2OH CH2OH

Hình 1.2. Một số saponin phân lập từ rễ cây Anemone rivularis

5


R1

R2

R3

R1

R2

R3

1

Glc

Rib

OH

2

Glc

Rib

OH

4

H

Rib

OH

3

H

Gal

H

6

H

Rib

H

5

N

Rib

OH

7

H

H

H

Hình 1.3. Một số Saponin phân lập từ rễ cây Anemone tomentosa
(1) Tomentoside A

(2) Tomentoside B

(3) Tomentoside C

(4) Huzhangoside D

(5) Clematiganoside A

(6) Huzhangoside B

(7) Bederasaponin B
1.1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng
Các nghiên cứu về dƣợc lý học đã chứng minh các saponin nhóm triterpenoid,
thành phần chính trong rễ của chi này có hoạt tính sinh học tiềm năng, bao gồm
kháng u, kháng khuẩn, chống oxi hóa, ngăn chặn côn trùng… [15], [66], [77], trong
đó tác dụng gây độc tế bào của A. taipaiensis và A. rivullaris đã đƣợc báo cáo [69],
[72].

6


Hơn 10 loài trong chi này đã đƣợc ngƣời dân Trung Quốc sử dụng nhƣ thuốc
dân gian. Ví dụ: thân rễ của A. raddeana đƣợc ghi trong dƣợc điển Trung Quốc để
điều trị bệnh thấp khớp và đau thần kinh [48]; A. rivularis đƣợc sử dụng nhƣ một
loại thuốc dân gian để điều trị bệnh viêm gan, viêm cơ, đau khớp, phù nề… [68]; rễ
của A. tomentosa đƣợc ngƣời dân Trung Quốc sử dụng nhƣ thuốc y học cổ truyền
để điều trị bệnh lỵ, sốt rét, suy dinh dƣỡng trẻ con. Trong dân gian, theo kinh

nghiệm sử dụng thuốc y học cổ truyền của một số nƣớc Châu Á thì A. japonica
dùng chữa bệnh về tim (phối hợp với thuốc khác), A. rivullaris để điều trị viêm
họng, sƣng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế
kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu
[4].
1.1.2. Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.)
Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Phong quỳ Sa
Pa A. chapaensis Gagnep., chƣa có tài liệu nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực
vật (vi phẫu, soi bột), thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây.
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
a) Đặc điểm thực vật
Phong quỳ Sa Pa A. chapaensis Gagnep. đƣợc nhà thực vật Pháp mô tả lần đầu
tiên vào năm 1929 [81]. Theo các tài liệu trƣớc đây mô tả cây Phong quỳ Sa Pa là
cây thảo, thân 2-4cm mang lá chụm ở đất. Lá có cuống dài 10-15cm, mềm, có lông
rải rác; phiến hình tim có 3 thùy, không lông, bìa có răng tròn. Trục mang hoa cao
hơn 20cm; lá hoa 6-7, dài 2-3,5cm; lá đài 5, đầu tà hay lõm, cao 2-4cm; tiểu nhụy
nhiều; tâm bì không lông, không vòi nhụy. Quả bế không cọng, không lông, dẹp
dẹp, dài 4-5mm [4], [78], [81].

7


Hình 1.4. Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep.
(Hình ảnh từ internet: />b) Phân bố
Mới ghi nhận thấy loài Anemone chapaensis có gặp ở Sa Pa, thƣờng mọc ở
sƣờn dốc với độ cao từ 1500m trở lên [4], [8], [81].
1.1.2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học
Cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào của Việt Nam và trên thế giới công bố
về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Phong quỳ Sa Pa (Anemone
chapaensis).

1.1.2.3. Công dụng
Thân rễ và rễ Phong quỳ Sa Pa đƣợc ngƣời dân địa phƣơng sử dụng để điều
trị viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, đau răng, phong thấp đau nhức. Tuy nhiên
cho đến nay chƣa tìm thấy nghiên cứu nào ở cả Việt Nam và thế giới công bố về tác
dụng sinh học của Phong quỳ Sa Pa chứng minh cho các công dụng này.
1.2.

Tổng quan về viêm, gốc tự do và chất chống oxi hóa
Các gốc tự do đã đƣợc chứng minh là có liên quan đến hiện tƣợng viêm

(viêm khớp, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ, hội chứng hô hấp ở ngƣời
lớn), nhiều bệnh lý liên quan đến viêm mạn tính nhƣ: ung thƣ, rối loạn thần kinh
(bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, bệnh teo cơ), nghiện rƣợu, các bệnh liên quan
đến hút thuốc và nhiều bệnh khác [38], [62]. Các gốc tự do có thể cho một electron
hoặc nhận một electron từ phân tử khác, do đó nó có thể xem nhƣ một chất oxi hóa

8


hoặc một chất khử [14]. Hai nhóm chất oxi hóa sinh học chính là nhóm oxi hoạt
động (ROS) và nhóm nitơ hoạt động (RNS).
Xanthine dehydrogenase (XDH) hay xanthine oxidase (XO) là một phức hợp
metallo-flavoprotein tạo ra các gốc tự do. Enzyme XO xúc tác quá trình oxi hoá
hypoxanthine thành xanthine và oxi hoá xanthine thành acid uric. Các hợp chất
phenol, đặc biệt là flavonoid có hoạt tính ức chế mạnh đối với enzyme XO và tiềm
năng chống oxy hóa cao. Trong nhóm flavonoid đáng chú ý là các hợp chất flavonol
glycosid và cụ thể hơn là kaempferol và quercetin glycosid [16]. Sự ức chế hoạt
động enzyme XO đƣợc xem nhƣ là một cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất
polyphenol. Nhiều nghiên cứu về enzyme XO chứng minh rằng, hoạt động của
enzyme XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do [17], [63]. Nên việc bổ

sung các chất ức chế enzyme XO vừa có tác dụng ức chế sự tạo thành acid uric
ngăn ngừa bệnh gout, cũng vừa có tác dụng ngăn chặn lại stress oxy hóa là nguyên
nhân gây viêm trong cơ thể.
1.2.1. Viêm
1.2.1.1. Khái niệm
Viêm là hiện tƣợng sƣng, nóng, đỏ, đau của đã đƣợc đề cập tới trong y học
cổ đại và những khái niệm ban đầu về viêm cũng đƣợc hình thành từ rất sớm song
lại rất khác nhau. Viêm là phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, là
một quá trình bệnh lý phức tạp bao gồm nhiều hiện tƣợng: tổn thƣơng tổ chức, rối
loạn chuyển hóa, rối loạn tuần hoàn, bạch cầu đến ổ viêm và thực bào, tế bào tăng
sinh [3].
1.2.1.2. Nguyên nhân [3]
Nguyên nhân bên ngoài: Nguyên nhân bên ngoài thƣờng gặp nhất và phức tạp nhất
bao gồm:
- Vi sinh vật: vi khuẩn và các độc tố của chúng, virus, ký sinh trùng và côn trùng.
Đây là nguyên nhân gây viêm thƣờng gặp nhất.
- Tác nhân cơ học: chấn thƣơng.
- Vật lý: nhiệt độ (nóng, lạnh), điện, bức xạ ion hóa.
- Hóa học: các acid, các kiềm, các muối kim loại nặng.
9


Nguyên nhân bên trong
- Hoại tử tổ chức: tắc mạch, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dƣỡng.
- Lắng đọng các phức hợp miễn dịch (có hoạt hóa bổ thể) (phức hợp kháng nguyênkháng thể).
1.2.2. Gốc tự do, chất chống oxi hóa
1.2.2.1. Nguồn gốc của gốc tự do
Gốc tự do có thể đƣợc định nghĩa là bất kỳ tiểu phân hóa học nào có khả
năng tồn tại độc lập có chứa một electron chƣa ghép cặp trong obitan nguyên tử.
Electron độc thân này quy định đặc tính chung của gốc tự do. Gốc tự do không ổn

định và có khả năng phản ứng cao.
Một số nguồn ngoại sinh gốc tự do là: khói thuốc lá, ô nhiễm môi trƣờng, sự
bức xạ, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, dung môi công nghiệp, ozon. Một số nguồn
nội sinh của gốc tự do là: hoạt động của ti thể, hoạt động xanthin oxidase, hoạt động
của peroxisom, quá trình viêm, quá trình thực bào, con đƣờng arachidonat, tập thể
dục quá sức, thiếu máu cục bộ, chấn thƣơng tái tƣới máu [13].
1.2.2.2. Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa
Stress oxi hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng nghiêm
trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxi hóa bảo vệ trong cơ thể, có thể
gây hại trên một phạm vi rộng cho các loại phân tử bao gồm cả lipid, protein và
acid nucleic. Stress oxi hóa ngắn hạn có thể xảy ra trong các mô bị thƣơng do chấn
thƣơng, nhiễm trùng, tổn thƣơng do nhiệt, nhiễm độc tố và tập thể dục quá mức.
Những mô bị thƣơng này tăng sản xuất các enzym sinh gốc (ví dụ: xanthin oxidase,
lipoxygenase, cyclooxygenase) làm kích hoạt các đại thực bào, giải phóng ion sắt,
ion đồng hoặc làm gián đoạn chuỗi vận chuyển điện tử của phản ứng phosphoryl
hóa và làm sản xuất dƣ thừa ROS. Việc khởi phát và tiến triển của bệnh ung thƣ,
cũng nhƣ các tác dụng phụ của xạ trị và hóa trị cũng có liên quan đến sự mất cân
bằng giữa ROS và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa. ROS cũng có liên quan trong sự
cảm ứng và các biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng, bệnh về mắt ở ngƣời già, và
các bệnh thoái hóa thần kinh nhƣ bệnh Parkinson [53].

10


Ảnh hƣởng của stress oxi hóa đã đƣợc công nhận trong nhiều tiến trình bệnh
lý bao gồm cả xơ vữa động mạch, tình trạng viêm, ung thƣ và quá trình lão hóa.
Việc sản xuất quá mức và không kiểm soát của ROS (kết quả của stress oxi hóa),
đặc biệt ROS có nguồn gốc ti thể kích thích trực tiếp lên điều chỉnh của các cytokin
viêm liên quan với các tình trạng bệnh lý khác nhau trong các bệnh liên quan đến
viêm ở ngƣời [38]. Viêm xảy ra nhƣ là kết quả của stress oxy hóa. Đáp ứng với tình

trạng giải phóng quá nhiều gốc tự do (thƣờng có nguồn gốc từ ti thể) sẽ dẫn đến một
loạt của các bệnh lý của viêm, khởi động một chu trình đáp ứng tế bào phức tạp bắt
đầu và kích hoạt một vài phân tử tín hiệu. Một trong những phân tử trung gian
truyền tín hiệu quan trọng là yếu tố sao chép nhân (NF-κB), yếu tố này điều chỉnh
quá trình sản xuất các chất trung gian gây viêm hạ nguồn nhƣ: NO synthase cảm
ứng (iNOS), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và
cyclooxygenase-2 (COX-2). NF-κB đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm
và chết tế bào, miễn dịch và đáp ứng stress cũng nhƣ điều hòa biểu hiện của các gen
khác nhau [52]. Sản sinh ROS quá mức có khả năng oxi hóa gây thay đổi và tổn
thƣơng các phân tử sinh học nhƣ: lipid, carbohydrat, protein và ADN thông qua các
cơ chế khác nhau, kết quả là có thể làm mất chức năng của các phân tử sinh học này
vĩnh viễn.
1.2.2.3. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là một phân tử ổn định có khả năng cho hoặc nhận của
gốc tự do một electron để trung hòa gốc tự do này, do đó làm giảm khả năng gây
nguy hại của nó. Những chất chống oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy
tế bào chủ yếu là thông qua khả năng dọn gốc tự do của chúng. Những chất chống
oxy hóa trọng lƣợng phân tử thấp có thể tƣơng tác một cách an toàn với các gốc tự
do và chấm dứt chuỗi phản ứng trƣớc khi các phân tử quan trọng bị phá hủy [24].

11


CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thực vật đƣợc tiến hành trên toàn cây Phong quỳ Sa Pa khi cây
có đủ hoa, quả đƣợc thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến
1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và mẫu

tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào
Cai đƣợc lƣu giữ tại phòng Bách thảo thực vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn,
Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc liệu đƣợc lƣu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn,
Viện Dƣợc liệu.
Nghiên cứu chiết xuất, sàng lọc tác dụng sinh học của các phân đoạn dịch
chiết và phân lập một số hợp chất đƣợc tiến hành với bộ phận trên mặt đất (trong
luận văn gọi tắt là lá ví phần lớn phần trên mặt đất là lá và cuống lá) của cây Phong
quỳ Sa Pa đƣợc thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m),
thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất và dung môi
-

Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: ethanol 96%, n-hexan, ethyl
acetat, n-butanol, nƣớc cất.

-

Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột.

-

Các chất tẩy – nhuộm tiêu bản: Nƣớc Javen, Cloral hydrat, đỏ son phèn,
xanh methylen…

-

Acid acetic, HCl (Merk).

-

DPPH, Allopurinol, xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 13 mg
protein/ml), xanthin ≥ 99% (Sigma Aldrich).

-

Na2HPO4, KH2PO4, HCl, NaOH, dimethyl sulfoxid (Merck).

-

Quercetin ≥ 98%, dạng rắn, tiêu chuẩn HPLC (Sigma Aldrich).

12


-

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV.

2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ
-

Bản mỏng silica gel F254 và RP-18 F254S tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck).

-

Bột silica gel pha thƣờng cỡ hạt 40-200 µm, pha đảo RP-18 cỡ hạt 30-50 µm
(Merck).

-

Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A.

-

Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shellab, đèn tử ngoại.

-

Kính hiển vi quang học; hệ thống cắt tiêu bản và vi phẫu thực vật

-

Hệ thống chiết hồi lƣu dung tích bình cầu 10 lít, máy cất quay.

-

Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đƣờng kính từ 1-10cm, dài từ 30-100
cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR,
pipet chính xác…

-

Máy đo phổ khối lƣợng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap.

-

Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer.

-

Máy đo phổ cộng hƣởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR
Spectrometer.

-

Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade.

-

Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU), Máy đo pH (EUTECH).

-

Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy ủ
lắc khay (Awareness, Hoa Kì).

-

Đĩa UV 96 giếng đáy ph ng Costar 3635 (Corning).

-

Micropipet đơn kênh và đa kênh các loại.

-

Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dƣợc liệu, Bộ môn Dƣợc học cổ

truyền và Bộ môn Dƣợc lực - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.

13


2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu thực vật học
2.3.1.1. Nghiên cứu về hình thái
- Quan sát tại thực địa và trong phòng thí nghiệm, mô tả đặc điểm hình thái
thực vật về: dạng sống; thân; lá (hình dạng phiến, chóp, gân, gốc, cuống, kích
thƣớc…); hoa (dạng cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thƣớc, lá bắc, bộ nhị, bộ
nhụy…); quả và hạt (hình dạng, màu sắc, kích thƣớc…). Dụng cụ sử dụng gồm:
kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số, thƣớc kẻ.
- Giám định tên khoa học bằng phƣơng pháp so sánh đặc điểm hình thái, đối
chiếu với các khóa phân loại thực vật, các bộ thực vật chí [4], [59], đồng thời so
sánh với tiêu bản mẫu với sự giúp đỡ của chuyên gia phân loại thực vật của Việt
Nam.
2.3.1.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học
- Vi phẫu: tiêu bản vi phẫu thân đƣợc cắt ngang ở đoạn thân thứ 3 tính từ đầu
cành. Tiêu bản vi phẫu lá đƣợc cắt ngang ở vị trí khoảng 1/2-1/3 dƣới gần gốc của
lá trƣởng thành. Sau đó, các mảnh cắt đƣợc nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu. Quan
sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi [6], [54].
- Soi bột: Bộ phận dùng đƣợc phơi khô, nghiền thành bột, lên tiêu bản, quan
sát dƣới kính hiển vi xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột qua kính [6].
2.3.2. Chiết xuất và sàng lọc tác dụng của các phân đoạn dịch chiết
2.3.2.1. Chiết xuất cắn toàn phần và phân đoạn
Theo phƣơng pháp chiết các chất với các dung môi có độ phân cực tăng dần:
dƣợc liệu đã xay thô đƣợc chiết bằng phƣơng pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung
môi EtOH 96%; cất thu hồi dung môi đƣợc cắn toàn phần EtOH, hòa cắn vào nƣớc,
lần lƣợt chiết phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan; ethyl

acetat; n-buthanol). Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu đƣợc cắn n-hexan (cắn
Hx); cắn ethyl acetat (cắn EtOAc); cắn n-buthanol (cắn BuOH); cắn nƣớc (cắn
H2O). Sàng lọc sơ bộ tác dụng sinh học của các cắn EtOH, Hx, EtOAc, BuOH
(Hình 2.1) để lựa chọn ra phân đoạn có tác dụng tốt và tiến hành phân lập các hợp
chất.
14


Dƣợc liệu
chiết với EtOH 96%

Dịch chiết EtOH
thu hồi dung môi

Cắn toàn phần EtOH
(sàng lọc tác dụng)
hòa thành nhũ dịch trong H2O
chiết phân đoạn với Hx

thu hồi dung môi

Phân đoạn H2O

Phân đoạn Hx
(sàng lọc tác dụng)

Chiết phân đoạn với EtOAc

thu hồi dung môi

Phân đoạn H2O

Phân đoạn EtOAc
(sàng lọc tác dụng)

Chiết phân đoạn với BuOH
thu hồi dung môi

Phân đoạn BuOH
(sàng lọc tác dụng)

Phân đoạn sau
chiếu

Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn và sàng lọc tác dụng
2.3.2.2. Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH (1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl) của
các phân đoạn dịch chiết
Nguyên tắc:
DPPH (1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có
màu tím, bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng chống oxy
hóa sẽ trung hòa gốc DPPH, cho sản phẩm khử 1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazin có
màu vàng. Làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản
ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ màu tím sang vàng nhạt [43].
Chuẩn bị mẫu thử:

15


Cắn toàn phần và các phân đoạn dịch chiết dƣợc liệu đƣợc hòa tan trong
dung môi dimethyl sulfoxid (DMSO) để đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml.

Dung dịch gốc pha trong DMSO sau đó đƣợc pha loãng bằng methanol để thu đƣợc
các dung dịch thử có nồng trong khoảng 3-300 µg/ml.
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc tiến hành trên đĩa
96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm có các giếng
chứng và các giếng thử. Lần lƣợt thêm vào các giếng chứng/thử 20 µl DMSO/dung
dịch thử và 180 µl dung dịch DPPH (100µM trong methanol). Sau khi lắc đều, đĩa
đƣợc giữ trong bóng tối 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng
517 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek, Mĩ). Song song với mỗi mẫu chứng
và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử đƣợc tiến hành trong cùng
điều kiện nhƣng thay dung dịch DPPH bằng dung dịch methanol.
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ
quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:

Trong đó ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng; ∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử
Xác định nồng độ có tác dụng dọn 50% gốc tự do DPPH của mẫu thử dựa
trên tỷ lệ phần trăm dọn gốc tự do tại các nồng độ khác nhau (5-6 nồng độ/mẫu), sử
dụng phƣơng pháp hồi quy phi tuyến với mô hình Sigmoidal dose response trên
phần mềm Graphpad Prism 5.
2.3.2.3. Thử tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase invitro của các phân đoạn
dịch chiết
Nguyên tắc: Xanthin oxidase (XO) xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin thành acid
uric:

XO
Xanthin + O2 + H2O

acid uric+ H2O2

Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của mẫu thử trên đĩa

UV 96 giếng Costar 3635 theo quy trình đƣợc mô tả bởi Nguyễn Thị Thanh Mai và
cộng sự, với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm [49].

16


Chuẩn bị Mẫu thử
Mẫu thử đƣợc hòa tan trong DMSO để đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 10000
µg/ml. Từ dung dịch này, pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (70mM, pH 7,5)
để thu đƣợc các dung dịch thử có nồng độ thay đổi từ 3-300 µg/ml.
Tiến hành thí nghiệm
Trên mỗi đĩa UV 96 giếng Costar 3635 gồm có: giếng chứng, giếng đối
chiếu (allopurinol) và các giếng thử. Trong các giếng chứng/đối chiếu/thử đƣợc cho
tƣơng ứng gồm: 50µl dung dịch đệm/dung dịch allopurinol/dung dịch thử, 35µl
dung dịch đệm phosphat 70mM, pH= 7,5, 30µl dung dịch enzym (0,01U/ml trong
dung dịch đệm phoshat 70mM, pH=7,5) đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi sử dụng. Sau
khi ủ ở 25oC trong 15 phút, thêm 60µl xanthin 150µM, tiếp tục ủ ở 25oC trong 30
phút. Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 25µl HCl 1N, đo mật độ quang (OD) ở
bƣớc sóng 290nm. Song song với mỗi mẫu chứng, mẫu đối chiếu, mẫu thử có một
mẫu trắng của chứng, mẫu trắng của đối chiếu, mẫu trắng của thử đƣợc tiến hành
tƣơng tự nhƣng thay đổi trình tự cho enzym vào giếng (enzym đƣợc cho vào sau
HCl 1N). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ.
Đánh giá kết quả: Tỷ lệ phần trăn ức chế (I) của mẫu thử tại một nồng độ nhất định
đƣợc tính theo công thức sau:

(Trong đó: ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng; ∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử)
Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của mẫu thử và
chất đối chiếu dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau (5-6 nồng
độ/mẫu), sử dụng phƣơng pháp hồi quy phi tuyến với mô hình Sigmoidal dose
response trên phần mềm Graphpad Prism 5.

2.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.3.3.1. Phân lập các hợp chất
Sau khi tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học của các phân đoạn dịch chiết
trong dung môi có độ phân cực khác nhau chiết xuất từ mẫu nghiên cứu, lựa chọn
phân đoạn có hoạt tính tốt cho quá trình phân lập hợp chất tiếp theo. Quá trình

17


nghiên cứu phân lập hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột
với các chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, pha đảo. Sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng để
theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết của các chất
phân lập.
Đặc điểm chính của những phƣơng pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu [7]:


Sắc ký cột:

+ Cột thủy tinh: đƣờng kính thay đổi từ 1-10cm, chiều dài thay đổi từ 30-100
cm.
+ Pha tĩnh: thƣờng dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm (dùng cho
cột to đƣờng kính khoảng 10 cm) hoặc 40-63 μm (dùng cho cột có đƣờng kính 5 cm
trở xuống); silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm.
+ Phƣơng pháp nạp cột và đƣa mẫu lên cột:
Hạt silica gel đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp nạp cột ƣớt sử dụng hỗn
hợp dung môi chính là pha động để rửa giải. Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào
bản mỏng sắc ký. Mẫu phân lập đƣợc đƣa lên cột bằng cách đƣa th ng dung dịch
hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica gel, nghiền
mịn rồi đƣa lên cột.
+ Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng

ống thủy tinh. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích
sắc ký lớp mỏng.


Sắc ký lớp mỏng (TLC):

+ Bản mỏng: sắc ký TLC đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thuận
DC-Alufolien 60 GF254 và pha đảo RP-18 (Merck).
+ Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ đƣợc quan sát dƣới ánh sáng đèn tử ngoại ở
hai bƣớc sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng đƣợc phun dung dịch acid sulfuric
10% sau đó sấy nóng bản mỏng ở 1100C trong khoảng 5 - 10 phút.
2.3.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
- Các chất phân lập đƣợc ở dạng tinh khiết (đã đƣợc kiểm tra độ tinh khiết
bằng SKLM) đƣợc xác định căn cứ vào tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng
chảy) và các dữ liệu phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ
18