Nghiên cứu thành phần, hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng một số loài thân mềm biển việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG
CÁC LỚP CHẤT LIPID TRONG LIPID
TỒNG MỘT SÓ LOÀI THÂN MỀM
BIỂN VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên n g àn h : H óa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
THS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG LY

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu thành phàn, hàm lượng các lớp chất
lipid trong lipid tổng một số loài thân mềm biển Việt Nam” được thực hiện tại
phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Họp chất thiên nhiên - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Em xin chân thành cảm ơn GS. TS. Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo
Viện Hóa học các Họp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị
của viện để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Đặng Thị Phương Ly, cùng
các anh (chị) phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Họp chất thiên

nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại đây.
Em xin cảm ơn các thầy, cô ừong Khoa Hóa học - Trường ĐHSP Hà
Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo em ừong suốt 4 năm học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung


MUC
LUC
•
•
MỞ Đ Ầ U ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................3
1.1. Sơ bộ về Thân mềm ...............................................................................3
1.2. Phân loại động vật Thân mềm ...............................................................6
1.2.1. Phân ngành Song kinh (Amphineura) ............................................ 6
1.2.2. Phân ngành vỏ liền (Conchífera) .................................................... 7
1.3. Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học động vật
thân mềm....................................................................................................... 8
1.4. Lipid, các lớp chất lipid ..........................................................................9
1.5. Phương pháp xác định hàm lượng các lớp chất lipid sử dụng phần
mềm xử lí hình ảnh SORBFIL..................................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú Ư ............ 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 16

2.2. Dụng cụ, hóa chất ................................................................................. 18
2.2.1. Dụng c ụ ........................................................................................... 18
2.2.2. Hóa c h ấ t.......................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp chiết lipid tổ n g ..........................................................18
2.3.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất
ừong lipid tổ n g .......................................................................................... 19
2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết lipid
tô n g ............................................................................................................ 20
a. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.........................................................20

b. Đánh giá hoạt tính kháng v s v kiểm đ ịn h .......................................... 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LU Ậ N ..................................................21


3.1. Hàm lượng lipid tổ n g ............................................................................21
3.2. Phân tích thành phàn và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng ..... 24
3.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết lipid tổng 16 mẫu thân
mềm nghiên c ứ u ...........................................................................................30
KẾT LUẬN.................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 33
PHỤ LỤC....................................................................................................... 35


DANH MUC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.Các lớp chất lipid trong sinh vật biển............................................. 12
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và hình ảnh thân mềm nghiên cứu................. 16
Bảng 3.1. Hàm lượng lipid tổng của 16 mẫu thân mềm................................ 21
Bảng 3.2. Thành phần và hàm hượng các lớp chất lipid trong lipid tổng

mẫu thân mềm nghiên cứu...............................................................26
Bảng 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào của mẫu dịch chiết các loài thân m ềm ... 30
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của mẫu dịch chiết các
loài thân mềm..................................................................................31
Biểu đồ 3.1. Hàm lượng lipid tổng trong mẫu thân mềm nghiên cứu........... 23
Biểu đồ 3.2. Hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng.................................... 27


DANH MUC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức cơ thể của các nhóm Thân mềm (Theo Storer).......... 3
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo vạt áo và vỏ ngoài của Thân mềm (theo Dogel)........ 4
Hình 1.3. Một số kiểu lưỡi bào (radula) của Chân bụng (Theo Hickman)...... 6
Hình 1.4. Cấu tạo phân tử lipid.......................................................................10
Hình 1.5. Cấu tạo lipid ừên cơ sở glyxerol......................................................11
Hình 1.6. Cấu tạo lipid ừên cơ sở sphingozin..................................................11
Hình 3.1. Sắc ký lớp mỏng lipid tổng các mẫu thân mềm nghiên cứu.......... 25
Hình 3.2. Tính toán hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng bằng phần
mềm Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, Russia.......... 26


DANH MUC CHỮ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TĂT

DIỄN GIẢI

TLC

Thin- layer chromatography

PL

Phospholipid

ST

Sterol

FFA

Free Fatty Acid

TG

Triacylglycerol

MADG

Monoalkyldiacylglycerol

HC

Hydrocarbon

WE

Wax Ester

Hep

Hepatocellular carcinoma

LU

Lung cancer

VSVKĐ

Vi sinh vật kiểm định

ATCC

American Type Culture Collection

EPA

Axit eicosapentaenoic

DHA

Axit docosahexaenoic

TB

Te bào


MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm bên bờ Biển Đông, có đường bờ biển dài trên 3.260km
(không kể bờ các đảo) và vùng đặc quyền kinh tế rộng khoảng 1 triệu km2.

Biển Việt Nam có trên 3.000 hòn đảo, phân bố tập trung ở ven bờ Tây Bắc
Vịnh Bắc Bộ (Quảng Ninh - Hải Phòng). Một số đảo ven bờ miền Trung và
Tây Nam bộ và hai quàn đảo ngoài khoi là quần đảo Hoàng Sa thuộc thành
phố Đà Nằng và quần đảo Trường Sa thuộc tỉnh Khánh Hòa. Bên cạnh đó, địa
hình nước ta phức tạp chạy dọc ven biển và 112 cửa sông chính đổ trực tiếp ra
biển điều này đã tạo nhiều đầm, phá, cửa sông, vũng vịnh, các ao đầm thuộc
vùng triều. Đây là tiềm năng rất lớn cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản ở
vùng ven biển Việt Nam nói chung và động vật thân mềm biển nói riêng.
Theo Jorgen Hyllenberg (2003), trong hệ sinh thái biển có khoảng 2200 loài
động vật thân mềm thuộc 700 giống của 200 họ [1]. Trong đó, hiện nay ở
nước ta có khoảng hơn 25 loài khác nhau có thể đưa vào nuôi trồng ở các
vùng ven biển. Hàng năm, sản lượng nuôi trồng và đánh bắt loài này lên đến
hàng chục nghìn tấn và đã đóng góp một phần ngân sách không nhỏ cho
ngành thủy sản nói riêng và nền kinh tế quốc gia nói chung. Vì vậy việc nuôi
trồng và phát triển loài động vật nhuyễn thể rất được quan tâm và đầu tư theo
quy hoạch của bộ Thủy sản [2].
Ngành thân mềm không những giữ vai trò quan trọng trong các hệ sinh
thái mà còn có giá trị kỉnh tế, y học, dược học.... Trên 80 loài có giá trị kinh
tế cao, chủ yếu tập chung ở họ Sò (Arcidae), Ngao (Vereridae), Phi
(Psammobiidae), Bào ngư (Halitidae), Hàu (Ostreidae), Vẹm, Tu hài..., đây
cũng là những đối tượng được nuôi trồng rộng rãi phục vụ nhu cầu trong nước
và xuất khẩu [ 1].
Thành phần hóa học của thân mềm có chứa nhiều họp chất có hoạt tính

1


sinh học cao, trong đó lipid là một thành phàn quan trọng. Việc nghiên cứu
thành phần hóa học của thân mềm sẽ tạo điều kiện cho việc định hướng khai
thác và sử dụng các nguồn hoạt chất sinh học, ứng dụng vào các sản phẩm

phục vụ đời sống và phát triển kinh tế biển.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi chọn đề tài khóa luận tốt
nghiệp là: “Nghiên cứu thành phần, hàm lượng các lớp chất lipid trong lỉpỉd
tổng một sổ loài thân mềm biển Việt Nam

Các kết quả thu được đóng góp

cho bộ cơ sở dữ liệu về lipid các mẫu sinh vật biển Việt Nam và là cơ sở cho
những nghiên cứu chuyên sâu hơn về hóa học lipid của loài sinh vật này
Mục tiêu của đề tài:
- Thu nhận lipid tổng, xác định hàm lượng lipid tổng;
- Xác định thành phần và hàm lượng các lóp chất lipid ừong lipid tổng
trong 16 mẫu thân mềm.
- Thử hoạt tính sinh học: hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi
sinh vật kiểm định dịch chiết lipid tổng 16 mẫu thân mềm.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Sơ bộ về Thân mềm
Ngành động vật Thân mềm (Mollusca) hay còn gọi là nhuyễn thể hay
thân nhuyễn bao gồm nhiều loài khác nhau, có thể có vỏ đá vôi che chở, chi
xệp sau ngành Chân khớp về số lượng các giống, loài và cá thể [3]. Động vật
thuộc ngành này thích nghỉ với những môi trường sống khác nhau cả nước
mặn, nước ngọt và ừên cạn. Động vật Thân mềm có những nét đặc trưng
riêng về cấu trúc cơ thể. Đó là sự phân hoá của biểu bì ở phần thân để hình
thành vạt áo bao phủ thân, tiếp đó hỉnh thành xoang áo chứa cơ quan áo đảm
nhận một số chức phận quan trọng. Lớp áo có thể tiết ra vỏ canxi hay gai phủ

trên bề mặt cơ thể. Hình thành cơ quan lưỡi gai (lưỡi bào) đặc trưng để nạo và
cuốn thức ăn. cấu trúc cơ thể được chia thảnh 3 phần là đầu, thân và chân,
mức độ phát triển của các phần tuỳ thuộc vào từng nhóm khác nhau. Hầu hết
cơ thể động vật Thân mềm có đối xứng 2 bên, riêng nhóm Chân bụng (ốc) có
hiện tượng mất đối xứng [4].

Hình 1.1. Sơ đồ tỗ chức cơ thể của các nhổm Thân mềm (Theo storer)
Từ ừái sang phải: lớp v ỏ một tấm (Mônplacophora); Song kinh
(Amphineura); Chân thùy (Scaphopoda); Chân rìu (Pelecypoda); Chân bụng
(Gastropoda) và Chân đầu (Cephalopoda). ANTERIOR: Phần trước cơ thể;
POSTERIOR: Phần sau cơ thể; M: Miệng; A: Hậu môn

3


Cơ thể động vật Thân mềm thường được chia thành 3 phần là phần đàu,
phần thân và phần chân. Lớp biểu bì của phần thân hình thành nên áo (hay
được gọi là vạt áo). Từ ngoài vào ữong, áo gồm có 3 lớp rõ ràng là biểu bì
ngoài, lớp mô liên kết và trong cùng là lớp biểu bì trong. Biểu bì của áo (lớp
tế bào ngoài) hình thành nên vỏ bọc cơ thể với độ dày và cấu trúc khác nhau.
Ngoài cùng của vỏ là lớp sừng (conchyolin = periostracum) mỏng, tiếp đến là
lóp caxin gồm các tỉnh thể hình lăng trụ khá dày, trong cùng là lóp xà cừ
mỏng hơn. Khoảng trống giữa vạt áo và nội quan được gọi là xoang áo, trong
đó thường có cơ quan hô hấp, cơ quan cảm giác, lỗ sinh dục, bài tiết, hậu
môn... (hình 1.2). Các cơ quan này được gọi chung là phức họp cơ quan áo
của động vật thân mềm.

1
2 'ĩ Vỏ

LVai á

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo vạt áo và vỏ ngoài của Thân mềm (theo Dogel)[4]
1. Lóp sừng (conchyolin); 2. Lớp lăng trụ canxỉ; 3. Lcrp xà cừ; 4. Biểu bì
ngoài của áo; 5. Lớp mô liên kết; 6. Biểu bì trong
Các kiểu vận động khác nhau của động vật Thân mềm biến đổi theo mức
độ phát triển của phần chân. Nhìn chung mức độ phát triển và vị trí tương đối
của các phần cơ thể có biến đổi ở mỗi lớp khác nhau. Mặc dù cơ thể không
phân đốt nhưng vẫn biểu hiện về sự sắp xếp phân đốt của các cơ quan. Ví dụ
như ở Song kinh có vỏ và vỏ một tấm thì đầu không phát triển, khoang áo chỉ
là 2 rãnh bên chân, biểu hiện sự phân đốt ở lớp vỏ, ở cấu tạo hệ thần kinh...
Lớp Chân bụng có phần thân xoắn chóp làm cơ thể mất đối xứng và chỉ thích

4


nghi với đời sống bò chậm trên giá thể. Chân rìu hay (Hai mảnh vỏ) có 2 vỏ
khớp vào nhau nhờ răng và dây chằng ở mặt lưng, phần đầu tiêu giảm, thích
nghi với đời sống chui rúc ừong bùn, cát. Chân thùy (hay Chân xẻng) có vỏ
dạng ống, phàn đàu tiêu giảm để thích nghi với đời sống chui trong bùn. Chân
đầu có phần chân chuyển thành tua đầu, hình thành phễu phun nước từ xoang
áo. Phần đầu phát triển, vỏ chuyển vào trong thành tấm nâng đỡ, cấu trúc cơ
thể thuôn dài thích nghi với đời sống săn mồi tích cực. Nội quan của Thân
mềm có những thay đổi để phù hợp lối sống. Thể xoang của Thân mềm tiêu
giảm nhiều, chỉ còn lại một phần quanh tim (được gọi là xoang bao tim) và
phần bao quanh tuyến sinh dục (xoang sinh dục). Phần còn lại giữa các nội
quan có mô liên kết lấp đầy. Có ý kiến cho rằng Thân mềm chỉ phát triển ở
mức độ xoang giả (pseudocoelum), tuy nhiên nhiều dẫn liệu cho thấy xoang
cơ thể của thân mềm chính là thể xoang tiêu giảm. Thân mềm có hệ tuần hoàn
hở (máu không chảy hoàn toàn trong mạch), nhưng lại có tim có cấu tạo khá

hoàn chỉnh. Ở mực tim có một tâm thất và 2 hay 4 tâm nhĩ). Hệ bài tiết là
dạng biến đổi của hậu đơn thận. Hệ thần kỉnh theo kiểu bậc thang kép (ở
nhổm thân mềm cổ) hay dạng hạch phân tán. Hệ tiêu hoá có cơ quan đặc
trưng là lưỡi gai (radula). Cơ quan hô hấp là lược mang (ctenidia) [1]
Lưỡi gai (lưỡi bào - radula) (hình 1.3) là cấu trúc đặc trưng của động vật
Thân mềm, cấu tạo là một khối kitin hay prôtein lát thành dưới của thực quản,
mặt trên lưỡi gai có nhiều dãy răng kitin. Phần gốc của lưỡi gai có các tế bào
sinh ra phần lưỡi gai bị bào mòn do qúa trình tiêu hoá. Hoạt động của lưỡi gai
được điều khiển bởi các chùm cơ co và duỗi và lưỡi gai có thể thò ra ngoài
cạo và cuốn thức ăn là thực vật vào miệng. Sự sắp xếp của các gai trên lưỡi
gai là đặc điểm chẩn loại quan trọng [1],

5


¿SS&

¿ísìi

ổ s ẩ i £253 ứ s ã
A

Hình 1.3. Một số kiểu lưỡi bào (radula) của Chân bụng (Theo Hickman)
A. Busycon carỉca; B. Murex regius; c. Cypraea tigris; D. Elysia
viridis; E. Scaphander
1.2. Phân loại động vật Thân mềm
Động vật Thân mềm khá phong phú về thành phần loài và nơi sống.
Hiện nay đã biết khoảng 130.000 loài, trong số đó có 35.000 loài đã hoá
thạch. Phần lớn sống ở biển, một số sống ở nước ngọt. Phân loại thân mềm
chủ yếu dựa vào sơ đồ cấu tạo cơ thể, sự thích ứng với các lối sống khác

nhau. Động vật thân mềm được chia làm 2 phân ngành, 7 lớp [4].
1.2.1. Phân ngành Song kinh (Amphỉneura)
Đặc trưng của động vật Song kỉnh là chưa có vỏ liền thành một khối mà
chỉ là các mảnh rời nhau hay chỉ là các gai. Ngành này có khoảng 600 loài,
sống ở biển, bám vào đá, cơ thể giẹp, đối xứng 2 bên, giác quan kém phát
triển và có nhiều đặc điểm phân đốt. Được chia làm 2 lớp là Song kinh có vỏ
và Song kinh không có vỏ [4].
Lóp Song kinh có vỏ (.Loricata) Hiện nay đã biết khoảng 800 loài đang
sống và 100 loài hoá thạch.
Lóp Song kinh Không có vỏ (Aplacophora) hay Rãnh bụng
(Solenogastres). Hiện nay đã biết khoảng 300 loài, cơ thể hình giun, kích
thước bé (dưới 10 mm). Phần lớn sống ở đáy biển sâu, trong bùn lầy xen lẫn
với các vùng có thủy tức là thức ăn của chúng.

6


1.2.2. Phân ngành vỏ liền (Conchífera)
Đặc trưng của nhóm động vật Thân mềm này là cơ thể được bọc ừong
một vỏ kín (một mảnh hay 2 mảnh). Phần thân nhô cao lên (được gọi là khối
hay bao nội tạng). Chia làm 5 lớp là v ỏ một tấm, Hai mảnh vỏ, Chân bụng,
Chân thùy (Chân xẻng) và Chân đầu [4].
Lớp vỏ một tấm (Monoplacophora) trước đây chỉ biết đến động vật
thuộc lớp này qua hoá thạch (tìm thấy hoá thạch ở các kỷ Cambri, Silua và
Đevon), đến năm 1952 mới gặp loài Neopilina galatheae sống ở ven bờ Thái
Bình Dương gần Mê Hi Cô, nơi có độ sâu 5.000m. Từ đó đến nay đã phát
hiện được 19 loài đang tồn tại, tất cả đều ở đáy biển sâu ừên 2.000m. Kích
thước thay đổi, loài lớn nhất là Neopilina galatheae dài tới 37mm và loài bé
nhất là Micropilina amtzi dài không hon lmm [4].
Lớp Chân bụng (Gastropoda) động vật Chân bụng chiếm tới gần 80%

tổng số loài của động vật Thân mềm (có khoảng 90.000 loài). Hiện nay đã
biết khoảng 75.000 loài đang sống và 15.000 loài đã hoá thạch. Phần lớn động
vật Chân bụng sống ở biển, một số sống ở nước ngọt, ở cạn hay chuyển sang
đời sống ký sinh [4].
Lớp Chân rìu (Pelecypoda) = Hai mảnh vỏ (Bivalvia) = Mang tấm
(Lamellibrachia) số loài hiện sống ( 8.000 loài) ít hơn nhiều so với các loài
hoá thạch ( 12.000 loài), trong đó chủ yếu sống ở biển, còn ở nước ngọt chỉ
chiếm (10 - 15%) [4].
Lớp Chân thùy = Chân búa = Chân xẻng (Scapoda) hoá thạch tìm thấy
của các đại diện thuộc lớp này xuất hiện muộn hơn (khoảng 450 triệu năm), lớp
này có khoảng 300 loài. Cơ thể đối xứng 2 bên, vỏ dạng ống nhỏ dần về phía
một đàu và thủng cả 2 đầu. Chân thùy sống chui rúc trong bùn [4].
Lóp Chân đầu (Cephalopoda) có khoảng 6.000 hiện sống và 7.000 loài
hoá thạch. Phần lớn chân đầu bơi giỏi, sống ở biển. Cơ thể có đối xứng hai
bên [4].

7


1.3. Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học động vật thân
mềm
Đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và các chất hoạt tính sinh
học phân lập từ đối tượng thân mềm. Berg, Krzynowek, Alatalo và Wiggin
(1985) nghiên cứu thành phần sterol và axit béo của loài Codakỉa orbicularis
cho thấy trong thịt của chúng chứa 74,8% nước, 1,1% mỡ, 2,9% tro. Hàm
lượng cholesterol là 20,6 mg/100g, chiếm 44,5% tổng của sterol [10].
Theo Đông y, thịt của các loài thân mềm có tính giãn mạch, làm mạch tuần
hoàn ngoại vi, phổi và tạng phủ, làm tăng sức dẻo dai của gân cốt cơ bắp, kích
hoạt các chức năng sinh sản, giải độc, giải nhiệt, giải khát, có lợi cho tóc, móng
và sinh dục... Ngoài giá trị hàm lượng đạm cao trong mô thịt với thành phần các

axit amin tự nhiên thiết yếu như: taurine, lysine, methionine; thịt của chúng còn
chứa hàm lượng lipid và các axit béo đa nối đôi với hoạt tính sinh học cao có vai
trò quan trọng đối với cơ thể sống như EPA (axit eicosapentaenoic); DHA (axit
docosahexaenoic),... [11]. Động vật thân mềm có tới trên 100.000 loài khác
nhau, trong đó các nhà khoa học đã tách chiết ra được các họp chất kháng
virut và vi khuẩn từ các loài sò, trai, ốc [6]. Các loài vẹm không chỉ là nguồn
protein dồi dào và rẻ tiền dành cho con người và động vật nuôi mà còn chứa
một loạt các chất có hoạt tính sinh học có giá trị vô cùng to lớn đối với khoa
học y dược. Dịch chiết từ vẹm xanh ấn độ {Perna vỉrỉdỉs) đã được xác nhận
có khả năng kháng virut cúm gia cầm (inluenza), kháng herpes và virut viêm
gan [7]. Đã từ lâu ở nước Australia người ta nhận thấy rằng bộ tộc du mục
Maori sống gần biển với nguồn thực phẩm từ biển dồi dào hầu như rất ít mắc
bệnh viêm khớp so với các bộ tộc Maori sống trong đất liền [13]. B. R.
Lawson và cộng sự đã xác định dịch chiết từ vẹm xanh New Zealand Pema
canaliculus thể hiện khả năng chống viêm nhiễm cao với hiệu quả tương
đương loại thuốc kháng viêm không chứa steroid (NSAIDs). Dịch chiết giàu

8


lipid của loài vẹm xanh này còn có khả năng ngăn chặn sự phát hiển của bệnh
viêm đa khớp do tá dược gây ra. Bệnh nhiễm trùng luôn là một vấn đề nan
giải trong thực tiễn y học. Hiện tượng nhiễm trùng vết thương, đặc biệt là các
vết thương nằm sâu trong cơ thể do các loài vi khuẩn khác nhau là mối lo ngại
lớn. Hơn nữa nhiều chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra sức đề kháng bằng
cách đột biến với thuốc kháng sinh, trong khi đó các loại kháng sinh hầu hết
có phổ tác dụng rất hẹp đối với các loài vi khuẩn. Vì vậy ngày càng có nhu
càu cấp thiết là phải tạo ra loại thuốc cho phép bảo vệ chống lại đồng thời các
loại vi sinh vật gây bệnh khác nhau và được sản xuất với giá cả phải chăng.
Các phân đoạn polypeptit với khối lượng khác nhau được tìm thấy trong các

dịch chiết từ một số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ đặc biệt là vẹm
xanh, có hoạt tính cao chống lại một phổ rộng các virut (kể cả vimt cúm gia
cầm), vi khuẩn và protozoa. Các phân đoạn polypeptit đặc biệt này được đặc
trưng bởi khả năng liên kết đặc thù sinh học với axit sialic khi có mặt các ion
Ca2+, ít nhất với một phân tử đường amin trong nhóm axit sialic. Axit béo
không no (PUFA) được phát hiện mới đây từ các loài vẹm xanh có hoạt tính
sinh học mạnh hơn 300 lần eicosapentaenoic axit (EPA), đặc biệt hoạt tính
chống viêm nhiễm. Các PUFA được tìm thấy trong dịch chiết vẹm xanh thể
hiện hoạt tính kháng viêm nhiễm rất cao và không có phản ứng phụ mặc dù
đã được thử nghiệm trên hàng ngàn bệnh nhân.
1.4. Lipid, các ỉớp chất lipid
Lipid (có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp cổ - hipos nghĩa là mỡ hay là chất
béo) là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các cơ thể
sống, trong động vật, thực vật và vi sinh vật. Chúng có thành phàn hoá học và
cấu tạo khác nhau nhưng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà
thường hoà tan trong các dung môi hữu cơ như: ete, clorofom, benzen, ete
dầu hỏa... [9]. Lipid là hợp phàn cấu tạo quan trọng của các màng sinh học tế

9


bào, là nguồn cung cấp năng lượng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các
vitamin A, D, E, F, K và F cho cơ thể sống [9].
Trong tự nhiên, những hợp chất thuộc về lớp chất lipid tồn tại rất đa dạng
như: các hydrocacbon bậc cao, các ancol, các aldehyde, các axit béo, các dẫn
xuất của chúng như glyceride, sáp, phospholipid, glucolipid, sulíolipid... [12].
Lipid có nhiều kiểu cấu trúc khác nhau, tuy nhiên cấu tạo lipid thường có
chung một nguyên tắc ừong thành phần phân tử lipid bao gồm hai phần: đầu
phân cực ưa nước và đuôi hydrocacbon kị nước (hình 1.4). Hai phần của phân
tử lipid được liên kết với nhau bởi mắt xích liên kết ở giữa. Thường người ta

dùng nguồn gốc tự nhiên của mắt xích liên kết, giữa phần phân cực và phần
không phân cực để làm cơ sở phân loại lớp chất lipid [8]. Theo đó, lipid có
hai dạng glycerolipid là các dẫn xuất của glycerol và sphingolipid là dẫn xuất
của sphingosine.
Đầu phân cực ưa nước
Mắt xích liên kết

Đuôi hydrocacbon kị nước

Hình 1.4. Cấu tạo phân tử lipid
Lipid thường được chia làm 2 nhóm chính là lipid đơn giản và lipid phức
tạp: lipid đơn giản là este của axit béo và ancol, bao gồm triacylglycerol (dầu,
mỡ thực vật), sáp, sterol; lipid phức tạp là trong phân tử của chúng ngoài acid
béo và ancol còn có các thành phần khác như: gốc acid phosphoric, cholin,
saccharide, ví dụ như glycolipid và phospholipid [9].
Trong thực tế đa phần lipid tồn tại dưới dạng este của glyxerol (1) với
các axit béo (gọi là glyxeride), khi mà cả ba nhóm hydroxyl (OH) của

10


glyxerol đều được este hóa thì gọi là triglyxeride hoặc là triaxylglyxerol (2),
công thức cấu tạo chung (hình 1.5):
CHZ -----OCOR

1 c h 2o h

2
R2OCO»-C—

2

H

3 CH2---- OCOR3
3 c h 2oh

Glyxerol (1)

Triglyxeride (2)

Hình 1.5. Cấu tạo lipid trên cơ sở glyxerol
Nhóm chất lipid khác cũng phân bố rộng rãi trong lớp màng tế bào, đặc
biệt ở não là các sphingolipid, chúng được cấu tạo trên cơ sở liên kết nhóm
amin của sphingosine (3) với các axit béo. Các sphingolipid đóng vai trò quan
trọng trong việc truyền dẫn tín hiệu và nhận biết tế bào, chúng có tác động
đặc biệt vào mô thần kinh. Một trong những dẫn xuất phổ biến trong động vật
biển là ceramide (4) và có công thức cấu tạo mô tả ở hình 1.6 [9].
C H oO H

,,2

1

H«

-Ó —

nh

H*

-c —

OH

CH

HO— CH'
CH— NH'
ho - ch 2

CH
(C H 2) 12

I

ỏh

Ceramide (4)

3

Sphingosine (3)

Hình 1.6. cấu tạo lipid trên cơ sở sphingozin

Các lớp chất chính của lipid sinh vật biển
Trong hệ sinh thái biển, lipid là nguồn hoạt chất giàu năng lượng nhất.
Lipid có nguồn gốc sinh vật biển được chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ,

và trong dịch chiết có thể chứa nhiều lớp chất với độ phân cực khác nhau, bao
gồm các họp chất có nguồn gốc từ cơ thể sinh vật, và cả những họp chất hình
thành do những tác động của các yếu tố bên ngoài. Nhà khoa học Christopher

11


c . Parrish (2013) đã chia các lớp chất lipid trong sinh vật biển thành 3 nhóm:
nhóm A là những lớp chất ít phân cực nhất như các hydrocacbon, các ester
đơn giản (sáp, ester của sterol....); nhóm B gồm các lớp chất có độ phân cực
trung bình như các ester phức tạp (triacylglycerol, diacylaglycerol...), các axit
béo tự do, các họp chất rượu, sterol; nhóm c gồm các lớp chất phân cực nhất
và phức tạp nhất như các pigment, monoacylglycerol, glycolipid,
phospholipid [ 12] (bảng 1. 1)
Bảng l.l.C ác lớp chất lipid trong sinh vật biển
Tên họp chất đại

Lớp chất lỉpỉd

Công thức cấu tạo

diên
■

Aliphatic
hydrocarbon

V X A A A A A A A /

n-nonadecane

J0 Ö
Q T ^

Phenanthrene

Hydrocarbon đa
vòng thơm

Hexandecyl

Sáp

Í?
Ö

palmitate

Cholesteryl

Steryl ester

palmitate
O

Ester mạch ngắn

h3
c.o

Methyl palmitate

í?
oII
h2c'

Triacylglycerol

1 oII

Tripalmitin

II
Ö

12


O
II

A x it b é o tự do

P a lm itic acid

R ư ợ u m ạ c h dài

P h y to l

S terol

C h o le ste r o l
HO^

'

O
II
D ia c y lg ly c é r o l

H2?1'° O
II

1 ,2 d ip a lm itin

" K n

P ig m e n t

CHjCHi CH,
Q
a i j / ^ r ' v ^ y--f
J \ 0
I
\ Jfcc-o-CHs
<
\ _^ Mr_
cH j-cü J. L JL
"H ^
a*ï
t ( ‘:h”

C h lo r o p h y ll a

O
II
M o n o a c y lg ly c e r
ol

h 2c

'°

1 m o n o p a lm itin

1
HC—OH
h^ - oh
çh2oh

G ly c o lip id

D ig la c to s y l

Hcr

Hc
ị/0
o- çh2 0
--—
hc-o-cn / x / n / s ^/n^/s^/n^ s^

ho/JX X °Hh2c,0

d ig ly c e r id e

0
0
II
ch2

P h o sp h o lip id

0

D ip a lm ito y l

H2Cn 1 1 II 1
h2c- n^ c- c- o- p- o- ch2
HU2U
C
I I I 0'
M
HH

x
le c ith in

13


Trong dịch chiết lipid tổng của các đối tượng thân mềm biển và một số

sinh vật biển khác như san hô, da gai..., các lớp chất lipid chính được xác
định đó là hydrocacbon, sáp, monoalkyldiacylglycerol, triacylglycerol, sterol,
lipid phân cực (glycolipid, phospholipid)
1.5. Phu’O'ng pháp xác định hàm lượng các lóp chất lỉpỉd sử dụng phần
mềm xử lí hình ảnh SORBFIL
Sử dụng phần mềm xử lý hình ảnh để đo mật độ quang học là một
trong những phưomg pháp thuận tiện nhất để tính toán định lượng đối với sắc
ký lớp mỏng (TLC). Để thực hiện, người ta sử dụng phép đo mật độ trên bản
mỏng TLC đã được scan bằng một chùm tia sáng có bước sóng cụ thể để tính
toán theo hình ảnh hiển thị của sắc ký đồ. Ưu điểm của phương pháp này
chính là thao tác không quá phức tạp và tốc độ xử lý nhanh.
Phần mềm Sorbfil (được sản xuất bởi Công ty Sorbpolimer) có thể xử
lý được bất kỳ một TLC nào, nhìn thấy trong ánh sáng ban ngày hoặc ánh
sáng tia cực tím với bước sóng 254 hoặc 365 nm. Hình ảnh của bản mỏng thu
được sau khi scan hoặc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số sẽ được chuyển ra
máy tính. Căn cứ vào hình ảnh thu được, phép đo mật độ sẽ tính toán kích
thước và cường độ của những vệt màu và sẽ thể hiện lượng chất tại vết đó.
Chương trình Sorbfil sẽ tính toán thành phần tỉ lệ phần trăm của các chất
trong hỗn họp và nồng độ các chất ữong mẫu. Khả năng tái hiện của phép đo
là 98%, trong khi độ lệch chuẩn tương đối của khu vực sắc ký nhỏ hơn 4%,
không vượt quá giá trị cho phép. Các kết quả tính toán (đồ thị, bảng), văn bản
ghi chú, thậm chí cả hình ảnh sắc kí phổ, có thể được lưu lại và in ra trong
báo cáo.
Tính đơn giản và độ chính xác cao, khả năng tái phân tích khi cần thiết
và kết quả đáng tin cậy của phần mềm này giúp nó có thể được sử dụng trong
các phòng thí nghiệm một cách phổ biến, mà không đòi hỏi phải thay đổi

14

phương pháp phân tích TLC hiện có. Phần mềm Sorbíil đã được sử dụng rộng
rãi để thay thế một số phương pháp truyền thống xác định hàm lượng các lớp
trong một hỗn hợp vốn mất nhiều thời gian, tỉ mỉ và phải sử dụng nhiều dung
môi độc hại. Phần mềm Sorbíil đã nhận được giấy chứng nhận Gosstandart
của Nga RU.C.31.001.A số 6488 , đăng ký N° 23965-02 trong sổ đăng ký nhà
nước về đo lường [13].

15


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 16 mẫu thân mềm được trình bày trong bảng
2.1. Mau được thu tại Hạ Long trong năm 2015, được định tên khoa học bởi
PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên Môi trường biển Hải Phòng, và
lưu trữ tiêu bản tại Viện Tài nguyên Môi trường biển Hải Phòng, Viện Hàn
lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và hình ảnh thân mềm nghiên cứu

TT

Ký
hiệu

Tên khoa học

Tên Viêt
•

Nam

Nhiêt
• đô•
Ảnh mẫu

noi thu
mẫu (°C)

Ostreidae

1 TM-1

Ostrea cucullata

Hầu

19.5

Gọ Tu mit

22

Ốc nhảy

20

Ốc mút

21

(Bom)
Fam. Veneridae

2

TM-2

Gafrarium tumidum
(Roding)
Fam. Strombidae

3

TM-3

Strombus canarỉum
(Linnaeus)
Potamididae

4

TM-4

Cerỉthỉdea obtusa
(Lamarck)

16

Fam. Veneridae
5

TM-5

Venus (Periglypta)

Con Sang

Ü /í

20

‘'ó. • ’ ^

lacerata (Hanley)
Fam. Veneridae

6

TM-6

Venus (Periglypta)

Con Sang

rM1"

21

pucrpera (Linné)
Turbinidae
7

TM-7

Lunella coronata

Ôc mat

20

Sô huyét

21

granulata (Gmelin)
Arcidae

8

TM-8

Annadara granosa
(Linné)
Arcidae

9

TM-9

Annadara

Sô long

binakayanensis
(Faustino)

m

21

Arcidae

10
TM-10

Trisidos semitorta

Sô

20

Biêp quat

20

(Lamarck)
Propeamussidae

11 TM-11

Amussium
pleuronectes (Linné)
Turbinidae

12 TM-12

Lunella coronata

Ôc mât

granulata (Gmelin)

17

9

21


Potamididae
13 TM-13

Batillaria zonalis

22

Ốc vặn
«

(Bruguiere)

1

Veneridae
14 TM-14

Radytapes variegata

Hến

(Sowerby)


22

Strombidae
15 TM-15

Strombus urceus

Ốc nhảy

20

Quéo

20

(Linnaeus)
Mytilidae
16 TM-16

Modiolus vagina
(Lamarck)

2.2.

Dụng cụ, hóa chất

2.2.1. Dụng cụ
- Máy cô quay chân không, cân phân tích Sortorius analytic (10'4).
- Bếp điện, tủ sấy, tủ lạnh
- Bình nón, cốc thủy tinh, ống đong, giấy lọc, phễu lọc, phễu chiết, giá
đỡ và một số thiết bị, dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hóa chất
Các dung môi, hóa chất dùng cho phân tích: Methanol (CH3OH),
cloroíòrm (CHCI3), H20 , diethyl ether, n- hexan, axit axetic,...
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết lipid tằng
Chiết lipid tổng theo phương pháp của Folch J.F, phương pháp được sử
dụng thường quy cho các mẫu sinh vật biển tại phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện
Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Mau thân mềm được xay nhỏ, sau đó được

18