Bài 08 Kết hợp kháng nguyên kháng thể

KẾT HỢP
KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ

PhD: Nguyễn Văn Đô


MỤC TIÊU
1. Trình bày được các đặc tính và lực liên kết
của phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)kháng thể (KT).
2. Nêu được nguyên lý và các loại phản ứng
tủa, cho ví dụ
3. Trình bày được nguyên lý và các loại phản
ứng ngưng kết
4. Trình bày được các loại miễn dịch đánh dấu


1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Ba đặc tính của phản ứng kết hợp KN-KT.
•  Đặc hiệu: KT chỉ kết hợp đặc hiệu với KN.
Ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh và
nghiên cứu.
•  Thuận nghịch: Kết hợp và phân ly, cấu trúc
KN và KT không thay đổi. Sự phân ly phụ
thuộc vào một số yếu tố như pH, nồng độ
muối, nhiệt độ.
•  Tạo nhiệt: 2-4Kcal/mol.


1.2. Các lực liên kết giữa KN-KT
Là những lực hóa lý thông thường, gặp trong các liên kết enzymecơ chất, hocmon với receptor…

Các lực

Nguồn gốc

Lực hút tĩnh điện

Tương tác giữa các nhóm
mang điện trái dấu

Cầu nối hydro

Hydro liên kết với các nguyên
tử mang điện âm (N,O)

Lực Van der Waal

Chuyển động của các đám
mây điện tử xung quanh
các phân tử làm cho phân
tử có cực

Lực hút kỵ nước
9/23/15

Các nhóm kỵ nước gần
nhau tương tác và giải
phóng các phân tử H20
PhD. Nguyễn Văn Đô,
Bôn môn: MD-SLB

1.3. Khái niệm epitop và paratop
•  Epitop là vị trí kháng nguyên kết
hợp trực tiếp với kháng thể. Có
nhiều loại epitop khác nhau (xem
hình)
Paratop là vị trí của kháng thể
kết hợp với kháng nguyên

KN nhỏ: 2 epitop; Vị trí KHKN: 2

KN
6 epitop;KHKN:
KNtrung
vừa:bình:
6 epitop;
Vị trí KHKN:44

KNlớn:
lớn:10
10epitop;
epitop;KHKN:
Vị trí KHKN:
8
KN
8

9/23/15

PhD. Nguyễn Văn Đô,

Bôn môn: MD-SLB


1.4. Ái tính và háo tính
1.4.1. Ái tính (affinity) của
KTvới KN được biểu thị
bằng tổng hợp tất cả các
lực liên kết giữa 1 paratop
với 1 epitop.

KT + KN
[KN.KT]
[KN]x[KT]

KN-KT

K

K: là hằng số kết hợp

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đơn hóa trị

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đa hóa trị


Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đơn hóa trị

1.4.2. “Háo tính”(avidity) của KT
là biểu thị tất cả các lực liên
kết giữa các KT và KN đa hóa
trị
•  Háo tính phụ thuộc vào số
epitop của KN và số hóa trị của
KT (IgG, IgM..), pH, các lực,
nhiệt độ và hằng số kết hợp.
•  Ái tính có ý nghĩa lý thuyết,
còn háo tính có ý nghĩa thực
tế.

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đa hóa trị


2. CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT

•  Phản ứng tủa
•  Phản ứng ngưng kết
•  Phản ứng miễn dịch đánh dấu

9/23/15

PhD. Nguyễn Văn Đô,
Bộ môn: MD-SLB


2.1. Phản ứng tủa
Nguyên lý chung.

Các loại phản ứng tủa:
•  Môi trường lỏng
•  Môi trường gel

Thừa KT

Tương
đương

Thừa KN

Lượng KT ngưng kết

Các KN hoặc KT ở dạng
hòa tan kết hợp với KT
hoặc KN đặc hiệu tương
ứng tạo thành các phức
hợp miễn dịch (tủa) có
thể nhìn thấy được.

Lượng KN thêm vào


2.1.1. Phản ứng tủa trong môi trường lỏng để
phát hiện KN hoặc KT (Định tính)
2.1.1.1. Vòng tủa trong môi trường lỏng
- Cho

KT vào mỗi ống nghiệm

- Nhỏ từ từ KN lên trên lớp KT
- Vòng tủa xuất hiện giữa 2 lớp KN và KT (ống 5)
- Các ống chứng: 1,2,3,4:

1

2

3

4

5

Vòng tủa


2.1.1.2. Tủa đều trong môi trường lỏng
- Cho KT vào một ống nghiệm
- Thêm một lượng KN tương ứng
- Lắc đều và quan sát tủa hình thành

1

KT 100µl
KN 100µl

2

Tủa: mờ, đục

Dung
dịch
đệm

KN
KT

Lượng tủa

2.1.2.3. Kết tủa
trong môi trường
lỏng: Heidelberger
và Kendall
Thừa KT

Tương
đương

Thừa KN

Lượng KN tăng dần


2.1.2. Kết tủa trong môi trường gel
(argarose)
2.1.2.1. Định tính
• 
• 

• 
• 

Khuếch tán một chiều trong gel
Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony.
Điện di đối lưu, kỹ thuật Kohn
Điện di miễn dịch.

2.1.2.2. Định lượng
•  Khuếch tán vòng đơn. Mancini
•  Điện di tên lửa-Laurell
•  Điện di miễn dịch hai chiều


Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony

KN1

KN1

1

KT

KN

KT1

2

Cơ chế
hình thành
hình cựa
gà

β2m
thỏ

β2m
lợn

KN1

KN2

KT1
KT2

KT
kháng
β2m

3


Điện di miễn dịch
- Lam kính đã phủ kín một lớp gel
- KN: HT người bình thường
- KT: Kháng HT người bình thường (ngựa)

+

+

Nơi để huyết thanh

Rãnh để kháng HT

-


Mancini:

HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma

- Gel chứa KT
- A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼ …

- C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG
1
A
B

2

3

4

5

6

Nồng độ IgG (mg/ml)

- B: IgG ngựa tinh khiết đã biết nồng độ (từ
trái sang phải: 30,15,7,2 và 15 mg/ml)

C
Đường kính vòng tủa (mm)


Điện di tên lửa

KT đã được
trộn đều
trong gel

Nồng độ KN


Nơi đặt mẫu

Điện di miễn
dịch hai chiều

KT đã trộn đều
trong gel

2.2. Phản ứng ngưng kết
2.2.1. Nguyên lý chung:
KN nằm trên bề mặt tế bào (hồng cầu, bạch
cầu…) hoặc các hạt nhân tạo mang kháng
nguyên kết hợp với KT đặc hiệu tạo thành các
mạng lưới KN-KT (ngưng kết) và có thể quan
sát được.


2.2.2. Các loại ngưng kết:
–  Chủ động (KN là các tế bào hồng cầu, bạch cầu,
tiểu cầu, tinh trùng…).
–  Thụ động (KN hoặc KT gắn nhân tạo lên các hạt
… Khi KN gắn lên hạt nhân tạo như HC nhóm O,
HC cừu hoặc hạt latex thì phản ứng gọi là
ngưng kết thụ động thuận, còn khi KT gắn lên
các hạt trên thì gọi là thu động ngược).


2.2.3. Một số ví dụ.
•  Ngưng kết chủ động (xác định nhóm hồng cầu)
Các loại
hồng
Các
loạicầu
hồng cầu

Các cấu trúc cacbohydrat
Các
HT

HTloại
mẫu

KTK A&B

KTK B

KTK

A

Không
KTK A&B


Trực tiếp

Gián tiếp

Mẹ Rh-, Con Rh+

•  Nghiệm pháp
Cooms trực tiếp và
gián tiếp

HC con+KT mẹ

Huyết thanh mẹ

Thêm HC Rh+ và rửa KT

không gắn

+KT thỏ kháng Ig người

+KT thỏ kháng Ig người

PhD. Nguyễn Văn Đô,
Bônkết
môn: MD-SLB
Ngưng


2.3. Phản ứng miễn dịch đánh dấu

Nguyên lý chung:
KN hoặc KT được gắn với enzym hoặc một
trong số các chất hóa học khác (phóng xạ,
huỳnh quang…) để làm tăng khả năng nhận
biết phức hợp KN-KT lên rất nhiều lần.


Đặc điểm:

•  Độ nhạy rất cao: có thể phát hiện được các
phân tử KN hoặc KT ở nồng độ hoặc mật độ
thấp
•  Các chất đánh dấu không làm biến tính KN
hoặc KT
•  Thường phải đọc kết quả ở các thiết bị
chuyên dụng.

2.3.1. Miễn dịch huỳnh quang (MDHQ)
2.3.1.1. Nguyên lý
Ánh sáng kích thích

Ánh sáng phát ra