Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài Trà hoa vàng ở vườn Quốc gia Tam Đảo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN
CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG
Ở VƢỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


Công trình được hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Hà Văn Huân
PGS.TS. Nguyễn Trung Thành

Phản biện 1:

PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Phản biện 2:

TS. Nguyễn Tƣờng Vân

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại:
Phòng 133 nhà T1 – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
Vào 09 giờ 30’ ngày 22 tháng 11 năm 2016

Có thể tìm luận văn tại:
- Trung tâm Thư viện Đại học Quốc Gia Hà Nội


I. MỞ ĐẦU
Trà hoa vàng thuộc chi Trà Camellia (họ Theaceae, bộ Ericales) có
hoa màu vàng, được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào những năm
đầu thế kỉ XX. Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ra khoảng
trên 30 loài Trà hoa vàng, trong đó có 28 loài được tìm thấy ở Trung
Quốc và 24 loài tìm thấy ở Việt Nam. Các loài trà hoa vàng có giá trị lớn
về mặt dược liệu, được biết đến với tác dụng kiềm chế sinh trưởng khối
u, ngăn ngừa ung thư, giảm lượng cholesterol và lipoprotein trong máu
do có các nguyên tố vi lượng như Germanium (Ge), Selenium (Se),
Mangan (Mn)… Ngoài ra trà hoa vàng còn có giá trị thẩm mỹ cao, được
trồng làm cây cảnh do có hoa lớn màu vàng đặc trưng.
Ở Việt Nam, Trà hoa vàng được phát hiện chủ yếu ở một số địa
phương như VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc), VQG Cúc Phương (Ninh
Bình), Phước Lộc (Lâm Đồng)…, trong đó ở VQG Tam Đảo phát hiện
ra 8 loài với một số loài đặc hữu của Việt Nam như Camellia
tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia petelotii … . Đây là
nguồn gen vô cùng quý hiếm cho hệ thực vật ở Tam Đảo nói riêng và
Việt Nam nói chung, cần được bảo vệ và phân loại để đưa ra biện pháp
thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, đa dạng sinh học. Tuy nhiên, hiện

nay Trà hoa vàng ở Tam Đảo đang bị đe dọa nghiêm trọng do việc khai
thác quá mức từ phía người dân, đồng thời việc bảo tồn và nghiên cứu
còn chưa được chú ý nhiều .
Cho đến nay, việc phân loại thực vật nói chung và các loài thuộc
chi Trà nói riêng chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, cấu tạo giải
phẫu bên trong . Việc phân loại này trong một số trường hợp gặp nhiều
khó khăn do một số loài Trà hoa vàng có đặc điểm hình thái tương đối
giống nhau. Với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen,
một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã được
nghiên cứu và phát triển sử dụng các đoạn mã vạch ADN đặc trưng cho
loài (DNA barcode) . Phương pháp này trở thành công cụ đắc lực cho
các nhà khoa học trong việc phát hiện loài mới, phân loại, đánh giá đa
dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài. Mỗi đoạn mã vạch ADN có
đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác
nhau (chi, loài, dưới loài). Một số đoạn mã vạch ADN được sử dụng phổ
biến ở thực vật có thể kể đến như matK, rbcL, trnH-psbA, rpoB, rpoC1,
psbI-psbK, atpF-atpH, trnL-trnF...
Với mục xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử cho các loài Trà hoa vàng
ở VQG Tam Đảo, cụ thể là 5 loài Hải đường vàng (Camellia tienii
1


Ninh), Trà vàng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr.), Trà vàng lá dày
(Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Trà vàng Tam Đảo (Camellia
tamdaoesis Hakoda et Ninh), Trà vàng Petelo (Camellia petelotii (Merr.)
Sealy), đề xuất mã vạch thích hợp đặc trưng cho các loài trà này thông
qua việc xác định và phân tích trình tự của một số đoạn mã vạch, tác giả
tiến hành đề tài “Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài
Trà hoa vàng ở Vƣờn Quốc gia Tam Đảo” với đối tượng phân tích là
năm vùng trình tự rbcL, matK, ycf1b, trnH – psbA và ITS2. Kết quả thu

được sẽ đóng góp vào Ngân hàng gen Quốc tế để giám định các loài Trà
hoa vàng, xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Trà hoa vàng với
nhau và với các loài trong chi trà Camellia, nâng cao hiệu quả bảo tồn
và phát triển các loài Trà hoa vàng quý hiếm ở không chỉ ở Việt Nam
mà còn trên toàn thế giới.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Năm loài trà hoa vàng trong nghiên cứu này gồm có: Camellia
crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày), Camellia hakodae Ninh
(Trà vàng hakoda), Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo),
Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo), Camellia
tienii Ninh, Tr. (Hải đường vàng) với số lượng mẫu là 3 mẫu/loài.
Năm đoạn mã vạch nghiên cứu: matK, rbcL, trnH-psbA, ycf1b và
ITS2.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu gồm có năm nội dung chính: Tách chiết AND tổng số
các mẫu lá trà hoa vàng, nhân bản các đoạn mã vạch ADN bằng kỹ thuật
PCR, phân tích và xác định trình tự các đoạn mã vạch ADN thu được,
xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài trà hoa vàng nghiên cứu và
với các loài khác trong chi trà Camellia dựa trên các trình tự thu được và
xác định đoạn mã vạch đặc trưng cho các loài trà hoa vàng ở VQG Tam
Đảo.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Hóa chất sử dụng bao gồm bộ KIT tách chiết ADN thực vật
“Plant/Fungi DNA Isolation KIT” - Norgen, Canada; hóa chất PCR:
Master mix 2X, nước PCR, mồi nhân gen; bộ KIT tinh sạch sản phẩm
PCR “PCR Purification KIT” – Norgen, Canada; hóa chất điện di:
Agarose; đệm TAE; Redsafe solution. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2


bao gồm găng tay, khẩu trang, pipette các loại, cối chày sứ… Máy móc
sử dụng gồm có máy PCR, cân phân tích, máy ly tâm, máy đo nano
drop, tủ lạnh -80o, bộ điện di, máy chụp ảnh bản gel…
Mồi được sử dụng để nhân các đoạn trình tự được thiết kế dựa trên
các tài liệu đã được công bố.
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng
Tm
Vùng Tên
Trình tự mồi
gen
mồi
(oC)
mTHV 5’60.7
F
TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3’
matK
5’mTHV
CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA- 60.5
R
3’
rP1 F 5’- ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC -3’ 57.2
rbcL
rP1 R 5’ - GTAAAATCAAGTCCACCRCG - 3’
52.8
61.1
trnH- trnPF1 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC - 3’
psbA psbPR1 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC - 3’

52.3
5’- TCTCGACGAAAATCAGATTGTTGTGAA ycf1b F
56.9
3’
ycf1b
ycf1b
5’- ATACATGTCAAAGTGATGGAAAA- 3’
50.6
R
Is2P1 F 5’- ATGCGATACTTGGTGTGAAT - 3’
51.9
ITS2 Is2P1
5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’
52.1
R
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thu mẫu lựa chọn mẫu lá bánh tẻ không bị sâu bệnh nấm mốc, lấy
3 mẫu/loài x 5 loài từ các cá thể độc lập. Sau khi thu, mẫu được bảo
quản trong túi nilon có chứa hạt silica gel hút ẩm, ghi đầy đủ thông tin
mẫu và được giữ ở -80oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của 5 loài Hải
đường vàng (Camellia tienii Ninh), Trà vàng Hakoda (Camellia hakoda
Ninh, Tr.), Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Trà
vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Trà vàng Petelo
(Camellia petelotii (Merr.) Sealy) theo hướng dẫn của Kit (Plant/Fungi
DNA Isolation Kit). Xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch
ADN tổng số bằng máy đo nano drop. Nhân bản đoạn gen matK, rbcL,
3

trnH-psbA, ITS2 và ycf1b từ các mẫu ADN tổng số tách chiết được bằng
kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems
(Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl, bao
gồm: H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/
µl mồi xuôi (1,0 µl), 10 pmol/ µl mồi ngược (1,0 µl) và 50 ng/µl ADN
khuôn (1 µl). Chương trình phản ứng PCR: 94oC trong 3 phút; (94oC: 30
giây, 55oC : 30 giây, 72oC : 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC trong 5 phút;
bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác
nhau phụ thuộc và cặp mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần
trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 1,0 %, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV) và chụp ảnh
bằng hệ thống Dolphin - Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ). Sản
phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit tinh sạch sản phẩm
PCR (PCR Purification Kit) của Norgen, Canada. Sau khi tinh sạch sản
phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải
trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy
giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được phân tích bằng các
phần mềm chuyên dụng như DNAClub, Bioedit, Mega6,...Trình tự
nucleotide của các đoạn mã vạch ADN sau khi phân tích được đăng ký
trong ngân hàng cơ sở dữ liệu ADN của Việt Nam (www.dnabank.vn).
Trình tự ADN sau khi được giải trình tự sẽ được so sánh và sắp
xếp thẳng hàng sử dụng thuật toán MUSCLE [100]. Kết quả sắp xếp
thẳng hàng sẽ được sử dụng sau đó để tính khoảng cách di truyền, sử
dụng phần mềm MEGA6 trên cơ sở phương pháp tính Kimura 2parameter, xây dựng cây phân loại theo phương pháp Maximum
Likelihood trong MEGA6. Cây phân loại xây dựng theo mô hình
Kimura 2-parameter, giá trị bootstrap 1000, tất cả các vị trí bao gồm các
gap và dữ liệu trống đều được sử dụng để phân tích.
III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trà hoa vàng.

Bảng 3.1. Mẫu vật nghiên cứu
STT
Tên loài
Tên khoa học
Kí hiệu mẫu
TCT88.1
1 Hải đường vàng Camellia tienii Ninh
TCT88.2
TCT88.3
TCH89.1
2 Trà vàng hakoda Camellia hakoda Ninh, Tr.
TCH89.2
4


3

Trà vàng lá dày

Camellia crassiphylla Ninh
et Hakoda

4

Trà vàng tam
đảo

Camellia tamdaoensis
Hakoda et Ninh

5

Trà vàng petelo

Camellia petelotii (Merr.)
Sealy

T88.1

T88.2

T88.3

T89.1 T89.2

T89.3 T90.1

T90.2

T90.3

T91.1

T91.2

T91.3

TCH89.3
TCC90.1
TCC90.2

TCC90.3
TCT91.1
TCT91.2
TCT91.3
TCP92.1
TCP92.2
TCP92.3
T92.1

T92.2 T92.3

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số các mẫu
Trà hoa vàng
Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu trà hoa vàng cho thấy các
băng ADN tổng số tương đối sắc nét, sáng rõ chứng tỏ ADN tổng số thu
được khá nguyên vẹn, ít đứt gãy, đồng thời kết quả đo nano drop cho
thấy ADN thu được với hàm lượng tương đối lớn, độ tinh sạch cao, phù
hợp sử dụng cho phản ứng PCR ở bước sau.
Bảng 1.2. Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu ADN tổng số (pha
loãng 10 lần)
Mẫu
T88
T89
T90
T91
T92
371
417
365
451

256
Nồng độ ADN
432
423
396
318
284
(ng/µl)
295
315
402
331
312
1.77
1.66
1.88
1.69
1.51
OD260nm/OD280nm 1.82
1.93
1.68
1.53
1.73
1.99
1.81
2.05
1.78
2.01

5

3.2. Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN.
Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN được kiểm tra bằng phương
pháp điện di trên gel agarose 1%, cho thấy các băng ADN lên rõ nét,
kích thước đồng đều giữa các mẫu, không có băng phụ chứng tỏ mồi
được dùng để nhân bản các đoạn mã vạch được thiết kế đặc hiệu. Đối
chứng dương lên băng rõ nét, có kích thước bằng với các băng được
nhân bản, đối chứng âm không lên băng chứng tỏ hóa chất và các điều
kiện tiến hành phản ứng PCR là hoàn toàn bình thường. So sánh với kích
thước các băng marker cho thấy đoạn gen matK có kích thước khoảng
950bp, đoạn rbcL có kích thước khoảng 600bp, đoạn trnH-psbA là
500bp, đoạn ITS2 khoảng 400bp và đoạn ycf1b là 750bp. Các sản phẩm
PCR này có thể giải trình tự trực tiếp để thu được trình tự các đoạn Mã
vạch ADN cho các loài trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo.
3.3. Giải trình tự và phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN
3.3.1. Kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự nucleotide các đoạn mã vạch cho thấy với
mỗi loài trà hoa vàng được làm 3 mẫu với 3 lần thí nghiệm độc lập, kết
quả nhận được và phân tích bằng phần mềm tin sinh cho thấy các đoạn
tương ứng của 3 mẫu trong cùng một loài trà có trình tự tương đồng với
nhau 100%. Kết quả được thể hiện cụ thể trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đánh giá trình tự các đoạn mã vạch thu đƣợc
Các đoạn mã vạch ADN
trnHmatK rbcL
ycf1b
ITS2
psbA
Số lượng cá thể
15

15
15
15
15
Tỷ lệ PCR thành công
100
100
100
100
100
(%)
Tỷ lệ giải trình tự
100
100
100
100
100
thành công (%)
945 502 750 397 Độ dài trình tự
599
951
510
762
399
Độ dài so sánh
951
599
510
762
408

Số vị trí thay thế
1
1
1
2
4
Số vị trí bảo thủ
950
598
508
760
404
Số nucleotide thêm/mất
6
0
14
12
26
đi
Số vị trí mang thông tin
0
0
1
0
2
6


3.3.1.1. Kết quả phân tích trình tự đoạn matK
So sánh trình tự đoạn mã vạch ADN matK ở ba loài Hải đường

vàng (mT88), Trà vàng Hakoda (mT89), Trà vàng Tam Đảo (mT91) cho
thấy không có sự khác biệt giữa ba loài này. Tỷ lệ tương đồng của 3 loài
trà hoa vàng nói trên so với trình tự matK loài trà xanh Camellia sinensis
công bố trên ngân hàng gen NCBI là 100%. Cùng với đó, tỷ lệ tương
đồng của loài Trà vàng lá dày (mT90) là 99,89%, loài Trà vàng Petelo
(mT92) là 99,37%. Các loài này theo cách phân loại dựa trên sự khác
biệt ở trình tự matK có họ hàng gần với một số loài trà như Camellia
sinensis var. Sinensis, Camellia leptophylla, Camellia crapnelliana, xa
hơn với các loài trà Camellia impressinervis, Camellia yunnanensis,
Camellia japonica, Camellia oleifera…

7


Hình 3.2. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn matK

8


3.3.1.2. Kết quả phân tích trình tự đoạn rbcL
So sánh trình tự rbcL của cả năm loài với nhau và so với trình tự
trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI loài Camellia oleifera cho thấy không
có sự khác biệt lớn (chỉ sai khác 1 nucleotide ở loài Hải đường vàng
Camellia tienii so với các loài còn lại). 4 loài trà hoa vàng còn lại có
trình tự rbcL giống hệt nhau và giống với trình tự loài Camellia oleifera
trên NCBI. Mức độ tương đồng cao trên 99% của trình tự rbcL ở các
loài trà cho thấy đoạn trình tự này rất bảo thủ không chỉ trên đối tượng
trà hoa vàng mà còn ở các loài trà khác thuộc chi Camellia nói chung.
Tuy nhiên khi mục đích sử dụng không yêu cầu phân loại đến mức độ
loài, trình tự matK vầ rbcL thu được là sự lựa chọn phù hợp để giám

định do tương đối dễ nhân bản và giải trình tự.
3.3.1.3. Kết quả phân tích trình tự đoạn trnH-psbA
Kết quả phân tích so sánh cho thấy đoạn trnH-psbA ở giữa các loài
Trà hoa vàng có sự sai khác tương đối lớn. Độ dài các đoạn trnH-psbA ở
các loài Camellia tienii, Camellia hakodae, Camellia crassiphylla,
Camellia tamdaoensis và Camellia petelotii lần lượt là 502, 509, 504,
504 và 510bp, trong đó Camellia crassiphylla và Camellia tamdaoensis
là hai loài có trình tự trnH-psbA khác biệt nhất so với các loài khác và
so với loài Camellia oleifera trên ngân hàng gen NCBI. Sự sai khác
tương đối lớn giữa các loài trong cùng chi Camellia nói chung và các
loài Trà hoa vàng nghiên cứu nói riêng cho thấy đoạn trình tự trnH-psbA
là dấu chuẩn tiềm năng cho việc phân biệt các loài trà hoa vàng sử dụng
mã vạch ADN. Cây phân loại sinh học xây dựng được cho thấy hai loài
Camellia tienii Ninh, Tr. và Camellia hakodae Ninh có mối quan hệ gần
với nhau, đồng thời các loài Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda,
Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh và Camellia petelotii (Merr.)
Sealy có vị trí gần nhau hơn trong bậc phân loại. Cả 5 loài trà này đều có
mối quan hệ gần hơn cả với loài Trà vàng Camellia tonkinensis, tiếp
theo sau đó là các loài Camellia yunnanensis, Camellia sinensis var.
Sinensis, Camellia leptophylla…

9


Hình 3.3. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen rbcL
10


Hình 3.4. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn trnH-psbA
11

3.3.1.4. Kết quả giải trình tự đoạn ycf1b
Giải trình tự đoạn ycf1b ở các loài Trà hoa vàng thu được đoạn dài
762bp ở các loài Camellia tienii, Camellia hakodae; 756bp ở các loài
Camellia crassiphylla, Camellia tamdaoensis và 750bp ở loài Camellia
petelotii. So với hai đoạn matK và rbcL, trình tự ycf1b đã cho thấy mức
độ khác biệt rõ rệt hơn, thể hiện tiềm năng giám định tốt hơn nếu được
kết hợp với một vài trình tự mã vạch khác. Cây phân loại sinh học dựa
trên trình tự đoạn ycf1b cho thấy ba loài Camellia crassiphylla,
Camellia tamdaoensis và Camellia petelotii có mỗi quan hệ gần gũi với
nhau hơn khi so sánh với hai loài còn lại Camellia tienii và Camellia
hakodae. Các loài này cũng có mối quan hệ gần hơn cả với hai loài
Camellia pitardii và Camellia crapnelliana.
3.3.1.5. Kết quả giải trình tự đoạn ITS2
Kết quả so sánh cho thấy so với các đoạn trình tự lục lạp nghiên cứu,
đoạn ITS2 có mức độ sai khác giữa các loài Trà hoa vàng lớn nhất. Đây
cũng là đoạn trình tự có số vị trí mang thông tin nhiều nhất trong số 5
đoạn trình tự (2 vị trí). Tuy nhiên độ tương đồng 100% giữa 3 loài Hải
đường vàng T88 Camellia tienii, Trà vàng hakoda T89 Camellia
hakodae, Trà vàng petelo T92 Camellia petelotii cho thấy tuy có mức độ
sai khác cao giữa nhiều loài, song vẫn có những loài giống nhau về trình
tự đoạn ITS2, do vậy đoạn ITS2 không thích hợp để làm dấu chuẩn đặc
hiệu cho các loài Trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo. Mối quan hệ giữa các
loài Trà hoa vàng nghiên cứu dựa trên trình tự ITS2 được thể hiện trên
cây phân loại sinh học. Trong đó, ba loài Camellia tienii Ninh, Tr.,
Camellia hakodae Ninh và Camellia petelotii có mối quan hệ rất gần với
nhau và tách biệt với nhánh chứa hai loài Camellia crassiphylla và
Camellia tamdaoensis. Theo đó, các loài trà nghiên cứu cũng có mối
quan hệ gần với các loài Camellia impressinervis, Camellia

yunnanensis, Camellia parvimuricata var. Hupehensis, Camellia
euphlebia và Camellia piquetiana.

12


Hình 3.5. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn ycf1b

13