Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ

Header Page 1 of 123.
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
----------------

NGUYỄN THỊ THẮM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN

MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG
CHUYỂN HÓA BÃ MÍA THÀNH MÙN HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016
Footer Page 1 of 123.


Header Page 2 of 123.

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp em đã nhận đƣợc sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của Nhà
trƣờng, Thầy cô và các bạn.
Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo,
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình
hƣớng dẫn, sửa luận văn để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh-KTNN,

Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy, tạo điều kiện cho chúng em
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Vi sinh vật, Khoa
Sinh-KTNN, Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn,
tạo điều kiện tốt nhất giúp em học tập và làm việc trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.
Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân
đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có đƣợc kết quả
này.
Trong quá trình thực hiện đề tài, do bƣớc đầu làm quen với nghiên cứu
khoa học nên không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự đóng
góp ý kiến từ phía thầy cô và các bạn sinh viên.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Thắm

Footer Page 2 of 123.


Header Page 3 of 123.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các số
liệu, các kết quả thu đƣợc trong khóa luận là trung thực, chƣa từng đƣợc công
bố trong bất kỳ công trình khoa học nào.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Thắm

Footer Page 3 of 123.


Header Page 4 of 123.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài ..................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu............................................................................... 2
3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu..................................................... 2
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 2
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................. 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................. 3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3
6. Tính mới................................................................................................. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5
1.1. Đặc điểm và phân loại nấm mốc ........................................................... 5
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) ......................................................... 5
1.1.2. Bào tử trần (conidia) ......................................................................... 7
1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium .................................................................... 8
1.3. Sơ lƣợc về chi Aspergillus .................................................................... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới ..................... 9
1.3.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus ..................................................... 9
1.4. Cellulose và Cellulase .........................................................................11
1.4.1. Cellulose ..........................................................................................11

1.4.2. Cellulase ..........................................................................................12
1.5. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam ..................................13
1.5.1. Trên Thế giới ...................................................................................13
1.5.2. Ở Việt Nam......................................................................................14

Footer Page 4 of 123.


Header Page 5 of 123.

1.6. Định hƣớng ứng dụng..........................................................................15
1.6.1. Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose .........................15
1.6.2. Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng..............................15
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............17
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu .......................................................17
2.1.1. Vi sinh vật .......................................................................................17
2.1.2. Hóa chất – Thiết bị ...........................................................................17
2.2. Môi trƣờng phân lập và nuôi cấy..........................................................17
2.2.1. Môi trƣờng phân lập nấm mốc ..........................................................17
2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giống ....................................................18
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy thử hoạt tính enzyme ........................................18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................18
2.3.1. Phƣơng pháp ủ và lấy mẫu ................................................................18
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc........................................................19
2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống ................................19
2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái nấm mốc ..........................................19
2.3.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc .....................20
2.3.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả .............................................21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme

cellulase từ bã mía ủ...........................................................................22
3.1.1. Phân lập các chủng nấm mốc trong bã mía ủ......................................22
3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập .......23
3.1.3. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao .........26
3.2. Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6 .......................29
3.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M6 .............................................29
3.2.2. Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M4 .............................................30

Footer Page 5 of 123.


Header Page 6 of 123.

3.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung bột đậu tƣơng
đến khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc
Penicillium M4 và chủng Penicillium M6 .............................................32
3.4. Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tƣơng chuyển hóa thành mùn
hữu cơ và trồng rau sạch.....................................................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................41
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................45

Footer Page 6 of 123.


Header Page 7 of 123.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả các chủng nấm mốc thu đƣợc sau 5 lần phân lập .............22
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc đã phân lập ..............24

Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa 1% CMC ....27
Bảng 3.4. Đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc đã phân
lập .............................................................................................27
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M4,
Penicillium M6 với các tỷ lệ bột đậu tƣơng khác nhau...................33
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm trồng rau mầm củ cải xanh trên bã mía ủ
và đất đối chứng .........................................................................36

Footer Page 7 of 123.


Header Page 8 of 123.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes............................................................... 6
Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes ....................................................... 6
Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt ...................................... 7
Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần ........................................................ 8
Hình 1.5. Chi Penicillium (Các thành phần của chổi )................................... 9
Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể .....................................................10
Hình 1.7. Cấu trúc lập thể của cellulose ......................................................11
Hình 1.8. Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase .................13
Hình 3.1. Khuẩn lạc một số chủng nấm mốc trên môi trƣờng Czapeckdox ............................................................................................23
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng nấm mốc đã tuyển chọn............28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV
(x1000) ......................................................................................30
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV
(x1000) .....................................................................................32
Hình 3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính có bổ sung bột đậu tƣơng ......................33
Hình 3.6. Hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M6 và Penicillium

M4 trong môi trƣờng bổ sung bột đậu tƣơng.................................35
Hình 3.7. Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trƣờng đất khác nhau ........37
Hình 3.8. Chiều cao của cây trồng trên bã mía ủ (CT1)................................37
Hình 3.9. Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trƣờng đất khác nhau ........38

Footer Page 8 of 123.


Header Page 9 of 123.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Footer Page 9 of 123.

1. CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

2. dd

: Dung dịch

3. KHV

: Kính hiển vi

4. KL

: Khuẩn lạc

5. NM

: Nấm mốc

6. VK

: Vi khuẩn

7. VSV

: Vi sinh vật

8. XK

: Xạ khuẩn


Header Page 10 of 123.

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, vấn đề môi trƣờng đang đƣợc hầu hết các quốc gia trên thế
giới đặc biệt quan tâm. Ô nhiễm môi trƣờng đang ngày càng trở lên trầm
trọng, kéo theo thiên tai biến động ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái. Một
trong những nguồn thải gây ô nhiễm mỗi trƣờng là các chất thải, phế phẩm
khó đƣợc phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên, bã mía là một trong số đó. Mía
là loại cây lấy đƣờng quan trọng của ngành công nghiệp đƣờng với tổng diện
tích hàng triệu hec-ta và sản lƣợng mía thu hoạch mỗi năm lên tới 1,83 tỷ tấn.
Lƣợng bã mía thải ra ƣớc tính chiếm 25-30% lƣợng mía đem ép, nguồn bã
mía nếu không đƣợc xử lý sẽ đem lại một nguy cơ lớn về lƣợng phế phẩm gây

ô nhiễm môi trƣờng.
Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lý
mùn cƣa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân hữu cơ. Ở Việt
Nam trong những năm gần đây, vấn đề về xử lý bã mía, rơm rạ sau thu hoạch
đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học. Trong đó
có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử lý phế
phụ phẩm nhƣ: xử lý rơm rạ bằng chế phẩm Trichoderma với nhiều loại đất
canh tác khác nhau của Trần Thị Ngọc Sơn, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu
Long (2013), đã sản xuất thành công chế phẩm sinh học Trichoderma có khả
năng xử lý rơm rạ trực tiếp ngoài đồng làm giảm tỷ lệ C/N trong rơm rạ và
gia tăng hàm lƣợng NPK, gia tăng năng suất lúa c ng nhƣ tăng hiệu quả kinh
tế trồng lúa và cải thiện độ phì nhiêu đất. Hay của Nguyễn Thị Dung (2013),
nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân
giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp tốt nhất là vỏ trấu và xác định
đƣợc điều kiện tối ƣu về khả năng lên men rắn của chủng nấm mốc M4V,
ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Nghiên cứu gần đây của Phạm

1
Footer Page 10 of 123.


Header Page 11 of 123.

Thị Thanh Nhàn (2014), đã nghiên cứu đƣợc 03 chủng vi khuẩn, 02 chủng xạ
khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose tốt nhất, đánh giá hoạt tính enzyme
ngoại bào và thử nghiệm khả năng phân giải rơm rạ thực tế, có thể ứng dụng
trong sản xuất chế phẩm sinh học chuyển hóa rơm rạ thành phân hữu cơ
[13]... Tuy nhiên chƣa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về vi sinh vật
tham gia chuyển hóa phế phẩm nông nghiệp, đặc biệt là chuyển hóa bã mía
thành mùn hữu cơ.

Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn phế phẩm
giàu cellulose đã và đang đƣợc triển khai rộng rãi. Quá trình phân giải này
hầu hết là do sự chuyển hóa nhờ vi sinh vật, trong đó nấm mốc là một trong
những đối tƣợng đƣợc các nhà khoa học quan tâm bởi lƣợng enzyme ngoại
bào sinh ra tƣơng đối lớn, có thể ứng dụng để phân giải nguồn rác thải giàu
cellulose nhƣ rác thải sinh hoạt, phế phẩm nông nghiệp. Do vậy, nghiên cứu
các chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase nhằm xử lý bã mía là hƣớng nghiên
cứu cần thiết. Chính vì vậy tôi quyết định thực hiện đề tài:“Phân lập, tuyển chọn
một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme phân
giải cellulose từ khối ủ bã mía; xác định hàm lƣợng bột đậu tƣơng bổ sung
thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính enzyme cellulase
của chủng nấm mốc tuyển chọn và ứng dụng chuyển hóa bã mía thành mùn
hữu cơ, thử nghiệm trồng rau sạch.
3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong khối ủ bã
mía thu đƣợc tại Phƣờng Xuân Hòa, Thị xã Phúc Yên, Tỉnh Vĩnh Phúc.

2
Footer Page 11 of 123.


Header Page 12 of 123.

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phƣơng pháp ủ và lấy mẫu
3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc
3.2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống

3.2.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái nấm mốc
3.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc
3.2.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng phân giải
cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp, qua đó tuyển chọn và định loại
sơ bộ một số chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cellulase tốt từ bã mía.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tìm ra hƣớng đi mới tốt hơn cho phế phẩm bã mía, đồng thời ứng dụng
trong quá trình phân giải bã mía và rác thải có cấu trúc cellulose thành mùn
hữu cơ, khắc phục ô nhiễm môi trƣờng.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu
5.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme
cellulase trong bã mía ủ
5.2. Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6
5.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung bột đậu tƣơng đến
khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc Penicillium M4 và
chủng Penicillium M6
5.4. Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tƣơng chuyển hóa thành mùn hữu
cơ và trồng rau sạch

3
Footer Page 12 of 123.


Header Page 13 of 123.

6. Tính mới
Từ nguồn cơ chất bã mía ủ đã tuyển chọn và định loại sơ bộ 2 chủng

nấm mốc M4 và M6 có hoạt tính cellulase cao với đƣờng kính vòng phân giải
của chủng Penicillium M6 là D = 22mm, chủng Penicillium M4 là D = 21mm.
Sử dụng bột đậu tƣơng bổ sung với hàm lƣợng thích hợp vào môi trƣờng nuôi
cấy để nâng cao hoạt tính cellulase của 2 chủng đã tuyển chọn: ở chủng
Penicillium M6 là 0,7g/100ml, D = 29mm; ở chủng Penicillium M4 là
0,35g/100ml, D = 22,5mm. Ứng dụng bổ sung bột đậu tƣơng vào bã mía nhằm
chuyển hóa nhanh thành mùn hữu cơ và ứng dụng trồng rau sạch, giảm thiểu ô
nhiễm môi trƣờng.

4
Footer Page 13 of 123.


Header Page 14 of 123.

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm và phân loại nấm mốc
Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là
dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm
đảm (Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có
1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm
Ceolomycetes. Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc
tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành
phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223
loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài.
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes)
Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ
thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes
(1953). Lớp nấm bất toàn đƣợc chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes:

Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên
các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). Nhóm
Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở
trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. Nhóm Agonomycetes:
Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây giới thiệu 2 khoá phân
loại đến chi của lớp nấm bất toàn.
1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài)
Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm
sợi nấm (nhƣ các đệm nấm, các bó giá), nhƣng không ở trong các
conidiomata (fruit body) riêng biệt.

5
Footer Page 14 of 123.


Header Page 15 of 123.

Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes

1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ
Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc, đệm giá.

Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes

1.1.1.3. Agonomycetes (mycelia sterilia - nấm bất thụ)
Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo
thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (Chlamydospore) hoặc các tế
bào dày (tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc
trƣng để phân loại (Erick H.C. Mckenzie, 2004; Michael J. Carlie, Sarah C.
Watkinson, Graham, 1994). Năm 1995, Hughes đã đƣa ra khóa phân loại có

tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes.
Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần
(conidiophores) và bào tử trần (conidia). Năm 1968, Baron lại đƣa ra một

6
Footer Page 15 of 123.


Header Page 16 of 123.

khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử
dụng (H.L. Barneet & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của
conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế
bào conidia và các tế bào sinh ra nó... là những đặc điểm quan trọng để phân loại
(Erick H.C. Mckenzie, 2004; E. Kifer & N Morelet, Robert K. Noyd, 2000).
Cuống sinh bào tử trần: Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một
sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các
bào tử trần đƣợc sinh ra. Đôi khi đƣợc dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi
đối với các tế bào sinh bào tử trần.
Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân
nhánh (H1.3c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử
trần (H1.3d), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh
(H1.3e).

Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt

1.1.2. Bào tử trần (conidia)
Có nhiều hình dạng khác nhau: Hình dạng đơn giản. Ví dụ: Cầu, gần
cầu, elip, hình quả thận (H.1.4a). Bào tử sợi, tỷ lệ chiều dài và rộng của bào tử
= 15:1(H1.4b). Bào tử vách lƣới, bào tử đƣợc chia nhỏ ra bởi các vách ngăn

chéo nhau (H1.4c). Bào tử xoắn ốc trục bào tử uốn cong hơn 1800 (H1.4d ).
Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4
chiều dài của bào tử (H1.4e).

7
Footer Page 16 of 123.


Header Page 17 of 123.

Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần

1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium
Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc tổ chi
Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ
Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,
chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cƣ trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.
Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001) [5] chi Penicillium đặc
trƣng bởi các đặc điểm:
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi
màu sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có
màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc
khác nhau, môi trƣờng thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt
các sắc tố hòa tan tƣơng ứng.
Bộ máy mang bào tử trần hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng
thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình
ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình.
Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt
môi trƣờng thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thƣờng có chiều dài đều nhau
và khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate).

Bào tử trần c ng nhƣ giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình,
các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề.

8
Footer Page 17 of 123.


Header Page 18 of 123.

Hình 1.5. Chi Penicillium (các thành phần của chổi)

1.3. Sơ lƣợc về chi Aspergillus
1.3.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới
Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm
1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi
Eurotiumherbariorum đƣợc phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô.
Fries (1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli De Bary (1850) phát hiện
ra rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus
glaucus. Nhƣ vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi
Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Hệ thống phân
loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) gồm 132 loài (đã đƣợc chấp
nhận) và đƣợc xếp vào 18 nhóm loài, đến nay vẫn ổn định và đƣợc sử dụng rộng
rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm
này đã đƣợc công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus.
1.3.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus
Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách, không màu, màu
nhạt, hoặc một số trƣờng hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất
định của khuẩn lạc. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia).
C ng nhƣ các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử
trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trƣng dùng trong phân loại chi nấm này.

9
Footer Page 18 of 123.


Header Page 19 of 123.

Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần: cơ quan sinh bào tử trần phát triển
tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn
các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần.
Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn,
trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá
bào tử phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle). Bọng đỉnh giá có thể có
nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trƣng để phân loại
Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi
Penicillium. Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình
quả bầu, hình bàn chang.
Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình
(phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng
đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình đƣợc sinh ra qua một lớp tế bào gốc
xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lƣỡng
tầng (biseriate). Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá c ng là đặc
điểm đặc trƣng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần g i với
nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách
ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc ở các loài khác nhau.

Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể

10
Footer Page 19 of 123.

Header Page 20 of 123.

1.4. Cellulose và Cellulase
1.4.1. Cellulose
Cellulose là loại polysaccharide cấu trúc của thực vật, chúng tạo nên
thành tế bào, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi.
Cellulose là thành phần chủ yếu trong thân, lá của thực vật (trong gỗ chứa
khoảng 95% cellulose, sợi bông vải 97 - 98%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói
và họ Lúa 30 - 40%)... Trong đó, bã mía chứa trung bình 49% là nƣớc, 48%
là xơ (45-55% cellulose) và 2,5% là chất hoà tan (đƣờng).
Cellulose có màu trắng, không mùi. Cellulose không tan trong nƣớc
(ngay cả khi đun nóng) và các dung môi hữu cơ thông thƣờng nhƣng tan
trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh (HCl, HNO 3) và một số dung dịch
muối (ZnCl2, PbCl2),...
Cellulose là hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo bởi hàng nghìn đến
hàng chục nghìn gốc β-D-Glucose liên kết với nhau bằng các liên kết β-1,4glycoside nên có cấu trúc mạch thẳng, rất bền và khó bị phân hủy. Cellulose
có công thức cấu tạo là (C 6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể
nằm trong khoảng 5000-14000. Trong đó có các nhóm hydroxyl đều nằm trên
mặt phẳng nằm ngang.

Hình 1.7. Cấu trúc lập thể của cellulose

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi có
chiều dài 50 - 100Å. Các micel lại tạo thành bó microfibril với đƣờng kính
khoảng 250Å nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc. Toàn bộ cấu trúc này
đƣợc bao bọc bởi lignin và hemicelluloses.

11

Footer Page 20 of 123.


Header Page 21 of 123.

1.4.2. Cellulase
Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là 1,4-glucoside. Nói
chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các
enzyme cellulase với những tác động đặc trƣng riêng biệt. Dựa theo nghiên
cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy
phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.8).
Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase
Enzyme endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là
enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose
bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự
do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy
phân cellulose tinh thể hiệu quả nhƣng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực
vô định hình tƣơng đối dễ tiếp cận.
Exoglucanase
Enzyme

ngoại

bào

exoglucanase

gồm

cả

1,4-beta-D-glucan

glucanohydrolase, giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4beta-D-glucan cellobiohydrolase, giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân
của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu
chuỗi cellulose.
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử Dglucose từ đƣờng cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác [15].

12
Footer Page 21 of 123.


Header Page 22 of 123.

Hình 1.8. Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase

1.5. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam
Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trƣờng
hàng ngàn tấn phế phẩm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô
nhiễm môi trƣờng. Nếu lƣợng phế phẩm này đƣợc xử lý làm thức ăn gia súc
hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn. Vì vậy, trên Thế giới và ở
Việt Nam đã có những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của các vi sinh
vật trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp.
1.5.1. Trên Thế giới
Từ lâu, trên Thế giới đã có những nghiên cứu về nấm mốc sinh cellulase.
Ngay từ 1963, Birgitta Norkrans đã nghiên cứu về khả năng sinh enzyme
cellulase c ng nhƣ những ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh cellulase của nấm mốc. Kế thừa sự phát triển, những nghiên cứu về sau
của các nhà khoa học không chỉ dừng lại ở mức độ đó mà đã có những định

hƣớng ứng dụng cao hơn. Nghiên cứu của R.N. Maeda tối ƣu hóa nguồn
Nitrogen sản xuất cellulase của Penicillium [21]. Hay Castro, M.L.A.
Carvalho nghiên cứu enzyme cellulase từ Penicillium funiculosum: sản xuất
và các ứng dụng để thủy phân cellulose [17]. Milala M., Shehu (2009), nghiên
cứu xử lý chất thải bằng cellulase từ Aspergillus candidus [18]... Nhìn chung,
có khá nhiều nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose nấm mốc c ng nhƣ

13
Footer Page 22 of 123.


Header Page 23 of 123.

các nhóm vi sinh vật trên nhiều nguồn khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu
đánh giá, phân loại, tối ƣu điều kiện để sản sinh cellulase cao nhất.
1.5.2. Ở Việt Nam
Đến nay, c ng đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm mốc sinh
cellulase, tối ƣu điều kiện môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc và ứng dụng nấm
mốc sinh cellulase trong thực tiễn [3], [8], [9], [16]. Các nghiên cứu gần đây
của Nguyễn Thị Dung (2013), nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm
mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để
thu cellulase phục vụ chăn nuôi. Nghiên cứu của Kiều Ngọc Bích, 2012,
“Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng
nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao”, kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn
đƣợc 25 chủng nấm mốc, trong đó 3 chủng M4V, M251, M151 có hoạt tính
cellulase mạnh nhất. Luận văn thạc sĩ của Khƣu Phƣơng Yến Anh (2007),
“Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân
lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” đã phân lập đƣợc 312 chủng nấm sợi khác
nhau từ RNM Cần Giờ. Trong đó có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng
phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành và tuyển chọn ba chủng có

hoạt độ cellulase cao nhất là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g)
và chủng Đ2b (53,10 IU/g), đồng thời xác định đƣợc điều kiện môi trƣờng
thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi
[1]. Hay nghiên cứu của Trịnh Đình Khá, Nguyễn Quyền Thi, Nguyễn Sỹ Lê
Thanh (2007), “Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi
trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicillium sp.DTQHK1” [7]...
Ngoài ra có nhiều các nghiên cứu khác ở trong và ngoài nƣớc về vấn đề
phân giải và ứng dụng cellulose, phế phẩm giàu cellulose của nấm mốc c ng
nhƣ các loài vi sinh vật [2], [6], [12], [19], [20]. Tuy nhiên chƣa có công trình

14
Footer Page 23 of 123.


Header Page 24 of 123.

nghiên cứu đầy đủ về nấm mốc sinh enzyme cellulase đặc biệt là từ nguồn bã
mía trong quá trình phân giải tạo mùn.
1.6. Định hƣớng ứng dụng
1.6.1. Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose
Thành phần hữu cơ trong rác thải chủ yếu là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu
quả. Có nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi
sinh vật tiết ra nhằm phân giải cellulose trong rác thải. Phức hệ cellulase sử
dụng để xử lý nguồn rác thải thu đƣợc từ vi sinh vật trong đó nấm mốc phân
giải cellulose là một trong những đối tƣợng đã và đang đƣợc các nhà khoa học
quan tâm bởi lƣợng enzyme ngoại bào sinh ra tƣơng đối lớn, có thể ứng dụng
để phân giải nguồn rác thải giàu cellulose nhƣ rác thải sinh hoạt, phế phẩm
nông nghiệp.
1.6.2. Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng

Nấm mốc là nhóm vi sinh vật có khả năng hoạt động tốt trong đất mùn,
khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào tƣơng đối cao, không những giúp
phân giải nhiều hợp chất hữu cơ mà còn giúp cải tạo đất trồng, giúp cây trồng
phát triển nhanh [4], [11].
Phân hữu cơ là hợp chất hữu cơ dùng trong nông nghiệp, đƣợc hình
thành từ các loại phân động vật, lá, cành cây xanh, than bùn, mùn bã ... Phân
bón giúp tăng độ màu mỡ cho đất bằng cách bổ sung các chất hữu cơ, phân ủ
lâu ngày trong tự nhiên có thể sử dụng cho cây trồng, rau xanh.
Do việc lạm dụng quá mức các loại phân bón hóa học và thuốc bảo vệ
thực vật trong sản xuất nông nghiệp, sử dụng các loại phân ủ thiên nhiên ngày
càng ít, đã làm cho diện tích đất trồng trọt bị suy giảm độ phì nhiêu, mất cân
đối dinh dƣỡng, tốn kém. Trong khi đó hầu hết các hộ gia đình nông nghiệp
đều tham gia trồng trọt chăn nuôi, có sẵn nguyên liệu nhƣng chƣa biết cách

15
Footer Page 24 of 123.


Header Page 25 of 123.

tận dụng để làm phân ủ bón cho cây trồng, vừa ô nhiễm môi trƣờng do tiêu
hủy hoặc chất đống, vừa mất thời gian cải tạo đất. Vì vậy, ứng dụng bón phân
hữu cơ có ý nghĩa rất lớn trong nông nghiệp [4]. Với sản lƣợng phế phụ phẩm
bã thải hàng năm thải ra môi trƣờng nếu nhƣ đƣợc tận dụng, xử lý ủ mủn rồi
đem bón cho cây trồng sẽ đem lại nhiều lợi ích đáng kể. Vì vậy hƣớng nghiên
cứu này có ý nghĩa thực tiễn và là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trong sản
xuất phân hữu cơ vi sinh, đồng thời góp phần xử lý nguồn phế thải bã mía,
giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.

16

Footer Page 25 of 123.