Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ duchenne trên người đựa trên phản ứng PCR
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.45 MB, 61 trang )
ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN Hồ CHÍ MINH
BAN CHẤP HÀNH TP. Hồ CHÍ MINH
CÔNG TRÌNH Dự THI
GIẢI THƯỞNG SINH VÉN NGHIÊN cứu KHOA HỌC - EURÉKA
LẦN THỨ 11 NĂM 2009
TÊN CÔNG TRÌNH:
XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG
Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI DựA TRÊN PHẢN ỨNG PCR.
LĨNH Vực NGHIÊN CỨU: Tự NHIÊN
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TÁC GIẢ: Phạm Ngọc Khôi
Jttă iế eồniỊ trình : ..........................................
(^phần nìuị do
í'ĨLp thành ghi)
ĐOÀN INCS HỒ CHÍ MINH
BCH TP. HỒ CHÍ MINH
BAN TỔ CHỨC GIẢI THƯỞNG
SINH VIÊN NCKH - EURÉKA LẦN 11 NĂM 2009
CÔNG TRÌNH NGHIÊN cứu
XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH
LOAN DƯỠNG Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI
DƯA TRÊN PHẢN ỨNG PCR.
Tháng 9 - 2009
MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt ...................................................................................................................... 1
l.
Đặt vấn đề ................................................................................................................. 3
II.
Mục tiêu và phương pháp ......................................................................................... 4
II. 1. Mục tiêu công trình nghiên cứu .................................................................................... 4
II. ...........................................................................................................................
2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 4
n.2.1. Xác định giới tính bằng multiplex pCR ....................................................................... 4
n.2.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu.................................................................................. 4
n.2.1.2. Phương pháp tách chiết DNA.................................................................................... 4
n.2.1.3. Phương pháp multiplex PCR ..................................................................................... 5
n.2.1.4. Đảm bảo chất lượng phản ứng .................................................................................. 6
n.2.1.5. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................................... 7
n.2.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLP A ................................................ 7
n.2.2.1. Bảo quản mẫu ............................................................................................................ 7
n.2.2.2. Phương pháp MLP A................................................................................................. 7
n.2.2.3. Đảm bảo chất lượng phản ứng .................................................................................. 9
n.2.2.4. Điện di MLP A bằng hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 ................................ 9
n.2.2.5. Phương pháp phân tích kết quả ............................................................................... 10
n.2.3. Đe xuất lưu đồ tầm soát trước sinh ............................................................................ 10
III.
m.
Giải quyết vấn đề .................................................................................................... 10
l. Kết quả công trình ..................................................................................................... 10
m.1.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR ..................................................................... 10
in.1.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA .............................................. 14
in.1.3. Đồ xuất lưu đồ tầm soát trước sinh ........................................................................... 24
m.2. Thảo luận ...................................................................................................................... 24
in.2.1. Xác định giới tính bằng multiplex PCR .................................................................... 24
in.2.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLP A ............................................25
in.2.3. Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh ..........................................................................28
IV.
Kết luận và đề nghị ............................................................................................... 30
5.1.
Kết luận................................................................................................................... 30
5.2.
Đe nghị ................................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................32
PHỤ LỤC ...........................................................................................................................35
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 1
Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 ................. 9
Hình 2
Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu ................ 11
Hình 3
Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu ối .................... 13
Hình 4 Kết quả đột biến mất exon bằng ba bộ multiplex A, B và c .................................... 16
Hình 5
Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 - A2 (1) ............................. 20
Hình 6
Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 - A2 (2) ............................. 20
Hình 7
Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 - A2 (1) ............................. 21
Hình 8
Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 - A2 (2) ............................. 21
Hình 9
Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P034 - A2 ......................... 22
Hình 10 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P035 - A2 ............................. 22
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐÒ VÀ Lưu ĐỒ
BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1 Vùng mất đoạn các exon của gen DMD .......................................................... 24
LƯU ĐỒ
Trang
Lưu đồ 4.1 Lưu đồ tư vấn và tầm soát trước sinh bệnh DMD ............................................ 29
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1
Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính ............................. 6
Bảng 2
Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR ............................................. 6
Bảng 3
Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLP A ......................................................... 8
Bảng 4
Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype .............................................. 11
Bảng 5
Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân làm karyotype ................................ 12
Bảng 6
Danh sách thai nhi làm kỹ thuật FISH .............................................................. 13
Bảng 7
Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật
Bảng 8
Danh sách gia đình mắc DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán ..................... 15
Bảng 9
Kích thước của 25 exon được khuếch đại trong 3
bộmultiplex PCR ........ 15
Bảng 10
Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến
đã chẩn đoán .............. 16
Bảng 11
Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 - A2 .............................................. 17
Bảng 12
Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2 .............................................. 18
FISH ..................... 14
Bảng 13 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA) ................................ 23
Bảng 14 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD ................................................ 23
1
TÓM TẮT
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong những
bệnh thần kinh - cơ di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ trai đẻ sống. Bệnh
DMD có bản chất là do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X. Hơn 65% trường
hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất
đoạn gen rất hiệu quả.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột
biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen
DMD.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được dừng
để xác định giới tính và hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là bệnh
DMD/BMD và đã được phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR. Bảy mươi chín
exon của gen được khảo sát bằng kit SALSA® MLPA® P034 - A2 và P035 - A2, điện di mao
quản bằng CEQ™ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker.
Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính và phương pháp
MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến, kỹ thuật phân tích
dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao. Tất cả exon của gen DMD bị mất đều được khẳng
định trên biểu đồ kết quả. Bộ ba multiplex PCR chẩn đoán trước đó chỉ khảo sát được hai mươi
lăm exon và có những exon không được phát hiện so với MLPA.
Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính chính xác, đặc hiệu; và
phương pháp MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và
ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR.
Hiệu quả kinh tế và áp dụng thực tiễn: Hoàn thiện quy trình xác định giới tính trên người
bằng kỹ thuật di truyền phân tử và nhận thấy với kỹ thuật này hiệu quả kinh tế đem lại là rất lớn
so với các kỹ thuật khác hiện đang được áp dụng tại các Phòng Di truyền như nhiễm sắc thể đồ
karyotype, FISH,...và hiện tại quy trình này đã được triển khai nhằm khảo sát gen SRY trên NST
Y ở các bệnh nhân rối loạn giới tính. Bên canh đó, với kỹ thuật MLPA khảo sát 79 exon trên
gen DMD đã bước đầu thành công trong
2
chẩn đoán phân tử và hiện tại đang chuẩn lại quy trình chẩn đoán để sớm được triển khai nhằm
ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh các trường hợp mất đoạn gen cho thai nhi
sẽ dễ dàng hơn và giúp cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước
sinh, cũng là bước chuẩn bị cho việc điều trị bằng liệu pháp gen trong tương lai và giảm được
gánh nặng cho xã hội, nâng cao chất lượng dân số.
3
I.
Đặt vấn đề
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một bệnh di
truyền lặn liên kết với giới tính. Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị
trí Xp21 trên NST X, và đến bây giờ chúng được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người
với chiều dài hơn 2400 kb, mã hóa bản phiên mã mRNA dài 14 kb, bao gồm 79 exon và 99,4%
cấu trúc gen là intron. Protein mã hóa bởi gen này là dystrophin với khối lượng phân tử là 427
kDa, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng cơ. Bệnh DMD là bệnh cơ rất
nặng, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn
đến tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 - 25 do tổn thương cơ tim
và rối loạn hô hấp.
Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500
trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã hội. Cho đến nay
bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất với hai vùng đột biến mất
đoạn trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (vùng exon 3 - 19) và vùng trung tâm
(vùng exon 45 - 52) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ 2 chiếm 25 - 30%,
còn lại là đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 10-15%.
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân tử. Tuy nhiên, do khó khăn trong
việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, những nghiên cứu này mới chỉ xác định đột biến ở
mức DNA. Do chỉ mới sử dụng 19 cặp mồi để khuếch đại 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn
nên kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỷ lệ thường
gặp là 60%. Điều này chứng tỏ rằng khoảng 20% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy
ra đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD được nghiên cứu ở Việt Nam.
Trong khi đó nếu chẩn đoán bệnh DMD bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligationdependent probe amplification) thì có thể khuếch đại được toàn bộ chiều dài gen dystrophin.
Xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA có thể xác định được toàn bộ đột biến mất đoạn và lặp
đoạn trên gen dystrophin ở bệnh nhân DMD. Bên cạnh đó, vì bệnh DMD hầu hết chỉ xảy ra ở
các trẻ trai vì thế nếu xây dựng được quy trình xác định giới tính thì ta có thể sàng lọc được bệnh
ở giai đoạn đầu mà không cần đến việc phải chẩn đoán đột biến về sau.
4
Việt Nam hiện có tần suất bệnh khá cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi nước ta
nguồn lực lại có hạn vì thế không thể nào kham nổi chi phí này. Do đó, chẩn đoán trước sinh là
biện pháp hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội. Vì thế việc thành lập một chương
trình phòng chống bệnh DMD với những kỹ thuật di truyền thích hợp tại Việt Nam là hết sức
cần thiết. Công trình nghiên cứu này nằm trong chương trình phòng chống bệnh DMD như vừa
kể trên và được mang tên là ‘Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne dựa
trên phản ứng PCR”.
II.
Mục tiêu và phương pháp
11.1. Mục tiêu công trình nghiên cứu
Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi.
Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán các loại đột biến gen dystrophin gây nên bệnh
DMD, và so sánh kết quả chẩn đoán bằng MLPA với kết quả chẩn đoán trước đó của Bệnh
viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu. Thiết lập quy
trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh.
11.2. Phương pháp nghiên cứu
11.2.1. Xác định giới tính bằng multiplex PCR
11.2.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu
Đối với mẫu máu: dùng ống tiêm 3ml với kim 20G lấy khoảng 3ml máu tĩnh mạch ở mặt
trước cánh tay bệnh nhân trưởng thành. Mầu máu ngoại vi này được cho vào ống đựng mẫu máu
có sẵn chất chống đông EDTA, sau đó mẫu được trộn nhẹ, để lắng và bảo quản ở 4°c đến khi
tiến hành ly trích DNA.
Đối với mẫu ối: dưới hướng dẫn của đầu dò siêu âm dừng ống tiêm 10ml với kim gây tê
tủy sống 18G đưa qua thành bụng đến buồng ối hút khoảng 10 - 20ml nước ối tùy theo tuổi thai.
Cho lượng nước ối này vào ống chứa mẫu 15ml đáy nhọn vô trùng, để lắng và bảo quản ở điều
kiện 4°c đến khi tiến hành ly trích DNA.
11.2.1.2. Phương pháp tách chiết DNA
Nguyên tắc: Mau được ly trích DNA bằng bộ ly trích DNA “High Pure PCR Template
Preparation Kit” của Roche sản xuất. Te bào bị phá vỡ, ly giải bằng Binding Buffer và Proteinase
K. Dịch ly giải được lọc qua cột lọc với nồng độ muối cao. Màng gel silica trong cột lọc giữ
DNA lại và cho các chất khác trôi qua. DNA tinh sạch được hòa tan vào dung dịch đệm có nồng
độ muối thấp. Tách chiết DNA bằng cách sử dụng màng gel silica có ưu điểm là đơn giản và
nhanh chóng mà không cần dùng
5
phenol/chloroform. Cách tiến hành tách chiết DNA được đính kèm vào phần phụ lục. n.2.1.3.
Phương pháp multiplex PCR
Nguyên tắc: multiplex PCR là phương pháp PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các
đoạn DNA đích đặc hiệu. Kỹ thuật multiplex PCR được dừng xác định giới tính của thai nhi bởi
vì bệnh DMD hầu như chỉ xảy ra ở nam giới và khi biết rõ giới tính của thai nhi thì có thể áp
dụng các kỹ thuật sinh học khác để phát hiện thai nam này có đột biến mất đoạn gen DMD hay
không. Trong khỏa luận này, sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu cho hai đoạn DNA đích đặc hiệu là:
SRY [cặp mồi SRY - Fil và SRY - R7 để tăng lượng vùng gen SRY (sex determining
region Y gene) kích thước 93 bp có gen TDF biệt hóa tinh hoàn (testis determining factor)]. Gen
SRY đóng vai trò chủ đạo cho việc xác định giới tính ở người. Nhân tố này điều khiển sự biệt
ho á tuyến sinh dục của phôi thành tinh hoàn mà không phải buồng trứng. Sau đó, tinh hoàn sản
xuất các hormone sinh dục đực chịu trách nhiệm cho sự thể hiện các đặc tính thứ cấp của nam
giới.
ATSEA (để tăng lượng một đoạn DNA kích thước 317 bp trên NST số 16 có ở cả người
nam và người nữ) được sử dụng như là một chứng nội tại cho phản ứng multiplex PCR này.
Phương pháp multiplex PCR thiết lập cùng lúc hai phản ứng PCR đối với một mẫu DNA,
một phản ứng PCR với mồi SRY và một phản ứng PCR với mồi ATSEA. Sau phản ứng khuếch
đại, nếu sản phẩm xuất hiện ở cả băng SRY (93 bp) và ATSEA (317 bp) thì mẫu DNA này được
xác định là nam giới, trong khi đó nếu sản phẩm chỉ xuất hiện ở băng ATSEA (317 bp) thì được
xác định là nữ giới.
Thành phần của phản ứng multiplex PCR dừng để xác định giới tính được trình bày trong
bảng 1.
6
Bảng 1 Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính
Nồng độ
PCR Mix
Thể tích (pl)
H20
13,95
10X Buffer 1
MgCl2
25mM
2,5
1
2,5 mM mỗi loại nucleotide
20 pmoles/pl
2
0,3
Mồi 2 ATSEA2
20 pmoles/pl
0,3
Mồi 3 SRY-F11
20 pmoles/pl
0,5
Mồi 4 [D3]-SRY-R7
20 pmoles/pl
0,5
DMSO
Fast Start Taq
5U/pl
1,25
0,2
DNA
20 ng
2,5
dNTP’s
Mồi 1 [D3]-ATSEA1
Tống thê tích (pl)
25
Chu trình luân nhiệt (Máy Bio - Rad iCycler) cho phản ứng multiplex PCR xác định giới
tính được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR
Bước
Nhiệt độ
1
95°c
95°c
58°c
72°c
12
72°c
22°c
10
2
3
4
Thòi gian
phút
số chu kỳ
1
30 giây
45 giây
40
phút
1
phút
QO
1
II.2.1.4. Đảm bảo chất lượng phản ứng
Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của DNA ở bước sóng 260/280 nm trước khi thiết
lập PCR Mix.
7
PCR luôn kèm theo chứng nam, chứng nữ và chứng không có DNA (chứng Nil) cùng với
các mẫu cần xác định giới tính.
Nếu có một chứng không có tín hiệu hay tín hiệu không rõ phải thực hiện lại phản ứng
PCR.
Nếu sản phẩm PCR điện di trên gel không rõ và đặc hiệu, xem lại nồng độ DNA trước
phản ứng.
II.2.1.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Điện di trên gel agarose dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là
các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường,
chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Sự phát hiện được quan sát dưới đèn uv nhờ
sự phát màu của ethidium bromide gắn xen trong DNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003). Cách
tiến hành điện di trên gel agarose được đính kèm vào phần phụ lục.
II.2.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA
11.2.2.1. Bảo quản mẫu DNA
Mau DNA của bệnh nhân nghi là mắc bệnh DMD được chẩn đoán trước đó bằng bộ ba
multiplex PCR A, B và c của Bệnh viện Nhi Trung ương và Đại học Y Hà Nội được bảo quản
ở điều kiện 4°c.
11.2.2.2. Phương pháp MLPA
Nguyên tắc: MLPA chỉ sử dụng duy nhất một cặp PCR primer cho quá trình khuếch đại
với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị trí DNA đích khác nhau trong cùng một phản ứng.
Mỗi probe MLPA gồm hai đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với
nhau, dài 22 - 43 nucleotide với một PCR primer xuôi và ngược giống nhau ở tất cả các probe.
Đe phân biệt các sản phẩm khuếch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn
không tham gia vào quá trình lai có kích thước thay đổi từ 19 nt đến 364 nt. Sau khi lai qua đêm
với trình tự DNA đích, hai đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau.
Sản phẩm nối có cả primer xuôi và ngược, và được khuếch đại bằng phương pháp PCR. số lượng
tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ với số bản sao của trình tự đích trong các mẫu khảo
sát.
Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ được nhận biết bằng hệ thống giải trình mao
quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được định lượng. Các đoạn dò
8
nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang một primer vì thế sẽ không được khuếch đại
sản phẩm PCR.
Bộ kit SALSA® MLPA® do MRC - Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80
đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c. Trong đó 80 đoạn dò được chia đều vào hai hỗn hợp
Probemix P034 - A2 và P035 - A2. Ngoài ra, mỗi kit còn chứa thêm 5 đoạn dò kiểm chứng.
Cách tiến hành phương pháp MLPA được đính kèm vào phụ lục 9.
Chu trình luân nhiệt (Máy Bio - Rad iCycler) dùng cho phản ứng MLPA được trình bày
trong bảng 3.
Bảng 3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLPA
Bước
Nhiệt độ
Thời gian
số chu kỳ
1. Phản ứng lai
1.1
1.2
1.3
1.4
98°c
25°c
5 phút
95°c
60 °c
1 phút
54°c
54°c
98°c
4°c
00
00
1
00
2. Phản ứng nôi
2.1
2.2
2.3
2.4
15 phút
1
5 phút
00
3. Phản ứng PCR
3.1
60°c
00
1
3.2
3.3
30 giây
30 giây
35
3.4
95°c
60°c
72°c
3.5
72°c
20 phút
3.6
4°c
00
1 phút
1
9
n.2.2.3. Đảm bảo chất lượng phản ứng
Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của DNA ở bước sóng 260/280 nm trước khi thiết
lập phản ứng MLPA.
MLPA luôn kèm theo chứng nam, chứng nữ với các mẫu chẩn đoán nghi là mắc bệnh
DMD.
Nếu có một chứng không có tín hiệu hay tín hiệu không rõ phải thực hiện lại phản ứng
MLPA.
Nếu sản phẩm MLPA không rõ, xem lại nồng độ DNA trước phản ứng. n.2.2.4. Điện di
phân tách đoạn MLPA bằng hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000
Nguyên tắc: Quá trình điện di diễn ra trong 1 mao quản có đưởng kính rất nhỏ khoảng
75 pm. Khi có điện thế, trong mao quản sẽ xuất hiện điện trường, lúc này dung dịch đệm sẽ chạy
liên tục trong mao quản từ cực (+) sang cực (-) và các phân tử tích điện chẳng hạn như nucleic
acid sẽ di chuyển dưới ảnh hưởng của điện trường. Các phân tử nucleic acid tích điện âm nên sẽ
di chuyển về cực (+) trong điện trường. Các mẫu được phân tách nhờ sự khác nhau về khối
lượng và điện tích. Sợi có kích thước ngắn sẽ di chuyển nhanh hơn sợi cố kích thước dài. Hệ
thống điện dỉ mao quản sử dụng huỳnh quang để phát hiện các sợi DNA có kích thước dài ngắn
khác nhau (hình 1). Cách tiến hành điện di phân tách đoạn MLPA bằng hệ thống điện di mao
quản CEQ™ 8000 được đính kèm vào phần phụ lục.
Hình 1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản
CEQ™ 8000 (Nguồn: Thái Hạnh Quyên, 2009).
10
ưu điểm của phương pháp điện di mao quản so với điện di thường trên gel là: lượng mẫu
phân tách nhỏ; độ chính xác cao; khả năng lập lại lớn; thời gian điện di và phân tích dữ liệu
nhanh; hệ thống hoạt động tự động hoàn toàn từ bước bơm gel đến phân tích kết quả.
IL2.2.5. Phương pháp phân tích kết quả
Kích thước của mỗi peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và so sánh với
mẫu chứng. Sau điện di, kết quả được xuất dưới dạng file .esd, rồi được phân tích tự động tìm
đột biến bằng phần mem Gene Marker AFLP/Genotyping version
l. 85 của SoftGenetics® LLC (Software Power Tools for Genetic Analysis).
Ket quả phân tích được biểu thị dưới dạng biểu đồ sóng (electropherogram) và dưới dạng
bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam (một nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu
xuất hiện.
II.2.3. Đề xuất lưu đầ tầm soát trước sinh
Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh bằng cách đề xuất lưu đồ tư vấn và
tầm soát dựa vào các kết quả của nội dung xác định giới tính bằng multiplex PCR và nội dung
chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA. in. Giải quyết vấn đề
m.
l. Kết quả công trình
m.l.l. Xác định giới tính bằng multiplex PCR
Thực hiện phản ứng multiplex PCR để khảo sát gen SRY trên NST Y trên hai đối tượng
khác nhau.
Trường hợp 1: 10 mẫu máu của 10 bệnh nhân trưởng thành đã xác định bộ NST đồ
karyotype với các ký hiệu được trình bày trong bảng 4.
Để đảm bảo chất lượng cho phản ứng multiplex PCR, chứng tôi đã thực hiện kèm theo
một chứng nam, một chứng nữ và một chứng không chứa DNA (chứng Nil).
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel (hình 2) gồm:
CNAM : Chứng nam
MK: Marker 100 bp (Promega)
CNU : Chứng nữ
NIL: Chứng không chứa DNA
11
Bảng 4 Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype
STT
Ký hiệu
Kỉếu hình
1
271
Nam
2
333
Nữ
3
333H
Nam
4
334
Nữ
5
334H
Nam
6
335
Nữ
7
336
Nữ
8
336H
Nam
9
337
Nam
10
338
Nam
317 bp
93 bp
Hình 2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu.
12
Bảng 5 Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân có bộ NST đồ karyotype
Ký hiệu
Kiếu hình
Gen SRY (Băng 93 bp)
Kết luận
Nam
Có
Nam
CNU
Nữ
Không
Nữ
271
Nam
Có
Nam
333
Nữ
Không
Nữ
333H
Nam
Có
Nam
334
Nữ
Không
Nữ
MK
-
-
-
334H
Nam
Có
Nam
335
Nữ
Không
Nữ
336
Nữ
Không
Nữ
336H
Nam
Có
Nam
337
Nam
Có
Nam
338
Nam
Có
Nam
NIL
-
-
-
CNAM
Ket quả khảo sát gen SRY phù hợp với kiểu giới tính của 10 bệnh nhân trên. Bên cạnh
đó, kết quả này được kiểm chứng qua phân tích karyotype cũng trên 10 bệnh nhân này. Kết quả
đối chiếu hoàn toàn phù hợp với kết quả khảo sát gen SRY trên NST Y. Hai trong 10 kết quả
karyotype được đính kèm vào phần phụ lục.
Trường hợp 2: 10 mẫu nước ối của 10 thai nhi đã tiến hành kỹ thuật FISH với các ký hiệu
được trình bày trong bảng 6.
Để đảm bảo chất lượng cho phản ứng multiplex PCR, chứng tôi vẫn thực hiện kèm theo
một chứng nam, một chứng nữ và một chứng không chứa DNA (chứng Nil).
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel (hình 3) gồm:
CNAM : Chứng nam
MK: Marker 100 bp (Promega)
CNU : Chứng nữ
NIL: Chứng không chứa DNA
13
Bảng 6 Danh sách thai nhỉ
STT
Ký hiệu
1
315
2
3
395
4
792
5
793
6
7
893
8
9
924
10
934
663
910
930
317 bp *
93 bp *
Hình 3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu ối.
14
Bảng 7 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH
Ký hiệu
Gen SRY (Băng 93 bp)
Kết luận
CNAM
Có
Nam
CNU
Không
Nữ
315
Có
Nam
395
Không
Nữ
663
Có
Nam
792
793
Không
Không
Nữ
Nữ
MK
-
-
893
Có
Nam
910
Không
Nữ
924
Có
Nam
930
Có
Nam
934
Có
Nam
NIL
-
-
Kết quả khảo sát gen SRY phù hợp với kiểu giới tính của 10 thai nhi trên. Bên cạnh đó,
kết quả này được kiểm chứng so với phân tích FISH cũng trên cùng 10 thai nhi này. Kết quả đối
chiếu cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả khảo sát gen SRY trên NST Y. Hai trong 10 kết quả
FISH cũng được đính kèm vào phần phụ lục.
III.1.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA
Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng phương pháp MLPA với hai đối tượng khác
nhau:
Trường hợp 1: hai mẫu DNA của một gia đình có người mắc bệnh DMD là chị Nguyễn
Thị Tuyết s. (29B) và con trai chị mắc bệnh DMD là cháu Nguyễn Viết H. (29C) đã được Đại
học Y Hà Nội kết hợp chẩn đoán trước đó với Phòng Di truyền - Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM
bằng bộ 3 multiplex PCR vào năm 2007 với kết quả được trình bày trong bảng 7.
15
Bảng 8 Danh sách gia đình mắc bệnh DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán
Ký hiệu
c (ng/pl)
29C
Kết quả chẩn đoán
^260/280
Mất exon 50, 51, 52
1,94
80,1
c là nồng độ nucleỉc acid trong mâu sau khỉ ly trích; Ả260/280 là tỉ số OD260nm/OD280nm nhằm
kiểm tra độ sạch của dung dịch sau ly trích. Một dung dịch nucleỉc acid được xem là sạch (không
tạp nhiễm protein) khi tỉ so Ả260/280 nằm trong khoảng 1,8 —2 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)
(Nguồn: Nguyễn Thị Trang và cộng sự, 2007).
Trường hợp 2: mười tám mẫu DNA của mười tám bệnh nhân nghi là mắc bệnh DMD đã
được chẩn đoán trước đó bằng kỹ thuật multiplex PCR dựa trên 25 exon khác nhau do Khoa Di
truyền và Sinh học phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương gửi đến Phòng Di truyền - Bệnh viện
Từ Dũ TP.HCM vào năm 2008 với kết quả được trình bày trong hình 5, bảng 8 và bảng 9.
Bảng 9 Kích thước (bp) của 25 exon được khuếch đại trong ba bộ multiplex PCR
Multiplex A
Exon
Kích thước
45
547
48
Multiplex B
Exon
Kích thước
Mutiplex c
Exon
Kích thước
535
49
439
506
Pm
m
3
410
Pb
332
19
459
43
357
16
290
17
416
50
271
41
270
51
388
13
238
32
253
8
360
202
42
195
12
44
331
6
47
34
171
268
60
181
139
4
196
52
113
A
Pm là vùng promotervà pb là vùng braỉn promoter
-
-
16
ft multiple* A multiplex B multiplex c Ẽ wt m 29 30 31 m
29 30 31 m 29 30 31
600 bp ---- ►
100
bp
------------►
Hình 4 Kết quả phát hiện đột biến mất exon trên gen DMD bằng 3 bộ multiplex A, B và c với
thang 100 bp. wt (wild type): Chửng bình thường; m: Chứng nam đột biến; 29: Mẩu 8029 bị
mất cảc exon 3, 4, 6, 8, 12, 13; 30: Mẩu 8030 bị mất các exon 47, 48, 49, 50, 51, 52; 31: Mẩu
8031 bị mất các exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 (Nguồn: Ngô Diễm Ngọc và cộng sự,
2008).
Bảng 10 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán
STT
Ký hiệu
(1)
Kết quả chần đoán
(2)
c (ng/Hl)
(3)
^260/28
0
(4)
1
5020
28,7
1,72
Mất exon 45,47,48,49,50,52
2
5060
38,7
1,90
Mất exon 3, 4,6, 8, 12,13,17,19
3
4
6046
6058
133,3
35,0
1,87
1,65
Không đột biến
Mất exon 48,49, 50
5
6
7003
7005
60,3
56,2
1,87
1,87
Không đột biến
Không độtbỉến
7
7009
30,6
2,08
Mất exon 32,34,41,42,43
8
7025
60,7
1,84
Mất exon 3, 4,6
9
10
7047
8017
9,6
42,3
2,36
1,96
Mất exon 3, 4,6, 8, 12,13,16,17
Không đột biến
11
12
8021
8024
57,6
1,93
Không đột biến
57,3
1,91
Mất exon 8, 12
13
8026
36,6
2,44
Mất exon 3, 4,6
14
8027
57,2
2,00
Không đột biến
15
8028
37,1
1,94
Không đột biến
16
8029
32,9
1,96
(5)
Mất exon 3, 4,6, 8,12,13
17
Bảng 10 (tt) Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
17
8030
51,4
1,96
Mất exon 47, 48, 49, 50,51, 52
18
8031
36,2
1,95
Mất exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34
Bằng phương pháp MLPA, 79 exon trên gen DMD được khảo sát bằng kit SALSA®
MLPA® P034 - A2 và P035 - A2, điện di mao quản bằng hệ thống CEQ™ 8000 và phân tích
tự động bằng phần mềm Gene Marker, chúng tôi đã xác định được các đột biến mất exon trên
gen DMD của 20 mẫu DNA nói trên và được trình bày trong hai bảng 10 và 11.
Bảng 11 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 - A2
STT
Bộ 3 multiplex PCR (chia
Ký hiệu (2)
(1)
theo P034 - A2)
Probe P034 - A2 MLPA
(4)
(3)
Không đột biến
Không đột biến
1
29B
2
3
29C
Mất exon 50
Mất exon 50
5020
Mất exon 45, 47, 48, 49, 50
Mất exon 45, 46, 47, 48, 49, 50
4
5060
Mất exon 3, 4, 6, 8
Không đột biến
Mất exon 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 21,
22,23,24,25,26,27,28,29
Không đột biến
5
6046
6
7
6058
7003
Không đột biến
Không đột biến
8
9
7005
Không đột biến
Không đột biến
7009
Mất exon 41,42, 43
Mất exon 41,42, 43
10
7025
Mất exon 3, 4, 6
Mất exon 3, 4, 5, 6, 7
11
7047
Mất exon 3, 4, 6, 8
Mất exon 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
12
13
8017
Mất exon 48, 49, 50
Không đột biến
Không đột biến
Mất exon 48, 49, 50
Không đột biến
Không đột biến
14
8021
8024
Mất exon 8
Mất exon 8, 9, 10
15
8026
Mất exon 3, 4, 6
Mất exon 3, 4, 5, 6, 7
18
Bảng 11 (tt) Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 - A2
(1)
(2)
(3)
(4)
16
17
8027
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
18
19
8028
8029
Mất exon 3, 4, 6, 8
Mất exon 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
8030
Mất exon 47, 48, 49, 50
Mất exon 46, 47, 48, 49, 50
8031
Mất exon 3, 4, 6, 8
20
Mất exon 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30
21
22
Chứng nam
Chứng nữ
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
Bảng 12 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2
STT
Ký hiệu
Bộ 3 multiplex PCR
Probe P035 - A2
(chia theo P035 - A2)
MLPA
(4)
(1)
(2)
(3)
1
29B
Không đột biến
2
3
29C
Mất exon 51, 52
5020
Mất exon 52
4
5060
Mất exon 12, 13, 17, 19
5
6046
Không đột biến
17, 18, 19,20
Không đột biến
6
7
6058
Không đột biến
Không đột biến
7003
Không đột biến
Không đột biến
8
9
7005
7009
Không đột biến
Mất exon 32, 34
10
7025
Không đột biến
Không đột biến
Mất exon 51, 52, 53, 54
Mất exon 51, 52
Mất exon 11, 12, 13, 14, 15, 16,
Không đột biến
Mất exon 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37,38,39,40
Không đột biến
15,
Mất exon 12, 13, 16, 17
11
7047
12
8017
Không đột biến
Không đột biến
13
8021
Không đột biến
Không đột biến
Mất exon 11, 12, 13, 14, 17
16,
19
Bảng 12 (tt) Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2
(1)
(2)
14
8024
15
8026
8027
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
Không đột biến
8028
Không đột biến
Không đột biến
16
17
18
19
8029
8030
20
8031
(3)
Mất exon 12
Mất exon 12, 13
Mất exon 51, 52
22
Chứng nam
Chứng nữ
Mất exon 11,12
Mất exon 11, 12, 13
Mất exon 51, 52
Mất exon 12, 13, 16, 17, Mất exon 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19,32,34
21
(4)
Không đột biến
Không đột biến
19,20,31,32,33,34
Không đột biến
Không đột biến
Với phương pháp MLPA, đã xác định được 12 bệnh nhân trên tổng số 20 mẫu bệnh phẩm
phân tích (chiếm 60%) có đột biến mất đoạn trên 79 exon của gen DMD. Các băng đặc hiệu
cho exon khảo sát đều rõ; số lượng exon bị đột biến mất đoạn cũng rất thay đổi, ít nhất là 3 exon
và nhiều nhất 32 exon. Kết quả phát hiện đột biến mất đoạn gen được trình bày trong hình 4.4,
4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9; bảng 12 và phần phụ lục.
