NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG

Header Page 1 of 148.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC TIẾN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM
α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE
VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC TIẾN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM
α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE
VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA
2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ

Hà Nội - 2015

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các Thầy Cô, bạn đồng nghiệp và
các Cơ quan.
Trước hết cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Giáo Sư Tiến Sĩ
Hoàng Đình Hòa, Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Quản Lê Hà, là những người đã hướng dẫn,
chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau
thu hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội đã cấp kinh phí cho tôi,
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các Thầy cô của Viện Công Nghệ Sinh Học
Thực Phẩm - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
làm luận án.
Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp đã cùng tôi làm việc và động viên giúp đỡ

tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo Sư, Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ là chủ tịch hội
đồng, phản biện và Ủy viên hội đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc và
tham gia hội đồng chấm luận án này với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích,
giúp tôi hoàn tất tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời biết ơn đến bố mẹ, gia đình và người thân của tôi
với tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đường để
hoàn thành được luận án nghiên cứu này.
Tác giả luận án

NGUYỄN ĐỨC TIẾN

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2015
Tập thể giáo viên hướng dẫn

1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA

2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ

Footer Page 4 of 148.

Tác giả luận án

NGUYỄN ĐỨC TIẾN


Header Page 5 of 148.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1
2. Nội dung .............................................................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án ............................... 4
5. Bố cục luận án ..................................................................................................................... 5
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 6
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ............................................................................................. 6
1.1.1. Khái niệm ĐTĐ ............................................................................................................. 6
1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ ................................................................................... 7
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể......... 8
1.2.1. Enzyme α-glucosidase ................................................................................................... 8
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme....................................................................................................... 8
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase ......................................................................... 8
1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ.................................................... 9
1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) .............................. 11
1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp .................................................................................................. 12
1.3.2. AGIs từ động vật ......................................................................................................... 12
1.3.3. AGIs từ thực vật .......................................................................................................... 12
1.3.4. AGIs từ vi sinh vật....................................................................................................... 14
1.3.5. AGIs từ A.oryzae ......................................................................................................... 15

1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ........................................................ 16
1.4.1. Đỗ đen ......................................................................................................................... 16
1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ............................................................................ 17
1.5. A.oryzae và lên men bề mặt ............................................................................................ 19

Footer Page 5 of 148.


Header Page 6 of 148.
1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae ....................................................................................... 19
1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng
A.oryzae ................................................................................................................................. 21
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon .................................................................................. 22
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................................... 23
1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng .............................................................. 23
1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng
A.oryzae ................................................................................................................................. 24
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................. 24
1.5.3.2. Độ ẩm môi trường .................................................................................................... 24
1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí ......................................................................................... 25
1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường ..................................................................... 25
1.5.3.5. Tỷ lệ giống ................................................................................................................ 26
1.5.3.6. Thời gian lên men ..................................................................................................... 27
1.6. Thu nhận AGIs ............................................................................................................... 27
1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men ............................................... 27
1.6.2. Tinh sạch AGIs ............................................................................................................ 29
1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất ........................................................................ 30
1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới ................ 35
1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam ................................................................... 39
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 41

2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 41
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu ................................................................................. 41
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................... 41
2.1.3. Môi trường ................................................................................................................... 42
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống ............................................................. 42
2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus ......................................................... 42

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.
2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn ................................................................................. 42
2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống ........................................................................ 42
2.1.3.5. Đỗ đen lên men ......................................................................................................... 43
2.1.4. Thiết bị......................................................................................................................... 43
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................................ 43
2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 43
2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................ 43
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc ................................................................................... 44
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc ........................................................... 44
2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................. 44
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo
phương pháp của Yamaki và Mori (2006)............................................................................. 44
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi ...... 45
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và
cộng sự, (1999) ...................................................................................................................... 45
2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50) ......................................................... 45
2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm
thực phẩm .............................................................................................................................. 46
2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan ................................................................................ 46

2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật ........... 47
2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm .............................................. 47
2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... 47
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................................... 48
2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .................................. 49
2.3.2.1. Phân lập A.oryzae..................................................................................................... 49
2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................ 50

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.
2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1
- 5,8S - ITS2 ........................................................................................................................... 50
2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân
giống trên môi trường rắn ...................................................................................................... 52
2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52
2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52
2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52
2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52
2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ................... 52
2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 53
2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6.................. 53
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .............. 53

2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 53
2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến
khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6........................................................................ 53
2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường
lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................... 53
2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54
2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 54
2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54

Footer Page 8 of 148.


Header Page 9 of 148.
2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54
2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae
T6 ........................................................................................................................................... 55
2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A.oryzae T6................................ 55
2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm ................................. 55
2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ............ 55
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men ........................................................................................................................................ 55
2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết
xuất AGIs ............................................................................................................................... 56
2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men: ....................................................................................................................................... 56

2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................................................................... 56
2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ....................................................... 56
2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs........................................................... 56
2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs................................................ 57
2.3.6.3. Thu nhận AGIs .......................................................................................................... 57
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC ............................................................................. 57
2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ........ 57
2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC ............................................................. 58
2.3.7. Ứng dụng AGIs ........................................................................................................... 58
2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ...... 59
2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm
AGIs ....................................................................................................................................... 59
2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs ........................... 60
Với A: là T3;.......................................................................................................................... 61

Footer Page 9 of 148.


Header Page 10 of 148.
2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng
A.oryzae T6............................................................................................................................ 62
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 63
3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ..................................... 63
3.1.1. Phân lập Aspergillus oryzae ........................................................................................ 63
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................... 64
3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S
- ITS2 ..................................................................................................................................... 66
3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên
môi trường rắn ....................................................................................................................... 68

3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 ........................................................................................................................................... 68
3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 70
3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 71
3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 ........................................................................................................................................... 72
3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ...................... 73
3.2.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae
T6 ........................................................................................................................................... 74
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ..................... 76
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................. 77
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 77
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến
khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................ 79
3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên
men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ......................................................... 80

Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.
3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 82
3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 ......................................................................................................... 83
3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 84

3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 86
3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae
T6 ........................................................................................................................................... 87
3.3.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 88
3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6 (đỗ đen lên men)
bằng sử dụng sóng siêu âm .................................................................................................... 90
3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men .............. 90
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ... 91
3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất
AGIs ...................................................................................................................................... 93
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ................ 95
3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................................................................... 97
3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ........................................................ 103
3.5.1 Khảo sát dung môi để tinh sạch sơ bộ AGIs .............................................................. 103
3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs ................................................... 104
3.5.3. Tinh sạch AGIs .......................................................................................................... 105
3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên
men bằng khối phổ .............................................................................................................. 108
3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 ............................. 109

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.
3.6. Ứng dụng AGIs ............................................................................................................ 110
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ........ 110
3.6.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs 111

3.6.7. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử nghiệm bột uống liền
AGIs cho người bệnh ĐTĐ ................................................................................................. 115
3.6.7.1. Xác định hàm lượng chế phẩm AGIs cho bột uống liền ......................................... 115
3.6.7.2. Xác định cơ chất phù hợp phối chế với chế phẩm AGIs cho công thức tạo sản
phẩm bột uống liền. ............................................................................................................. 115
3.6.7.3. Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền .................................................... 117
Chương 4: ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AGIs
TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN BẰNG A.ORYZAE T6 ..................... 119
Chương 5: KẾT LUẬN ....................................................................................................... 122
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO.................................................... 123
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............................... 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 125
PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 141

Footer Page 12 of 148.


Header Page 13 of 148.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Từ viết tắt
AGIs

alpha-Glucosidase inhibitor (chất kìm hãm α-glucosidaza ) ( chất kìm
hãm α-glucosidase) (chất ức chế α-glucosidase)

A.oryzae

Aspergillus oryzae

Bp

Base pair

CFU

Colony forming unit

ĐTĐ

Đái tháo đường

đỗ đen lên đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6
men
Da

Dalton

DNJ

1 – deoxynojirimycin

PCR

polymerase chain reaction

GABA

Gamma-Aminobutyric acid

GLP

Glucagon peptide

GLP-1

peptide-1 dạng glucagon

GLP-2

peptide-2 dạng glucagon

HDL

High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

IC50

Nồng độ kìm hãm 50% (Haft maximal inhibitory concentration)

ITS

Inter-Transcribed Spacer

KDa

Kilodalton

LC-MS/MS Sắc ký lỏng – song song khối phổ (Liquid Chromatography-tandem
Mass Spectrometry)
TE

10M Tris, - pH 8,0 - HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid

TPCN

Thực phẩm chức năng

WHO

World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới

p NPG

p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside

RP - HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (Reverse phase-high performance
liquid chromatography)

Footer Page 13 of 148.

Header Page 14 of 148.

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm α-glucosidase thu nhận từ vi sinh vật ............................... 15
Bảng 1.2 Một số sản phẩ m đâ ̣u tương lên men bề mặt và tác nhân vi sinh vâ ̣t .................. 18
Bảng 1.3 Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế
bào nấm mốc Aspergillus spp ............................................................................. 22
Bảng 1.4 Các ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực phẩm ......... 33
Bảng 2.1 Hàm lượng một số chất khoáng trong môi trường lên men ................................ 53
Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền ............................ 60
Bảng 2.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams tương
ứng với 5 mẫu khảo sát ....................................................................................... 61
Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus spp từ các nguồn khác nhau ................................. 63
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST ................ 67
Bảng 3.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng
siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm ........................................................... 102
Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau các bước tinh sạch AGIs từ đỗ đen lên men................ 109
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan, hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase và thời gian cô đến chất lượng chế phẩm AGIs... 110
Bảng 3.6 Kết quả phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng và các chỉ
tiêu lý hóa của chế phẩm AGIs ......................................................................... 111
Bảng 3.7 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, kim loại nặng và các chất không
mong muốn trong sản phẩm chế phẩm AGIs. ................................................... 113
Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính cấp của chế phẩm AGIs .................................................... 114
Bảng 3.9 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu của sản phẩm bột uống
liền ..................................................................................................................... 117

Footer Page 14 of 148.

Header Page 15 of 148.

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Mô phỏng tiêu hóa Carbohydrate (tinh bột và đường sucrose) trong cơ thể ...... 10

Hình 1.2

Cấu trúc bộ gen của A.oryzae .............................................................................. 21

Hình 1.3

Quá trình hình thành, phát triển và vỡ tung của bọt khí ...................................... 31

Hình 2.1

Thang thị hiếu chín điểm ..................................................................................... 46

Hình 2.2

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................. 48

Hình 3.1

Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của một số A.oryzae phân lập được .............. 65

Hình 3.2

Sản phẩm PCR của chủng T6 .............................................................................. 66

Hình 3.3

Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6 ......................................................................................................... 69

Hình 3.4

Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến mật độ tế bào
của A.oryzae T6.................................................................................................... 70

Hình 3.5

Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6 .......................................................................................................... 72

Hình 3.6

Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6 ......................................................................................................... 73

Hình 3.7

Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ........... 74

Hình 3.8

Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6 ......................................................................................................... 75

Hình 3.9

Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 ......... 76

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α – glucosidase và mật độ tế bào của A.oryzae T6 ............... 78
Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men
bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase .................................... 80
Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi
trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ........... 81
Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................................ 82
Hình 3.14 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ........................................................................ 84
Footer Page 15 of 148.


Header Page 16 of 148.
Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối khối môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α - glucosidase ...................................................................... 85
Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt
tính kìm hãm α - glucosidase .............................................................................. 86
Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase ....................................................................................................... 88
Hình 3.18 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase trong quá trình lên men bề mặt trên môi
trường rắn bằng A.oryzae T6............................................................................... 89
Hình 3.19 Ảnh hưởng của dung môi chiết xuất đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
(%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ......................................................... 90
Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hoạt tính kìm hãm αglucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ...................................... 92
Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến hoạt tính kìm

hãm α-glucosidase (%) của dịch chiết đỗ đen lên men ....................................... 93
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50
của dịch chiết đỗ đen lên men ............................................................................. 96
Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men .................................. 98
Hình 3.24 So sánh giá trị IC50 của AGIs thu được ở phần kết tủa và phần tan khi sử
dụng methanol, ethanol và isopropyl alcohol ................................................... 103
Hình 3.25 So sánh giá trị IC50 của chất khô ở phần tủa và phần tan khi sử dụng các nồng
độ ethanol khác nhau để làm sạch chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên men . 104
Hình 3.26 Sắc ký đồ có píc của AGIs (a). Hình dạng píc của AGIs (b) ............................ 106
Hình 3.27 Sắc ký đồ môi trường đỗ đen xanh lòng trước khi lên men (a). Sắc ký đồ
dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (b). Sắc ký đồ AGIs sau khi tinh sạch
(c) ...................................................................................................................... 107
Hình 3.28 Khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên
men được thực hiện bằng khối phổ. R.YIYEIAR.R ......................................... 108
Hình 4.1

Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men .......... 119

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển với những thành tựu lớn của khoa học công nghệ và sự
nghiệp Công nghiệp hóa – Hiện đại hóa. Bên cạnh những thành tựu đạt được là hậu quả

ảnh hưởng tới môi trường sống của nhân loại mà con người là đối tượng trực tiếp gánh
chịu hậu quả đó. Môi trường ô nhiễm kéo theo sự ảnh hưởng không nhỏ tới lương thực
thực phẩm dẫn tới những căn bệnh hiểm nghèo trong số đó phải kể đến bệnh đái tháo
đường (ĐTĐ).
Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF, trong một thập kỉ trở lại đây,
bệnh ĐTĐ có xu hướng phát triển nhanh chóng. Ước tính năm 2010, thế giới có khoảng
221 triệu người mắc bệnh ĐTĐ và dự báo đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (chiếm
khoảng 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ ở các nước phát triển khoảng
42%, tỷ lệ này tăng lên 170% ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) [1]. Theo Tổ
chức Y tế thế giới WHO (World Health Organization), trong vòng 20 năm tới chỉ tính
riêng châu Á, bệnh ĐTĐ bùng phát với khoảng 330 triệu người mắc bệnh sẽ nguy hiểm
hơn AIDS hay cúm gà. Ở châu Âu, năm 2005 có khoảng 19 triệu người mắc tương đương
với 4% dân số và con số này được dự báo tăng lệ 26 triệu vào năm 2030 [160].
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã trở thành căn bệnh phổ biến
không chỉ ở các nước phát triển mà còn ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sống
của người dân và thói quen ăn uống. Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được sử
dụng để ngừa bệnh ĐTĐ loại II [53]. Với cơ chế tác dụng là AGIs kết hợp với αglucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucose
đường huyết sau ăn [85]. AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:
Chiết xuất từ thực vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh học
nhờ các vi sinh vật. Các AGIs có nguồ n gố c tự nhiên đươ ̣c đă ̣c biê ̣t quan tâm vì không gây
phản ứng phu ̣, do đó AGIs tự nhiên là một trong những liệu pháp hấp dẫn để điều trị tăng
đường huyết và thừa cân béo phì. Gầ n đây có nhiề u nghiên cứu về các AGIs từ nguồ n vi
sinh vâ ̣t như Bacillus subtilis, Actinoplanes spp, Aspergillus oryzae (A.oryzae). AGIs được
tìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm αglucosidase, ứng dụng hỗ trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì. Sử dụng A.oryzae bằng lên
men bề mặt trên môi trường rắn đỗ tương đang là hướng mới cho chất chiết xuất có hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase, sản phẩm AGIs từ đỗ tương lên men bề mặt trên môi trường
Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.

2

rắn bằng A.oryzae hiện đang được phát triển ở nhiều quốc gia, với mục đích hỗ trợ kiểm
soát đường huyết, hỗ trợ kiểm soát thừa cân béo phì. Trong các nghiên cứu đã công bố chủ
yế u sử du ̣ng đỗ tương (Glycine max) lên men bằ ng A.oryzae để thu nhâ ̣n AGIs. Tuy nhiên
các thông tin công bố về bản chất và cơ chế hình thành AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bề
mặt trên môi trường rắn băng A.oryzae còn hạn chế. Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ
thống thu nhận AGIs từ A.oryzae lên men trên các nguồn nguyên liệu trong nước và hướng
ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và
thực tiễn cao“Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae
và hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay, được tiến hành với những mục tiêu
sau:
(1) Phân lập, tuyển chọn A.oryzae phù hợp (cho quá trình lên men bề mặt trên môi trường
rắn) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao.
(2) Xác định điều kiện lên men mặt trên môi trường rắn phù hợp cho quá trình nhân giống,
sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu.
(3) Xác định điều kiện chiết xuất phù hợp cho tạo chế phẩm AGIs bằng A.oryzae nghiên
cứu.
(4) Tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu.
(5) Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công nghệ sản xuất AGIs hình thành bằng
A.oryzae nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau:

2. Nội dung
- Phần 1: Tuyển chọn A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao:
+ Phân lập A.oryzae từ các mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương
mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ
Đồng Xuân – Hà Nội.
+ Tuyển chọn A.oryzae phân lập được, có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao.

+ Định danh A.oryzae tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 5,8S - ITS2.

Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.

3

- Phần 2: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên
men, nhiệt độ, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian
nhân giống) ảnh hưởng tới quá trình nhân giống A.oryzae nghiên cứu.
- Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men,
thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống
ban đầu, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhân
giống) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu bằng lên men
bề mặt trên môi trường rắn.
- Phần 4: Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu,
nhiệt độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ môi trường
đỗ đen xanh lòng sau lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae nghiên cứu (mục
tiêu 3).
- Phần 5: Nghiên cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIs
được hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu: Xây dựng phương pháp xác định dung môi,
nồng độ dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Thu nhận AGIs bằng các enzyme thủy phân
lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- amylase và maltase; Xây dựng phương pháp
tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs tinh sạch được phân
tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer. Phổ AGIs được phân tích bằng
phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định lượng hàm
lượng AGIs bằng RP – HPLC.
- Phần 6: Xây dựng hướng ứng dụng AGIs và đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng

A.oryzae nghiên cứu:
+ Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm AGIs.
+ Đánh giá tính an toàn về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và an toàn
thực phẩm của AGIs tạo ra bằng A.oryzae nghiên cứu.
+ Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nước ta có nguồn nguyên liệu đậu đỗ rất đa dạng và nấm mốc A.oryzae phân lập từ
tự nhiên là rất phong phú. Trong sản xuất AGIs từ nấm mốc A.oryzae người ta thường
dùng đỗ tương làm môi trường lên men bề mặt trên môi trường rắn [100]. Sản phẩm AGIs
Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.

4

từ môi trường sau lên men bề mặt trên môi trường rắn từ đỗ tương bằng A.oryzae cho hiệu
quả giảm đường huyết đối với người bệnh ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụng
phụ. Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu đỗ trong nước làm nguyên liệu để lên
men A.oryzae cho sản xuất AGIs.
Các A.oryzae bản địa phân lập từ các nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đen
mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà,
Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà Nội.
Phương thức lên men bề mặt trên môi trường rắn được chọn lựa dựa trên điều kiện
thí nghiệm đơn giản.
Tinh sạch AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
và định lượng AGIs được hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu.
Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất, làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng
thực tiễn trong cải thiện AGIs giúp hỗ trợ điều trị ở người bệnh ĐTĐ.

4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của
luận án
Luận án nghiên cứu hệ thống từ việc lựa chọn, định tên A.oryzae, xác định bản chất
của AGIs và đưa ra phương án thích hợp nhất về điều kiện lên men, tách chiết hoạt chất và
hoàn thiện để có sản phẩm dạng bột chứa AGIs. Bằng quy trình công nghệ tạo ra chế phẩm
đã đề xuất và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae có thể ứng dụng để sản
xuất sản phẩm cho người bệnh ĐTĐ, góp phần nâng cao chất lượng sức khoẻ cộng đồng.
Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới: Đây là một nghiên cứu đầu tiên
của Việt Nam tuyển chọn được A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao trên môi
trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels), nghiên cứu được một số yếu tố ảnh
hưởng tới quá trình nhân giống và lên men hình thành AGIs. Nghiên cứu đầu tiên sử dụng
sóng siêu âm để chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, tinh sạch được AGIs từ đỗ đen lên
men, xác định được khối lượng phân tử và bản chất của AGIs này là peptide. Nghiên cứu
đầu tiên đề xuất được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men
bằng A.oryzae T6. Dựa vào kết quả khoa học của đề tài cho thấy tiềm năng sản xuất chế
phẩm AGIs ở quy mô lớn, tạo chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men cho chế biến thực phẩm
cho người bênh ĐTĐ và béo phì.

Footer Page 20 of 148.


Header Page 21 of 148.

5

Kết quả luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống
về peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môi
trường đỗ đen xanh lòng nhờ Aspergillus oryzae (từ việc phân lập tuyển chọn A.oryzae, các
điều kiện lên men, tách tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn thực

phẩm). Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền. Đây là kết
quả bước đầu góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm
alpha glucosidase để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ và béo phì.

5. Bố cục luận án
Luận án gồm 140 trang (không kể phụ lục), 16 bảng, 33 hình và 169 tài liệu tham
khảo, được trình bày 5 chương trong 7 phần lớn: Đặt vấn đề (5 trang); Tổng quan (35
trang); Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả
và thảo luận (59 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang ); Danh mục các công trình đã công
bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (18 trang).

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.

6

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)
1.1.1. Khái niệm ĐTĐ
Bệnh ĐTĐ hay còn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa
carbohydrate khi hoocmon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động vào cơ thể,
biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7 mmol/l. ĐTĐ liên quan đến rối loạn
chuyển hóa glucid, lipid, protid và điện giải. Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê và
tử vong trong thời gian ngắn nếu không được điều trị kịp thời. Tăng đường huyết kéo dài
sẽ gây ra rất nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim, mạch
vành, tai biến mạch máu não, suy thận, thần kinh, biến chứng gây mù lòa và rất nhiều biến
chứng cấp tính khác đe dọa đến tính mạng người bệnh. Riêng biến chứng tim mạch ở

những người mắc bệnh tiểu đường tăng gấp 2 - 3 lần so với những người bình thường.
Theo ước tính, tuổi thọ trung bình của bệnh nhân tiểu đường giảm 5 - 10 năm so với người
không bị tiểu đường [1].
Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO) [160] bệnh ĐTĐ
phân thành hai nhóm sau:
- Bệnh ĐTĐ typ 1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (nồng độ insulin giảm thấp
hoặc mất hoàn toàn): Do tổn thương hay suy giảm chức năng tế bào beta của tuyến tụy,
tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên bệnh nhân cần
phải tiêm hoặc uống insulin.
- Bệnh ĐTĐ typ 2 hay còn gọi là ĐTĐ không lệ thuộc insulin: Do kháng insulin kết
hợp với khả năng bài tiết insulin giảm. ĐTĐ typ 2 chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh ĐTĐ, cơ
thể người bệnh vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ khiến đường chỉ lưu hành trong máu mà
không đưa vào tế bào. Điều trị bệnh này, người bệnh áp dụng chế độ ăn uống hợp lý có thể
kiểm soát được bệnh.
- ĐTĐ typ đặc biệt khác: Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen; giảm
hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen; bệnh tụy ngoại tiết; bệnh tụy nội tiết; tăng đường
huyết do thuốc, hóa chất; nhiễm trùng….

Footer Page 22 of 148.


Header Page 23 of 148.

7

- ĐTĐ thai nghén: là bệnh được phát hiện ở những phụ nữ có rối loạn dung nạp
glucose hoặc ĐTĐ khởi phát trong thời kỳ mang thai.
Người mắc bệnh ĐTĐ nặng hay nhẹ dựa vào mức độ kiểm soát đường huyết. Có 04
mức kiểm soát đường huyết [1].
- Mức 1: Mức kiểm soát đường huyết tốt, hàm lượng glucose trong máu < 7 mmol/l.

- Mức 2: Mức kiểm soát đường huyết bình thường, hàm lượng glucose trong máu từ
7 – 10 mmol/l.
- Mức 3: Mức kiểm soát đường kém, hàm lượng glucose trong máu từ 10 – 13
mmol/l.
- Mức 4: Mức kiểm soát đường rất kém, hàm lượng glucose trong máu > 13 mmol/l.
1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ [1, 126]
Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 1: Những người mắc bệnh ĐTĐ loại 1, họ sẽ
phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra
hormon này. Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong hai dạng chính tùy theo tác dụng
nhanh hay chậm: Dạng tác dụng nhanh dùng ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong
cơ thể phù hợp với lượng carbohydrate sắp nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi
tối để giữ lượng đường trong máu không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau. Hiện nay,
việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi trường dạ dày sẽ bị phân hủy.
Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong một vỏ nang thích hợp để có
thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong ruột non và ngấm vào máu.
Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 2: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân,
phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động. Chỉ bệnh
nhân ĐTĐ loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm
lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp
tiêm insulin. Hoạt chất để điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
- Nhóm hoạt chất thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea: Glyburide
(Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride (Amaryl)
và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.

8

- Nhóm hoạt chất giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide:
Metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione:
glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos)
- Nhóm hoạt chất ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng AGIs: acarbose
(Precose, Glucobay), miglitol (Glyset)...
Phương pháp kìm hãm α-glucosidase trong điều trị ĐTĐ loại 2 được ưu tiên sử dụng
vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá
trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sản
sinh insulin … như các phương pháp khác.

1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể
1.2.1. Enzyme α-glucosidase
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme [19]
Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tế
bào sinh vật. Trong cuộc sống, nhờ có enzyme mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học với
một hiệu suất rất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH.
Như vậy, enzyme là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản
ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzyme sẽ biến đổi
chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzyme.
Enzyme có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác
bởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4000 phản
ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme.
Hoạt tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Tác nhân kìm hãm là các phân
tử làm giảm hoạt tính của enzyme, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng
hoạt tính của enzyme.
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase
Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase,
glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α–D-glucosidase,

transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase

Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.

9

hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng
thủy phân).
Enzyme glucosidase là enzyme thủy phân thuộc nhóm glucosidase (α-, β- và α-1,3glucosidase) là enzyme exohydrolysis có chức năng thủy phân từ đầu khử đến đầu không
khử của oligosaccharide chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4 glycosides.
Enzyme glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường
tiêu hóa động vật... việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt
về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme...những thông số này chỉ
có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một α-glucosidase cụ thể enzyme α-glucosidase
được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen mã hóa lysosomal α-glucosidase dài
khoảng 20 kb. Enzyme α-glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ là 4 - 4,5. α-glucosidase có
khả năng phân cắt các liên kết α -1 →4, α-1 →3 và α-1 →2 D glucoside có thể hấp thụ trực
tiếp vào máu [62]. α-glucosidase có tác dụng xúc tác thủy phân đường maltose và đường
sucrose.
Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy
phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non. Tiến trình
thủy phân này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để thủy phân các phân
tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp
tục phân hoá các oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu
vào máu. Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể làm giảm sự
thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu [73].

1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ
Cho đến nay, ĐTĐ vẫn là bệnh chưa thể chữa khỏi hoàn toàn. Thuốc chữa bệnh ĐTĐ
được chia thành nhóm: Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất
kìm hãm dipeptidyl peptidase IV và AGIs.
Hiện nay, rất nhiều AGIs được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh ĐTĐ
như voglibose (U.S. Pat. No. 6,200,958), acarbose (U.S. Pat. No. 5,643,874), miglitol (U.S.
Pat. No. 4,639,436)...
Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học về sử dụng AGIs để điều
trị bệnh ĐTĐ như: Tinh bột hoặc đường (sucrose), còn được gọi là carbohydrate. Cấu tạo

Footer Page 25 of 148.