Bài báo cáo thí nghiệm vi sinh KTMT nhóm 3

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

Nhóm 2

Page 1


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

BÀI 4: Kỹ Thuật Cấy Chuyền Vi Sinh
vật
Nguyên tắc

I.

Cấy là sự chuyển vi khuẩn từ mơi trường trong đó chúng đang sống sang mơi
trường mới để chúng có thể tiếp tục phát triển. Q trình cấy vi khuẩn nhằm mục
đích:
• Bảo tồn vi khuẩn ni thuần khiết.
• Ly trích vi khuẩn có trong mơ trường đất, nước, khơng khí, mẫu thực phẩm,
mẫu bệnh lý.
• Nghiên cứu tính chất sinh học của vi khuẩn khi cấy chúng vào môi trường
chứa các chất thí nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm

II.

Q trình cấy được thực hiện trong không gian vô trùng được tạo bởi ngọn lửa đèn
cồn hoặc đèn busen. Ngọn lửa có tác dụng oxy hóa khơng khí tạo khơng gian vơ
trùng đồng thời cịn được dùng để khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm

khi mở nắp, nút bơng.
CÁC
BƯỚC
TIẾN
HÀNH

NỘI DUNG

HÌNH ẢNH MINH HỌA

Giá ống
nghiệm
để bên
trái
• Tất cả
dụng cụ
cịn lại
để bên
phải
• Lau mặt
bàn nơi
thao tác
với cồn
70◦C
•

Sắp xếp
dụng cụ

Nhóm 2

GHI CHÚ
•

trang 2

Chọn
khu vực
40 cm2
để vệ
sinh
trước
khi thí
nghiệm


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

Chuẩn bị
giấy dán
nhãn,ống
nghiệm
chứa mơi
trường
để cấy

•

•

Người
thao tác
cần
mang
găng tay
hoặc
được
khử
trùng
bằng
alcool
70◦C.

•

Ghi tên
vi khuẩn
cần cấy,
mơi
trường,
ngày
cấy.

+Nhãn dán
cách miệng
ống nghiệm
khoảng 1,5 cm.

Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa mơi trường lỏng
• Dùng que cấy

CÁC
BƯỚC
THỰC
HIỆN
Khử trùng
đầu ống
nghiệm
trước khi
mở nút
bơng.

HÌNH ẢNH MINH HỌA

Để ống
nghiệm
nghiêng
cách cồn
2cm

Tay trái
cầm ống
nghiệm có
Nhóm 2

GHI
CHÚ

Cầm
thẳng
đứng

trang 3


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
vi khuẩn,
tay phải
cầm que
cấy.

que cấy
cho que
nóng
đều.

Đốt que cấy
cho đến khi
có màu đỏ,
khử trùng
cả phần cán
que cấy đưa
vào ống
nghiệm.

Nhóm 2

Tay phải
nắm nút
bơng giữa
ngón út và
cạnh bàn

tay, tay trái
xoay nhẹ
ống
nghiệm.

Tay phải
cầm que
cấy,ngó
n út và
lịng bàn
tay của
tay phải
cầm và
giữ nút
bơng.

Cho đầu
que cấy đã
khử trùng
vào bên
trong ống
giống, làm
nguội que
cấy.

Không
để ống
nghiệm
ở quá xa
đèn cồn.

Thu sinh
khối bằng
cách nhúng
đầu que cấy
vào mơi
trường lỏng
ria theo
đường
dzích dzắc

Tránh
cấy
mạnh
gây vỡ
thạch .
Khơng
ria nhiều
đường.
trang 4


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
từ dưới kéo
về hướng
miệng ống
và đậy nút
bông lại
Rút que cấy
ra không để

chạm vào
thành và
miệng ống
nghiệm.
Hơ nóng
miệng ống
nghiệm và
đậy nút
bơng.
Khử trùng
lại que cấy.

Kiểm tra
dán nhãn
,bao gói và
bảo quản

Nhóm 2

trang 5


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

•

Dùng pipetman
CÁC
BƯỚC
TIẾN

HÀNH

HÌNH ẢNH MINH HỌA

Tay
phải
cầm
pipetma
n, gắn
đầu tip
và chỉnh
thể tích
cần hút.

GHI CHÚ

-

-

Tay trái
cầm ống
giống vi
sinh vật.
Hút sinh
khối
theo thể
tích đã
chọn.

Nhóm 2

trang 6

Khơng
đưa
pipetma
n và
đầu tip
vào
ngọn
lửa.
Cần
khử
trùng
tay
bằng
cồn
70oC
hoặc
mang
găng
tay
,mang
khẩu


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

-

Chuyển
sinh
khối
sang
mơi
trường
mới.

Nhóm 2

-

trang 7

trang
trong
khi làm
thí
nghiệm.
Nếu
nồng độ
VSV
q
nhiều
,tiến
hành
pha
lỗng
mẫu.

Khi
chuyển
sinh
khối thì
thao tác
phải
nhanh
gọn, với
ống
nghiệm
phải giữ
ống
nghiệm
cách
ngọn
lửa đèn
cồn
khơng
q
6cm,
với đĩa
petri thì
chỉ
được
mở
nhỏ,hư
ớng về
phía

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
ngọn
lửa đèn
cồn.
Cấy giống từ môi trường rắn sang ống nghiệm chứa mơi trường lỏng
• Dùng que cấy chạm nhẹ vào mẫu vi sinh vật cần cấy.
• Cà nhẹ vào thành ống nghiệm có một ít mơi trường lỏng để làm
thành một huyền trọc.
• Lắc nhẹ ống nghiệm để vi khuẩn phân bố đều trong ống nghiệm,
đậy nút ống nghiệm.
• Khử trùng que cấy.
• Cấy giống từ mơi trường rắn sang ống thạch nghiêng
•

CÁC
BƯỚC
THỰC
HIỆN
Khử trùng
đầu ống
nghiệm
trước khi
mở nút
bơng.

HÌNH ẢNH MINH HỌA

Để ống
nghiệm
nghiêng cách

cồn 2cm

Tay trái
cầm ống
nghiệm có
vi khuẩn,
tay phải
cầm que
cấy.

Cầm thẳng
đứng que cấy
cho que nóng
đều.

Đốt que
cấy cho
đến khi có
màu đỏ,
khử trùng
cả phần
cán que
cấy đưa
vào ống
Nhóm 2

GHI CHÚ

trang 8

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
nghiệm.

Nhóm 2

Tay phải
nắm nút
bơng giữa
ngón út và
cạnh bàn
tay, tay
trái xoay
nhẹ ống
nghiệm.

Tay phải cầm
que cấy,ngón
út và lịng bàn
tay của tay
phải cầm và
giữ nút bông.

Cho đầu
que cấy đã
khử trùng
vào bên
trong ống
giống, làm
nguội que

cấy.

Không để ống
nghiệm ở quá
xa đèn cồn.

Lấy một ít
sinh khối
VSV và
đậy nút
bơng
lại,ria theo
đường
dzích dzắc
từ dưới
kéo về
hướng
miệng ống
và đậy nút
bơng lại

-Ống nghiệm
đặt cách ngọn
lửa đèn cồn
trong phạm vi
bán kính 6cm.
- Khi sử dụng
hộp petri để
lấy VSV cần
lấy tại những

khuẩn lạc có
kích thước đạt
yêu cầu phát
triển ( thường
dường kính từ
1mm trờ lên).
-Tránh cấy
mạnh gây vỡ
thạch .
trang 9


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
Khơng ria
nhiều đường.
Rút que
cấy ra
khơng để
chạm vào
thành và
miệng ống
nghiệm.
Hơ nóng
miệng ống
nghiệm và
đậy nút
bơng.
Khử trùng
lại que
cấy.

Kiểm tra
dán
nhãn ,bao
gói và bảo
quản

Nhóm 2

- Dán nhãn
phải ghi đủ 6
thơng số: tên
nhóm, ngày
phân lập, nồng
độ, tên VSV,
tên sinh viên,
môi trường.

trang 10


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

III.

KẾT QUẢ

Trong môi trường lỏng: môi trường trở nên đục khi VSV phát triển.

Nhóm 2

trang 11


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

Trong môi trường đặc như hộp petri, thạch nghiêng: vi khuẩn phát triển sẽ tạo
những vân nổi lên trên mặt thạch.
- Rút kinh nghiệm:
+ Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
+ khi khử trùng que cấy dưới ngọn lửa đèn để lấy vi sinh vật chứa trong mẫu cần để nhiệt
độ que cấy giảm xuống trong không gian vô trùng để tránh hiện tượng vi sinh vật bị chết
( do bỏng nhiệt) làm ảnh hưởng đến kết quả.
+ Mẫu vi sinh vật sao cho có 1 lớp màng dịch trên đầu que cấy vòng mới đạt yêu cầu.
+Thực hiện các đường cấy dứt khoác, đều tay.
+ Mọi thao tác khi tiến hành cấy vi sinh vật cần được thực hiện trong khơng gian vơ
trùng của ngọn lửa đèn cồn.

Nhóm 2

trang 12


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

BÀI 5: KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI
KHUẨN
I.

NGUYÊN TẮC

Trong thiên nhiên hoặc các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật luôn tồn tại ở dạng
hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh
lý, sinh hóa hoặc nghiên cứu ứng dụng của một lồi nào đónhất thiết phải đưa
chúng về dạng thuần khiết.
• Nguyên tắc của phương pháp này là pha loãng mẫu vậtcần phân lập (để cho số
lượng chúng ít đi) rồi cấy lên mơi trường đặc trưng. Mỗi lồi vi sinh vật có tính
đặc trưng trên các mơi trường dinh dưỡng. Lợi dụng tính chất này người ta tạo ra
các môi trường dinh dưỡng mà ở đó chỉ phát triển bình thường một nhóm vi sinh
vật nhất định. Các vi sinh vật không phải đối tượng nghiên cứu hoặc bị kìm hãm
hồn tồn hoặc từng phần. Ví dụ: cần phân lập nấm mốc hoặc xạ khuẩnthì phân
lập trên mơi trường có thêm chất kháng sinh vào để ức chế vi khuẩn.
• Như vậy các phương pháp phân lập giống vi sinh vật thuần khiết đều dựa trên một
số kỹ thuật pha loãng kết hợp vói điều kiện ni cấy chọn lọc tạo ưu thế tăng
trưởng cho chúng quan tâm.
•

II.

TIẾN HÀNH
1. Phương pháp pha lỗng mẫu

+ Mẫu là chất lỏng
Nội dung cơng việc

Hình ảnh minh họa

Chuẩn bị ống nghiệm
chứa 9ml nước cất,
dùng nút bông không
thấm nước và giấy báo

bọc lại ống nghiệm.
Sau đó, đem đi hấp
khử trùng ống nghiệm.

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường

Ghi chú
-Đậy nút bông và
bao bọc ống
nghiệm bằng giấy
báo cẩn thận.

Page 13


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
Dùng micropipet hút
1ml dịch mẫu chuyển
vào ống nghiệm đã có
sẵn 9ml nước cất, lắc
đều, ta được độ pha
loãng 10-1

-Trước khi pha
loảng mẫu phải
kiểm tra đã chú
thích dán nhãn số
ống nghiệm mà
bài yêu cầu chưa.

Dùng micropipet hút
1ml dịch mẫu ở độ pha
loãng 10-1 chuyển vào
ống nghiệm đã có 9ml
nước cất ta được độ pha
lỗng 10-2

-Phải lắc đều để
dịch mẫu và nước
hịa lẫn vào nhau
(có thể dùng máy
lắc để cho kết quả
tốt hơn).
- Giữa chặt ống
nghiệm tránh làm
rơi

Thực hiện tương tự cho đến khi đạt đạt nồng độ yêu cầu
+ Mẫu là chất đặc (mẫu đất, thực phẩm…)
Nội dung cơng việc

Hình ảnh minh họa

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

Ghi chú

Page 14

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
-Chuẩn bị bình tam
giác đã chứa 90ml
nước vơ trùng.
-Cân 10g mẫu cho
vào cối sứ vơ trùng.
Thêm ít nước
ở bình tam vào cối
rồi nghiền nát mẫu.
Đổ tồn bộ
nước cịn lại trong
bình tam giác vào
cối rồi chuyển tồn
bộ mẫu sang bình
tam giác khác, ta
được mẫu 10-1

-Để có mẫu
đất tốt nhất
phải chọn đất
có rễ cây, độ
ẩm tốt, khi cân
thì phải loại
bỏ rễ cây.
-Tránh mọi
trường hợp
cân sai số
( canh chỉnh
cân, tắt
quạt,..).

-Để mẫu lắng trong
khoảng 5 phút.

-Tránh hiện
tượng đầu típ
bị tắt khi chưa
lắng hết xuống
( lắng khoảng
2 phút)

Dùng micropipet hút
1ml mẫu cho vào
ống nghiệm chuẩn bị
sẵn 9 ml nước cất.
Lắc đều, ta được
nồng độ 10-2

-Phải lắc để
mẫu được trộn
đều ( hoặc sử
dụng máy lắc).
- Giữa chặt
ống nghiệm
tránh làm rơi.

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường

Page 15

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

- Tiếp tục pha loãng
như trường hợp chất
lỏng (sử dụng
micropipet).
-Tùy vào số lượng vi
sinh có trong mẫu
mà ta pha lỗng
nhiều hay ít.

Nhận xét- Rút kinh nghiệm:
- Nhận xét: Pha loãng mẫu ở nhiều nồng độ thập phân liên tiếp nhau theo yêu cầu .
- Rút kinh nghiệm:
+Ống nghiệm chứa nước cất sau khi hấp khử trùng cần để ở nhiệt độ phòng cho hạ bớt nhiệt
độ trước khi ngâm nước làm nguội ( để tránh bị vỡ ống nghiệm )
+ Phải đổi đầu pipet sau mỗi lần pha loãng .
+ Mỗi lần pha loãng mẫu cần lắc đều để đảm bảo u cầu.

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

Page 16


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

2. Phương pháp phân lập

+ Phương pháp hộp ria (streak plate)

• Phương pháp hộp ria là phương pháp pha loãng hữu hiệu và dễ thực
hiện nhất, trong đó, hỗn hợp vi sinh vật được trải và ria trên bề mặt môi
trường sao cho các tế bào riêng biệt tách nhau ra. Sau khi ủ, mỗi tế bào
sẽ phát triển thành khuẩn lạc đơn riêng rẽ. Khuẩn lạc đơn này là chủng
thuần do là hậu thế của một tế bào ban đầu.
• Cách tiến hành
Nội dung công
việc
Pha chế môi trường
cần sử dụng để cấy
ria.
Petri, bao gói giấy
báo và đem hấp
khử trùng

Dùng bơng thấm
cồn khử trùng tay
và mặt bàn nơi
thực hiện cấy

Hình ảnh minh họa

Ghi chú

• Chọn khu
vực 40 cm2
để vệ sinh
trước khi
thí nghiệm

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
Lắc đều ống
nghiệm chứa vi
sinh vật bằng máy
lắc

Giữa chặt
ống nghiệm
tránh làm
rơi.

Để ống thạch
nghiêng gần ngọn
lửa đèn cồn, dùng
ngón út mở nút
bơng
Tay trái cầm ống
nghiệm chứa vi
sinh vật, tay phải
cầm que cấy, dùng
ngón áp út mở nút
bơng, hơ miệng
ống nghiệm qua
lửa để khử trùng
Khử trùng que cấy
trên ngọn lửa đèn
cồn cho đén khi
đầu que cấy
chuyển sang màu

đỏ.
Đưa que cấy vào
ống nghiệm, chạm
đầu que cấy vào
thành ống nghiệm
để làm nguội trước
khi lấy một ít sinh
khối vi sinh vật
Dùng que cấy chứa
sinh khối vi sinh
thực hiện cấy ria
trên bề mặt thạch
nghiêng, hơ miệng
ống nghiệm qua
ngọn lửa đèn cồn
và đậy nút bông.

-Nên thực
hiện thao
tác gần
ngọn lửa
đèn cồn
trong bán
kính 6cm.

-Thao tác
nhẹ nhàng
tránh làm
vỡ thạch
-Đường cấy

phải bắt đầu
từ cuối ống
nghiệm và
kết thúc ở
gần sát đầu
ống nghiệm
chứa thạch
nghiêng.


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
Khử trùng que cấy
Dán nhãn cho các
ống thạch vừa thực
hiện cấy ria, bao
gói lại để bảo quản.

-Bao gói,
bảo quản
cẩn thận
tránh nhiễm
vi khuẩn
khác
- Dán nhãn
phải ghi đủ
6 thơng số:
tên nhóm,
ngày phân
lập, nồng
độ, tên

VSV, tên
sinh viên,
môi trường.


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

III.

KẾT QUẢ
Kỹ thuật phân lập
Cấy ria

Hình ảnh


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường

BÀI 9: VI KHUẨN PHÂN GIẢI
PHOSPHO
I.

NGUYÊN TẮC
Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyển hóa phospho vơ cơ thành dạng hịa
tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hóa hoặc các loại vi khuẩn
sinh axit lên men nhiều chất khác nhau.
• Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dùng mơi trường đặc có

đường glucose và có muối phospho khó tan, thường dùng là Ca3(PO4)2. Do kết
quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vịng trong
suốt.
•

II.

TIẾN HÀNH
1. Vi khuẩn phân giải phospho vơ cơ khó tan
• Pha lỗng mẫu
- Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 90ml dịch pha loãng đã hấp

khử trùng. Lắc cho dung dịch phân bố đều.
Hút 1ml dịch huyền phù này bằng pipet 1ml đã hấp khử trùng cho vào ống
nghiệm đã chứa sẵn 9ml dịch pha loãng (đã hấp khử trùng) ta được dịch
pha lỗng có nồng độ 10-2
- Tiếp tục thực hiện để được dịch có độ pha lỗng có 10-3,10-4,10-5.
• Cấy mẫu
- Hút 0,1ml dịch cấy vào hộp petri đã chuẩn bị sẵn mơi trường. mỗi độ pha
lỗng cấy 3 đĩa.
- Dùng que trang trải đều mẫu trên mặt thạch.
- Úp ngược đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 20-300c trong 7-14 ngày.
• Đếm số khuẩn lạc
- Chỉ đếm những khuẩn lạc hình thành vịng phân giải trong suốt bao quanh,
cịn các khuẩn lạc khơng có vịng phân giải bao quanh không phải là vi
sinh vật phân giải phospho.
2. Vi khuẩn phân giải phospho hữu cơ
- Pha loãng mẫu để được dịch có độ pha lỗng 10-1,10-2,10-3,10-4
- Chọn 3 nồng độ liên tiếp 10-2,10-3,10-4.
- Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch cấy vào hộp petri đã chuẩn bị sẵn môi

trường. mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa.
- Trải đều mẫu trên mặt thạch bằng que gạt.
- Úp ngược đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 20-300C trong 3-4 ngày
-


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường
III.

Đếm khuẩn lạc: đếm những khuẩn lạc màu trắng đục có hình trịn, có nếp
nhăn là khuẩn lạc của vi khuẩn phân giải phospho hữu cơ.
Tính kết quả.

KẾT QUẢ
Ở độ pha lỗng 10-2 nhóm đếm được 156 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu xanh
xung quanh có những vịng phân giải trong suốt.

Tính kết quả:
Số tế bào/g =CFU/ml
Trong đó:
N: số khuẩn lạc có trong 1 petri
V: thể tích mẫu cấy (ml)
n: số nghịch đảo của nồng độ pha lỗng
K: hệ số khơ kiệt
IV.

NHẬN XÉT
-

-

Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng xung quanh ( 40 cm2) và tay để
tránh nhiễm trùng vi sinh vật vào môi trường thạch. Khi tiến hành đổ thạch
phải thực hiện trong phạm vi khử khuẩn của đèn cồn.
Ghi nhãn đúng môi trường và nồng độ pha lỗng tránh gây lẫn lộn.
Do kết quả thí nghiệm của nhóm q dày nên khơng đếm được, nên có sử
dụng kết quả của nhóm khác để hồn thiện bài báo cáo.


Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường