Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

MỞ ĐẦU
Ở nước ta, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng
tăng; đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 692000 ha với sản lượng trên
596000 tấn, kim ngạch xuất khẩu khoảng 3 tỷ USD. Tuy nhiên ngành sản xuất này hàng
năm cũng thải ra một lượng lớn phụ phẩm giáp xác (khoảng 70000 tấn) gây ô nhiễm mạnh
mẽ tới môi trường. Do vậy, để nâng cao lợi ích kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường,
cần khai thác tận thu những thành phần có lợi từ phế liệu như chitin, protein, astaxantin.
Chitin đại diện cho polymer sinh học tự nhiên và đứng thứ hai sau cellulose, có mặt
trong vỏ xương ngoài loại giáp xác: vỏ cua, vỏ tôm,… Chitin không được sử dụng nhiều
do tính không tan trong nước.
Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine (N-acetylD-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG). NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp,
viêm dạ dày,... Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị
bệnh tự miễn dịch [69].
Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao. Xử
lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%)
và giá thành cao. Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại. Do
vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase. Công bố
sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn. Xuất phát từ nhu cầu
thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hƣớng
ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”.
* Mục tiêu nghiên cứu:
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum
20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật
* Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận
được.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm
chức năng.

* Những đóng góp mới của luận án:
1


- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên
men sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P. oxalicum 20B và xác định các đặc tính
của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine. Đặc biệt ảnh hưởng
của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase
kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét.
- Đã đưa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin và xác
định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu
sản xuất thực phẩm chức năng.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. N- ACETYLGLUCOSAMINE
1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine
N-Acetylglucosamine là dẫn xuất của đường
glucoza, có nhóm amit liên kết giữa glucosamine
và axit axetic. Công thức phân tử C8H15NO6, khối
lượng phân tử là 221,21 g/mol.
NAG có dạng bột màu trắng, vị ngọt nhẹ,
nóng chảy ở 221oC, khả năng hoà tan của NAG là
25% trong nước. NAG hiếm khi tồn tại ở dạng tự
do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600 - 1500
mg/ml).

Hình 1.1. Công thức cấu tạo NAG

NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin. Ngoài ra nó có
trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng
ngoài. Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự
phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein
hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân.
1.1.2. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng
NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương
xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo
sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp. NAG được dùng để phục hồi lớp
sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [54].
Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm
xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác
dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn.
Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp
bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn,
tổn thương khớp, thoái hóa khớp. Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng
trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn
tính và bệnh tổn thương sụn xương [27].
Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi
khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày. NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng
mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do
vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ,
khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người.
3


Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh
viêm ruột. Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG

đường uống hay đường hậu môn. Thực tế, trong thử nghiệm này, 8 trong số 12 trẻ em cho
thấy cải thiện rõ rệt khi được cho uống NAG như là một liệu pháp song song với liệu pháp
hiện hành, trong khi 4 trường hợp còn lại không thấy chuyển biến. Ngoài ra, 7 trẻ bị bệnh
viêm ruột khác cũng được dùng NAG đường hậu môn như là một liệu pháp duy nhất đã
cho thấy cải thiện rõ rệt ở 5 em và 2 em còn lại không đáp ứng liệu pháp. Đáng lưu ý là 2
em không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp khác
[125]. Do đó, NAG hứa hẹn là một phương pháp điều trị rẻ tiền và không độc hại đối với bệnh
viêm ruột mãn tính. Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa được hoàn thành [87].
Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngoài) và lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ
cơ thể khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như thời tiết khô, tia cực tím…Tầng
lớp sừng đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da. Lớp hạ
bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng
phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, giúp cho làn da luôn khỏe mạnh. Một trong những nhóm
carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic (HA) và proteoglycan có khả năng giữ nước
cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da. Lượng cabonhydrate giảm
dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khô,
xuất hiện các nếp nhăn. Bổ sung NAG giúp tăng cường sự phát triển và biểu hiện collagen
của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất
hiện các sắc tố da trên khuôn mặt, cải thiện nếp nhăn trên da [29].
NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch
[69]. Ngoài ra, dùng NAG trong mỹ phẩm, băng bó vết thương, và như phụ gia thực phẩm
sữa. Lợi ích và ứng dụng NAG thể hiện trên Bảng 1.1.
Bissett và cs (2007), Chen và cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng về NAG lên
người bệnh khi uống như: sự hấp thụ, phân phối và đào thải khi uống nó [15]. Nghiên cứu
của Chen và cs (2010) đã chỉ ra tỷ lệ hấp thụ đạt 98% và mỗi khi NAG được hấp thụ, nó sẽ
phân phối chính vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối của
sụn, dây chằng, gân [27].
Trong cơ thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, như chất kích hoạt hàng
loạt các chất trong huyết tương có thể hoạt hóa thành plasma [143].
Chế phẩm chứa NAG được sử dụng bằng đường tiêm, uống. NAG bị phân giải một

cách từ từ và giữ cấu trúc giống như chất có trong cơ thể người nên khả năng hấp thu cao
gấp 3 lần so với glucosamine thông thường. Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh
mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose trong máu [133]. Người ta
cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài tiết qua đường nước tiểu trong 1
ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh hóa của NAG.
4


Bảng 1.1. Ứng dụng và lợi ích của NAG

Chức năng

Đối tƣợng

Thử nghiệm

Tài liệu
tham
khảo

Điều trị
bệnh

Ung thư và di căn
Bệnh đường ruột
Bệnh rối loạn đường ruột
Tổn thương khớp

Động vật, con người
Con người

Con người
Con người

[176]
[177]
[153]
[90]

Phòng ngừa
bệnh

Ngộ độc thuốc và chất hóa học
Thuốc kháng sinh
Tác dụng phụ của điều trị hóa
trị và điều trị sóng vô tuyến
Say tàu xe

Tế bào vi sinh vật, động vật
Vi khuẩn
Con người

[178]
[175]
[176]

Con người

[174]

Bệnh ngoài

da

Vệ sinh da

Con người

[172]

Thực phẩm
bổ sung

Phụ gia trong sữa
Phụ gia trong đồ uống thể thao

Động vật, con người
Động vật, con người

[173]
[167]

Làm mỹ
phẩm

Giữ độ ẩm cho da
Tăng tính đàn hồi và màu sắc
Giảm sản xuất melanin

Con người
Con người
Con người

[27]
[130]
[15]

Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc. Ngoài ra NAG được tạo ra bởi enzym
có vị ngọt và bền nhiệt. Chính vì vậy, gần đây NAG và dẫn xuất từ NAG đã được sử dụng
để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng trong chữa bệnh cho con người [7].
1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine
1.1.3.1. Phương pháp hóa học
Theo phương pháp hóa học, NAG được sản xuất bằng cách dùng axit HCl đậm đặc
để thủy phân chitin ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ và nồng độ axit cần phải kiểm soát một cách
chặt chẽ, đủ cao để thủy phân chitin và tránh phân hủy NAG. Thường quá trình thủy phân
diễn ra ở nhiệt độ khoảng từ 40 - 80ºC và nồng độ HCl từ 15 - 36%. Sản lượng NAG có
thể đạt 6,42 g/l trong 1 h [22]. Phương pháp này thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới
65%), giá thành cao và thải ra một lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản
phẩm cuối có vị mặn và có tác dụng phụ do quá trình hóa học [128]. Đặc biệt nhóm axetyl
bị mất đi nên lại phải axetyl hóa trở lại khá phức tạp. Do vậy sản phẩm không được coi là
tự nhiên bởi sự có mặt các chất hóa học (như O-axetyl, diaxetyl, dung môi) trong sản phẩm
đã gây vị đắng [71].
1.1.3.2. Phương pháp chuyển hóa sinh học
Sản xuất NAG qua quá trình chuyển hóa trực tiếp chitin bởi vi sinh vật tổng hợp
5


chitinase không thông qua giai đoạn thu các chế phẩm trung gian. Phương pháp có ưu điểm
là ít công đoạn nhưng quá trình khó kiểm soát do sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất
khác ngoài NAG. Theo Li và cs (2005) nếu dùng 2% gel chitin làm cơ chất nuôi cấy vi khuẩn
Aeromonas caviae DYU-BT4 từ mẫu đất ở Taiwan có thể thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [83].
Theo nghiên cứu khác của Chen và cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ

đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần
lượt là 76% và 98%. Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [30]. Các
nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ
phát triển của C. tainanensis khi có mặt chitin. Hoạt tính NAHase và endochitinase được
tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết. Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với
endochitinase. Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2.

Hình 1.2. Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [71].

Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose
làm cơ chất. Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay
đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và
tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao. Dùng vi sinh vật biến đổi
gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp.
1.1.3.3. Phương pháp enzym
Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym.
Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch. Tuy nhiên
chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen. Nên trong thực tế hay dùng
enzym thô thu nhận NAG.
Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn. Đầu tiên
endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị
phân giải thành các monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [127]. Sáng chế của Haynes và cs
6


(1999) tại nước Mỹ đã thu nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase)
thủy phân vỏ loài giáp xác [51].
Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và
Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG. Chitinase từ B.
cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất

thu nhận NAG hơn 85%. Chitinase từ B. licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin trong 6
ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75%. Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt
41% khi thủy phân α-chitin bằng B. licheniformis SK-1 [110].
Bohlmann và cs (2004) dã đưa ra sáng chế: NAG thu được với độ tinh sạch cao bằng
cách thủy phân chitin bởi sinh khối nấm sợi [22].
Aiba (2005) đã dùng dịch enzym thô (gồm NAHase và chitinase) từ A. hydrophila H2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7].
Jung và cs (2007) công bố sản xuất NAG và N-acetylchitooligosaccharide bởi dịch
enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [60].
Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin bằng chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu
suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65%. Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride và
Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [57, 132].
Hiện nay, tiềm năng sản xuất NAG là sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase được
nhân lên trong E.coli [76].
So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin bằng enzym diễn ra
trong điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm NAG có thể tinh
sạch gần 100% nên được ưa thích hơn [74].
Đối với phương pháp thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin vô định hình thủy
phân một cách dễ dàng, còn chitin liên kết chặt chẽ được thủy phân từ từ. Hỗn hợp
endochitinase, exochitinase (chitobiosidase và NAHase) là cần thiết cho sự thủy phân hoàn
toàn chitin, khi hàm lượng NAHase cao thì NAG tạo ra có độ tinh khiết cao. Do vậy, cấu
trúc tinh thể chitin và thành phần enzym là hai yếu tố quan trọng trong sản xuất NAG bằng
phương pháp enzym [27].

1.2. CHITIN
1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin
Chitin là 1 polysaccharide mạch thẳng gồm các β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-Dglucose. Hay nói cách khác: Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là NAG liên kết bởi liên
kết 1,4- β-glucoside và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức. Cấu trúc hóa học
chitin giống với cấu trúc hóa học cellulose, chitosan. Chúng chỉ khác nhau bởi các nhóm OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3).
7

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [70]

Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi
hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate. Ngoài ra, chitin
có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA). Muối LiCNS, Ca
(CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [112].
Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% DGlucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside,
sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3).

Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị
mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc)
Chitosan + n CH3COONa
Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro.
Cấu trúc tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và
giữa các phân tử. Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận
gọi là liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị
trí cacbon - 6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương
tự như liên kết hydro trong chuỗi cellulose. Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên
kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [97]. Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng
chuỗi tinh thể chitin.

8


Hình 1.4. Liên kết hydro nội phân tử chitin [97].

Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X
[97], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin
[45], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể. Dạng chitin

khác nhau chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (NAG) trong mạch thể
hiện Hình 1.5. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên
chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được
mô tả sau:

Hình 1.5. Dạng cấu hình α, β, γ- chitin [45].

Ba dạng đa hình chitin khác nhau về mức độ hydrat hóa, kích thước và số chuỗi
chitin trong một đơn vị tế bào.
-chitin (có nhiều trong vỏ tôm, cua) được phân bố rộng rãi nhất, là dạng rắn chắc và
kết tinh nhất, các chuỗi được sắp xếp kiểu đối song song đều đặn [26], nên ngoài liên kết
hydro trong một lớp và hệ chuỗi, còn có liên kết hydro giữa các lớp kề nhau. Do vậy làm
đặc tính -chitin rất bền vững, cứng và không tan trong nước.
Cấu trúc -chitin có thêm các liên kết hydro (được tạo bởi các nhóm hydroxymethyl
(CH2OH) của các chuỗi liền kề nhau), trong khi đó không tìm thấy liên kết này ở cấu trúc β
– chitin [100].
β-chitin (có nhiều trong mai mực) gồm các chuỗi song song, trong khi γ-chitin (nhiều
trong nấm và nấm men) có hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp chuỗi thứ ba với
hướng đối diện song song, giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Loại γ-chitin rất ít
nghiên cứu vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ
không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của αchitin [13].
9


Sự phân bổ các dạng này không liên quan tới nguyên tắc phân loại vì các dạng khác
nhau có thể xuất hiện trong một cơ thể, mặc dù đặc tính chức năng khác nhau: α-chitin là
dạng đầy đủ nhất, rất cứng [121]. So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân
bởi enzym hơn nhưng -chitin tồn tại trong tự nhiên phổ biến hơn. β-chitin và γ-chitin có
tính bền, mềm dẻo và nhiều chức năng sinh lý hơn. Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α
bằng xử lý với kiềm nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi

sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [99].
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin
Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [23]. Chitin là hợp chất polimer
có mặt từ nhiều nguồn khác nhau. Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số
động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Ở động vật
bậc cao, chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết
trên da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc,
một số loại tảo…
Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và
mực nang. Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60%
so với trọng lượng khô [148].
Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa
học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong
thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin
[14]. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở
Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông
lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến.
Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng
đáng kể phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu. Ở Việt Nam,
hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000
tấn. Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm. Phế liệu này thải
trực tiếp ra môi trường và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn.
Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ,..) cần được tận dụng nhằm
nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế
biến thủy sản mang lại.

1.3. CHITINASE
1.3.1. Hệ chitinase
Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase
(EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C. 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase (EC

3.2.1.96).
10


1.3.2. Đặc tính sinh hóa
Chitinase từ các nguồn khác nhau có đặc tính sinh hóa tương đối khác nhau.
Chitinase (E.C 3.2.1.14) có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa đến 90 kDa. Khối
lượng phân tử chitinase vi khuẩn từ 20 kDa đến 60 kDa, nhỏ hơn chitinase côn trùng (khối
lượng phân tử từ 40 - 85 kDa); khối lượng phân tử chitinase thực vật giống khối lượng
phân tử chitinase côn trùng (khoảng 40 kDa đến 85 kDa) [16]. Khối lượng phân tử
chitinase từ nấm mốc khoảng 27 kDa đến 190 kDa. Chẳng hạn: khối lượng phân tử
chitinase từ Aspergillus sp và Coccidioides immitis khoảng 83 đến 97 kDa. Hầu hết chế
phẩm chitinase từ nấm cho nhiều hơn 1 loại enzym như: 7 loại enzym gồm 1,4-βchitobiosidase (40 kDa) [50], hai loại NAHase (102 và 73 kDa) bốn loại endochitinases
(52, 42, 33 và 31 kDa) trong dịch chitinase từ Trichoderma harzianum [49]; ít nhất hai
loại enzym từ Talaromyces flavus [81]; hai loại exochitinase và một endochitinase từ nấm
ký sinh loại lớn Stachybotrys [155]. Chế phẩm chitinase chứa ít nhất sáu enzym khác nhau
từ nấm Metarhizium anisopliae [61]. Endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô
từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [57]. Dịch chitinase từ Penicillium oxalicum chứa NAHase
(132 kDa) [116] và endochitinase (54,9 kDa) [118].
Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces sp. M-20 là 30ºC [66]; từ
Streptomyces rimosus là khoảng 40 - 45ºC [24]; từ Sanguibacter là 37ºC [180]; từ
Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 40oC [108]; từ Aspergillus sp là 40ºC [132],...
Hoạt độ chitinase từ Aspergillus sp khi để nhiệt độ ở 45ºC và 50ºC trong 63 h còn tương
ứng lần lượt 90%, 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [132].
Hoạt độ tương đối của chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 đạt
cao nhất ở khoảng nhiệt độ 35ºC - 40ºC trong thời gian 30 phút, nhưng giảm mạnh khi
nhiệt độ trên 55ºC; ở nhiệt độ 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại lần lượt 82% và 58%
sau thời gian 168 h; ở nhiệt độ lần lượt 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại ½ sau thời
gian tương ứng 20 ngày và 8,4 ngày [12]. Chitinase tinh sạch từ Vibrio alginolyticus TK-22
hoạt động tối ưu ở 45ºC và ổn định ở 40ºC trong 30 phút [104]; chitinase tinh sạch từ Vibrio

sp. P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [151].
Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [50, 77, 81, 82,
111, 159]. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC
như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [160]; từ
Serratia marcescens là 50ºC [183]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus
protuberus là 55ºC [48]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [93], hoạt độ chitinase từ
Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25
phút đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [81]. Nhiệt độ tối ưu đối với
chitinase từ Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [157]. Endochitinase và β-N-

11


acetylhexosaminidase từ A. flavus và F. oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC, nhưng các
enzym này từ P. monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [147].
Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC;
chitinase từ P. aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [20].
Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase
từ P. oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC. Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở 45ºC
trong thời gian 20 h [117]. Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P.
oxalicum hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 35ºC và ổn định ở nhiệt độ lên tới 45ºC trong thời
gian 120 phút. Hoạt tính chitinase bị mất một nửa ở 45ºC và 50ºC trong khoảng thời gian
tương ứng 53 phút và 23 phút [116].
Chitinase từ chủng vi sinh vật khác nhau hoạt động trong khoảng pH khác nhau.
Khoảng pH hoạt động của chitinase tinh sạch từ Aeromonas hydrophila H- 2330 là pH 5,0
- 8,0 [52]; từ Aeromonas sp. No. 10S-24 chitinase là pH 4,0 - 9,0 [158]; từ Bacillus sp.
BG-11 là pH 7,5 - 9,0 [17]; từ Bacillus 13.26 là pH 7,0 - 8,0 [182]; từ Bacillus sp. NCTU2
là pH 6,8 - 8,0 [165]; từ Vibrio sp là pH 4,0 - 9,0 [184]; từ Myrothecium verucaria là pH
4,0 - 6,5 [163]. Chitinase nấm mốc hoạt động trong vùng pH 4 - 7. Theo Lee và cs (2009)
công bố chitinase từ nấm sợi hoạt động tốt trong vùng axit nhẹ pH 4,0 - 7,0 [80].

Chitinase từ từng chủng vi sinh vật hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu riêng. Chitinase
hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 3,5 - 5,5 như: pH tối ưu đối với chitinase
từ Aspergillus sp là 3,5 [132], từ Aeromonas sp. No. 10S-24 là pH 4,0 [158]; từ
Sanguibacter là 4,6 [146]; từ Aspergillus protuberus [48] và Streptomyces sp. M-20 đều là
5,0 [66]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 là pH 5,0 - 5,5 [93]; từ Bacillus cereus
[113]. Chitinase hoạt động cao nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 6,0 - pH 7,5 như: từ
Enterobacter sp. G-1 là 6,0 [106]; từ Serratia marcescens là 6,0 [183]; từ Bacillus sp.
NCTU2 là pH 6,3 [165]; từ Vibrio alginolyticus H-8 [104] và Vibrio sp [184] đều là 6,5; từ
Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160]; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160];
từ Streptomyces rimosus [24] cũng như từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 7,0;..
Chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 hoạt động tối ưu tại pH 7,5, bị vô
hoạt khi pH < 5, nhưng hoạt tính chitinase còn lại 80% ở 37ºC và khoảng pH 5 - 10 [12].
Ngoài ra chitinase ưa kiềm hoạt động ở pH tối ưu như pH 8,0 từ Bacillus circulans
No.4.1; pH 9,2 từ Beauveria bassianse [146]; pH 11,0 từ Streptomyces sp [114].
So sánh với một số chitinase từ các chủng Penicillium, ta thấy chitinase từ P.
aculeatum có pH tối ưu là 5,5 [20]; chitinase từ P. citrinum có hoạt tính mạnh nhất tại pH
6, bền ở khoảng pH từ 6 - 7 [4]. β- N - acetylglucosaminidase và chitinase từ P. oxalicum
có pH hoạt động tối ưu lần lượt 4,5 và 6,5; bền trong khoảng pH lần lượt 3,5 đến 7,0 và 4,0
đến 8,0 [117]. Chitinase tinh sạch từ P. oxalicum hoạt động tối ưu ở pH 5,0 và ổn định ở
khoảng pH từ 4,0 đến 6,0 trong thời gian 120 phút. Enzym này bị vô hoạt nhanh khi pH < 4
12


hoặc pH > 7 [116].
Chitinase bị mất hoạt tính, nhiễm vi sinh vật trong khoảng thời gian bảo quản nhất
định, nên với mục đích bảo quản enzym các chất phụ gia như NaCl, glycerol, benzoat
natri,.. được bổ sung kết hợp với giải pháp nhiệt độ thấp. Pradeep và cs (2015) đã đưa ra
các phương pháp bảo quản chitinase từ Streptomyces sp. CS147: chế độ nhiệt độ 4ºC, nhiệt
độ phòng từ 25 - 30ºC kết hợp với chất phụ gia như Na2S2O4 (0,1% w/v), KCl (15% w/v)
và glycerol (30% v/v) để bảo quản chitinase từ Streptomyces sp. CS147. Ở nhiệt độ 4ºC,

chitinase tinh sạch vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính trong 18 tuần; nhưng còn lại 80% hoạt
tính khi bổ sung chất phụ gia bảo quản như Na2S2O4, KCl và glycerol và còn lại 60% hoạt
tính khi bảo quản bởi chất phụ gia NaN3. Mặt khác ở nhiệt độ phòng (từ 25 - 30ºC), không
dùng chất phụ gia bảo quản thì chitinase mất hoàn toàn hoạt tính sau thời gian 14 tuần,
nhưng hoạt tính chitinase vẫn giữ gần như 100% khi bảo quản bởi Na2S2O4, KCl và
glycerol trong thời gian 14 tuần, hoặc bảo quản bằng NaN3 trong thời gian 11 tuần [114].
1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm
tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phân tử khác nhau (diacetylchitobiose, chitotriose, chitotetraose,…), nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (NAG)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa
[123]. Sau đó 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn
hơn hay bằng 3 [(NAG)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và cho sản phẩm chính là
diacetylchitobiose (NAG)2 [38], không chứa NAG hoặc chitooligomer. β-Nacetylhexosamindase phân cắt diacetylchitobiose cũng như các polymer chitin cao hơn
gồm chitotriose và chitotetraose thành NAG [76]. Chính vì thế, nên phân biệt hoạt tính
giữa endochitinase, 1,4-β-chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng
của sự phân cắt là NAG (Hình 1.6).
Cơ chế thủy phân chitin thành NAG qua 2 giai đoạn: đầu tiên chitinase thủy phân
chitin mạch dài thành các chitooligosaccharide ngắn mạch hơn, sau đó NAHase thủy phân
chitooligosaccharide ngắn mạch ngắn thành NAG [57].
Tương tự, một số tác giả đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin bởi chế phẩm
enzym chứa cả endochitinase và NAHase thành NAG và đều cho rằng đầu tiên
endochitinase thủy phân chitin thành N-acetyl chitooligosaccharides, sau đó N-acetyl
chitooligosaccharides tiếp tục lần lượt được thủy phân bởi NAHase thành NAG [19, 145, 146].
Mặt khác, Binod và cs (2007) cho rằng thủy phân chitin thành NAG qua một giai
đoạn thủy phân thì chế phẩm enzym thô từ Penicillium aculeatum NRRL 2129 và từ
Trichoderma harzianum TUBF 927 phải chứa cả endochitinase và chitobiosidase.
Endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase
hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 thủy phân chitin thành NAG
13

đạt hiệu suất thu nhận cao [19]. Ngoài ra, để thủy phân chitin bằng enzym thành NAG đạt
hiệu suất thu nhận cao chỉ qua một giai đoạn thì chế phẩm enzym phải chứa đồng thời cả
endochitinase và NAHase, đặc biệt hoạt tính NAHase cao và hoạt tính endochitinase phải
tương đối thấp [9, 19, 148].
Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất
từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ
Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu
nhận cao [19].
Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch
enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất
chitin thành NAG [129].

Hình 1.6. Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase

1.3.4. Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG
1.3.4.1. Các giải pháp tiền xử lý chitin
Chitin không hòa tan trong nước bởi tính kỵ nước, độ kết tinh cao, các liên kết hydro
bền vững, nên nó khó bị thủy phân bởi enzym. Sự thủy phân chitin tự nhiên bởi enzym bị
hạn chế có thể là do khả năng tiếp cận với liên kết β-glycosidic trong nội mạch cấu trúc
tinh thể gặp khó khăn [27]. Mặt khác, khi thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin cấu
trúc vô định hình dễ bị thủy phân hơn phần chitin cấu trúc tinh thể liên kết chặt chẽ [27].
14


Do đó để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase, nhiều công trình
nghiên cứu đã sử dụng phương pháp xử lý chitin bằng hóa học [64], nghiền bi [101], bằng
sóng siêu âm [43]. Ajavakom và cs (2012) cho thấy sóng siêu âm và vi sóng làm tăng quá
trình thủy phân chitin thành NAG bằng acid [10].
A). Xử lý bởi tác nhân hóa học
Karube và cs (1993) đã nghiên cứu thấy rằng tác động nhiệt lên chitin trong dung

môi kỵ nước hoặc chất hoạt động bề mặt sẽ làm suy yếu liên kết hydro, tương tác kỵ nước
của cấu trúc tinh thể và do đó tạo thuận lợi cho hoạt động của các enzym phân hủy [64].
Nới lỏng cấu trúc chitin bằng xử lý bởi các hydrocacbon mạch thẳng hoạt động bề mặt
(như: Triton X-100, Tween 20, hexane, heptane, nonane, decane), hydrocacbon vòng thơm
(benzene, toluene, o-oxylene, m-xylene, p-xylene), hoặc xử lý kết hợp làm nóng như đun
sôi, nồi hấp, khuấy nhiệt, hoặc kết hợp siêu âm đã được nghiên cứu. Phương pháp xử lý
như vậy giúp phá hủy cấu trúc tinh thể và tăng tỷ lệ chuyển đổi của chitin. Chitin khuấy
nhiệt ở 100ºC với urea 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; trong thời gian lần lượt 30 phút và 2 h làm
tăng tỷ lệ chuyển đổi chitin từ 7% đến 13,9% so với nguyên liệu ban đầu không qua xử lý
khi thủy phân bằng lysozyme. Ngoài ra xử lý chitin với dodecane kết hợp siêu âm giúp
tăng tỉ lệ chuyển đổi từ 4,4% đến 13,1% [64].
Bên cạnh đó, liên kết hydro và tương tác kỵ nước là cần thiết để duy trì cấu trúc ba
chiều của enzym. Các enzym phân hủy chitin có thể bị bất hoạt trong điều kiện nghiêm
ngặt. Vì vậy cần sử dụng nồng độ thấp các chất hóa học để hoạt động xúc tác enzym vẫn
diễn ra trong phản ứng thủy phân chitin [27].
Gần đây, endochitinase chịu nhiệt nóng tốt đã được tìm thấy trong dịch dùng lên men
của vi khuẩn, và có khả năng tương thích cao với chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl
sulfate (SDS) [27]. Trong tương lai, những enzym này có thể được áp dụng để nâng cao
hiệu quả thủy phân chitin.
B). Xử lý bởi tác nhân cơ học
Cellulose từ rơm rạ là polysaccharide với cấu trúc tinh thể giống chitin có thể thay
đổi mức độ tinh thể từ 74,2% xuống 4,9% bằng nghiền búa và hơn 50% cellulose từ rơm bị
chuyển hóa thành glucose khi thủy phân enzym trong điều kiện nhẹ nhàng. Rơm cắt ngắn 5
– 8 cm đưa đi nổ hơi sau đó nghiền thành bột mịn kích thước 60 µm giúp quá trình thủy
phân thu đường khử cao nhất. Tiến hành nghiền kết hợp nổ hơi có thể thủy phân 100% các
chất lignocellulose bằng enzym [150].
Nghiền tác động làm chitin thay đổi cấu trúc và mức độ tinh thể [105]. Bên cạnh đó,
sau xử lý bằng phương pháp nghiền, kích thước chitin thường giao động từ 50 µm đến 500
µm [27]. Do vậy, nghiền đã làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của chitin với enzym nên
giúp thủy phân tốt.

15


Chitin có kích thước khác nhau bị thủy phân bởi dịch enzym thô từ Aeromonas
hydrophila H-2330 trong thời gian 10 ngày thành NAG đạt hiệu suất thu nhận khoảng 64%
- 77%. Hầu hết NAG có độ tinh sạch 100% được sản xuất bởi dịch enzym này [129].
Ảnh hưởng giải pháp xử lý cơ học hoặc xử lý hóa học lên khả năng thủy phân chitin
được Kim và cs (1998) nghiên cứu so sánh và khẳng định chitin cua hoặc chitin tôm đã xử
lý hóa học (gel chitin) cho lượng NAG tạo thành cao hơn so với bột chitin cua hoặc tôm
kích thước từ 180 - 250 μm [67].
Cùng chung nồng độ cơ chất chitin và thời điểm thủy phân 24 h, chế phẩm chitinase
thô đã được cô đặc từ Penicillium monoverticillium CFR 2, từ Aspergillus flavus CFR 10
và từ Fusarium oxysporum CFR 8 thủy phân cơ chất gel chitin (chitin được xử lý bằng
phương pháp hóa học) thành NAG với nồng độ lần lượt 95,6; 96,6 và 96,1 mmol/l. Trong
khi đó, các chủng này lần lượt thủy phân cơ chất tinh thể α-chitin thành NAG đạt nồng độ
lần lượt 10,11; 6,85 và 10,7 mmol/l [147]
Trong số các dạng chitin (gel chitin, bột chitin kích thước khác nhau, chitin xử lý bởi
tiệt trùng với 1,0% dimethylacetamide, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 0,1% H2SO4), Kim và
cs (1998) cho rằng bột chitin kích thước 180 - 250 μm giúp Serratia mareescens sinh tổng
hợp chitinase cao nhất, nhưng kích thước < 180 μm hoặc > 250 μm làm giảm sinh tổng hợp
chitinase [67].
C). Xử lý bởi tác nhân vật lý
Phương pháp hấp và nổ hơi được sử dụng làm phồng hạt chitin, phương pháp này
tăng hiệu quả khi kết hợp với dimethyl acetimide, và H2SO4 nồng độ thấp (0,1%) để phá
vỡ liên kết hydro trong liên kết chuỗi chitin [51].
Nhiệt độ nổ hơi khoảng 160ºC đến 238ºC, giới hạn có thể lên tới 400ºC, sau thời gian
từ 1 đến 10 phút thì hơi được xả đột ngột bởi xilanh, tạo hiện tượng vỡ cấu trúc vật liệu,
làm khu vực tiếp xúc bề mặt tăng lên, có thể giúp phản ứng enzym tăng đến 10 lần so với
vật liệu không được xử lý. Cơ chế dựa vào giảm áp suất đột ngột, nguyên liệu bị nén và nổ
[46, 98].

Chitin đã được quan sát qua sự thay đổi cấu trúc sau nổ hơi cho thấy giảm 11,28%
các chỉ số tinh thể khi xử lý với tỷ lệ chitin/nước là 0,1 g/ml [43].
D). Xử lý bởi tác nhân bức xạ
Chiếu xạ bao gồm các tia gamma, chùm tia điện tử (electron), tia bức xạ lò vi sóng.
Vi sóng có tần số 0,3 - 300 GHz nằm giữa ranh giới tia hồng ngoại và bức xạ sóng
cao tần có thể chuyển hóa năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt thúc đẩy phản ứng
hóa học và phản ứng enzym [120].

16


Tia bức xạ có thể ưu tiên phân tách các liên kết glucoside trong chuỗi phân tử. Chiếu
xạ ở mức cao có thể dẫn đến sự phân hủy các oligosaccharide và các cấu trúc vòng
glucose. Tuy nhiên, các phương pháp chiếu xạ là tốn kém và khó khăn trong việc áp dụng
công nghiệp [98].
E). Xử lý bởi tác nhân sóng siêu âm
Sóng siêu âm gây biến dạng nén giãn môi trường làm cho các phân tử liên tục bị ép
lại và giãn ra dao động xung quang vị trí cân bằng dẫn đến sinh nhiệt. Lực tác động này đủ
lớn để thắng lực hút giữa các phân tử, tạo thành lỗ vi mô trên nguyên liệu. Nếu quá trình này
xảy ra trong nước thì những lỗ đó sẽ bị hơi nước hoặc các khí hoà tan choán đầy, hình thành
bóng bọt rồi dẫn đến hiện tượng vỡ bóng bọt, tạo nhiệt độ cao trong nguyên liệu [137].
Chitosan là dẫn xuất của chitin, xử lý siêu âm làm cấu trúc của nó thay đổi bằng cách
giảm liên kết hydro giữa các phân tử và nội phân tử và làm giảm trọng lượng phân tử do
tạo thành lỗ hổng và hiện tượng vỡ bóng bọt. Khi xử lý chitosan bằng siêu âm kết hợp hóa
chất giúp giảm 22,34% đến 27,26% khối lượng phân tử ban đầu, mức độ tinh thể giảm từ
19,16% xuống 9,04%. Có thể thấy nhiều yếu tố tác động lên cấu trúc tinh thể sẽ là hiệu quả
hơn nếu kết hợp các tác động khi xử lý. Tương tự siêu âm làm giảm mức độ tinh thể của
chitin và do vậy nâng cao hiệu quả thủy phân [43].
1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase
Chế phẩm chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân chitin

thành NAG cao nhất ở các điều kiện thủy phân khác nhau.
A). Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả năng thủy phân chitin thành NAG
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng thủy phân chitin thành NAG
bởi chitinase. Khoảng nhiệt độ thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase thành NAG chính
là khoảng giới hạn nhiệt độ hoạt động chitinase. Chitinase được sinh tổng hợp từ vi sinh
vật khác nhau sẽ có khoảng nhiệt độ hoạt động khác nhau. Ở nhiệt độ hoạt động tối ưu,
chitinase có khả năng thủy phân chitin thành NAG là cao nhất. Cụ thể: Nhiệt độ tối ưu cho
thủy phân cơ chất gel chitin thành NAG là 40ºC bằng chế phẩm chitinase thô từ chủng vi
sinh vật như Aeromonas sp. GJ-18 [74], Aspergillus sp [132], Penicillium sp LYG 0704
[80], Penicillium chrysogenum [107], hoặc bằng NAHase tinh sạch từ P. oxalicum [116,
118],... Chế phẩm chitinase từ Trichoderma harzianum có khả năng thủy phân chitin trong
khoảng nhiệt độ rộng từ 25 - 60ºC và nhiệt độ tối ưu cho thủy phân chitin thành NAG là
40ºC [59]. Ở nhiệt độ 37ºC, chế phẩm chitinase từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân
gel chitin thành NAG cao nhất đạt hiệu suất thu nhận 79% [57],..
Chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp chứa hoạt tính NAHase và chitobiosidase; ở
nhiệt độ trên 50ºC, NAHase bị vô hoạt, nhưng chitobiosidase lại ổn định. Nên ảnh hưởng
của nhiệt độ tới thủy phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp
17


đã được các nhà khoa học nghiên cứu. Kuk và cs (2015) cho rằng chế phẩm enzym thô từ
Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin ở nhiệt độ dưới 45ºC cho sản phẩm chính là
NAG, cùng với lượng nhỏ (NAG)2 và (NAG)3, nhưng nhiệt độ thủy phân trên 50ºC thì
(NAG)2 là sản phẩm chính [74]. Ngoài ra Kuk và cs (2005) cho rằng trong 120 h thủy
phân, ở nhiệt độ 45ºC, NAG là sản phẩm chính (chiếm 94%) với hiệu suất thu nhận đạt
74%, nhưng ở 55ºC thì (NAG)2 lại là sản phẩm chính (chiếm 86%) [73]. Trong 120 h thủy
phân, enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 thủy phân gel chitin cho sản phẩm tạo
thành gồm 74% NAG và 4,8% (NAG)2 ở nhiệt độ 45ºC, nhưng nhiệt độ 55ºC thì sản phẩm
tạo thành gồm 3,9% NAG, 34,7% (NAG)2 và 1,6% (NAG)3 [129].
B). Ảnh hưởng pH tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới trung tâm hoạt động của enzym. Chế phẩm
chitinase thô từ vi sinh vật có khả năng thủy phân cơ chất chitin thành NAG trong khoảng
pH nhất định và khả năng thủy phân này đạt cao nhất tại pH tối ưu. pH tối ưu cho sự thủy
phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym từ Aspergillus sp là pH 3,5 [132], bởi chế
phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 là pH 5 [74], bởi chế phẩm enzym thô từ
Aeromonas sp. PTCC 1691 là pH 8. Khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium
oxalicum thích hợp để thủy phân chitin là 4,5 - 6,5 [116].
C). Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới khả năng thủy phân chitin thành NAG
Ở tỷ lệ gel chitin/ enzym là 10 mg/U trong điều kiện tối ưu và giữ nồng độ enzym
không đổi, Kuk và cs (2005) cho rằng chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy
phân gel chitin thành NAG đạt HSTP lớn nhất 94,9% [74]. Jamialahmadi và cs (2011)
khẳng định ở điều kiện tối ưu và tỷ lệ gel chitin/enzym là 0,5 mg/U thì chế phẩm enzym
thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận
lớn nhất 79%; khi giữ nồng độ enzym không đổi, nồng độ cơ chất gel chitin tăng từ 5 đến
10 mg/ml thì HSTP ra NAG tăng mạnh, nhưng nồng độ gel chitin tăng thêm nữa lại làm
HSTP NAG giảm xuống [57]. Sukwattanasinitt và cs (2002) khẳng định ảnh hưởng nồng
độ cơ chất lên NAG tạo thành khi dùng hỗn hợp enzym (9:1 cellulase Ac và lipase An) như
sau: tăng nồng độ β-chitin và giữ nồng độ enzym không đổi dẫn đến hiệu suất thu nhận
NAG giảm xuống. Cụ thể nồng độ cơ chất tăng từ 10 đến 40 mg/ml làm hiệu suất thu nhận
NAG giảm một nửa từ 61% xuống 28%. Và điều này đã được giải thích rằng: nồng độ cơ
chất tăng làm tăng độ nhớt, dẫn đến giảm sự khuếch tán giữa enzym và cơ chất nên HSTP
NAG giảm [144].
D). Ảnh hưởng thời gian và nồng độ enzym tới khả năng thủy phân chitin thành
NAG
Thời gian thủy phân không những ảnh hưởng đến chi phí của quá trình mà còn ảnh
hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau thủy phân. Xác định thời gian thủy phân thích hợp
sẽ giúp tiết kiệm chi phí, nâng cao hiệu suất của quá trình.
18

Theo nghiên cứu của Pichyangkura và cs (2002), α-chitin và β-chitin có thể thủy
phân hoàn toàn với chitinase (EC 3.2.1.14) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) để
sản xuất NAG. Chitinase từ B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin và α-chitin tương ứng
trong vòng 24 h và 168 h cho hiệu suất thu nhận NAG lớn hơn 85%, trong khi đó chitinase
từ B. licheniformis SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h đạt hiệu suất thu nhận
NAG cuối cùng là 75% cùng 20% chitobiose [110].
Trong điều kiện thủy phân tối ưu, Kuk và cs (2005b) khẳng định chế phẩm chitinase
từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin thu nhận NAG với hiệu suất thu nhận NAG
83,0% và 94,9% tương ứng thời gian thủy phân 120 h và 216 h [74]. Bên cạnh đó, Kuk và
cs (2005a) cho rằng enzym thô từ Aeromonas sp thủy phân gel chitin thành NAG với hiệu
suất 74% trong 120 h thủy phân [73].
Hiệu suất thu nhận NAG khoảng 66% - 77% tại thời điểm 240 h thủy phân bột αchitin bởi chế phẩm enzym từ A. hydrophila H-2330 được công bố bởi Sashiwa và cs
(2002) [129].
Khi thủy phân chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym với nồng độ càng cao thì thời
gian thủy phân càng giảm. Để tiết kiệm thời gian và lựa chọn nồng độ enzym hợp lý, nhiều
nhà nghiên cứu đã khảo sát nồng độ enzym đối với các loại chế phẩm chitinase thô khác
nhau ảnh hưởng tới hiệu suất thủy phân chitin thành NAG trong khoảng thời gian khác
nhau như:
Kuk và cs (2005) cho rằng nồng độ enzym của chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas
sp. GJ-18 càng cao thì NAG tạo thành càng lớn khi cùng chung nồng độ cơ chất gel chitin;
tuy nhiên lượng NAG tạo thành không khác nhau đối với tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất
khoảng 10 U/100 mg và 8 U/100 mg; hiệu suất thủy phân gel chitin ra NAG tăng mạnh ở
120 h nhưng gần như không đổi sau 168 h [74].
Jamialahmadi và cs (2011) cho rằng ở điều kiện tối ưu, chế phẩm enzym thô từ
Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG lớn nhất khi tỷ lệ enzym/gel
chitin là 2 U/mg, hiệu suất thu nhận NAG tăng dần và đạt lớn nhất 79% tại thời điểm 24 h
nhưng sau đó gần như không đổi; trái lại không khác nhau khi tỷ lệ nồng độ enzym và cơ
chất từ 4 U/10 mg và 8 U/10 mg [57]. Ngoài ra Jung và cs (2007) công bố enzym thô từ
Paenibacillus illinoisensis KJA-424 thủy phân chitin thành NAG tăng liên tục trong 24 h
và đạt hiệu suất thu nhận NAG cao nhất 62,2% tại 24 h [60] .

Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin (bột chitin mai mực kích
thước 3 µm) và α-chitin (bột chitin vỏ cua kích thước 14 μm) thành NAG với hiệu suất thu
nhận hơn 85% trong thời gian tương ứng 24 h và 168 h. Chitinase từ Bacillus licheniformis
SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h, cho hiệu suất thu nhận NAG 75%. Ở tỷ lệ
enzym/cơ chất β-chitin là U/100 mg, B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin cho hiệu suất thu
nhận NAG 90% trong 24 h thủy phân [110].
19


Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất
từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ
Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu
nhận cao [19].
Jamialahmadi và cs (2011) công bố endochitinase và exochitinase trong dịch enzym
thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [57]; Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định
endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều
hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [129].
Để enzym thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao, thì chế phẩm
enzym phải chứa endochitinase với hoạt tính thấp và β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính
cao [9, 19, 148].

1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là quan trọng và
chiếm số lượng nhiều hơn cả. Nhiều nghiên cứu thu hồi dịch chitinase thô từ vi sinh vật
như: thu hồi dịch chitinase thô từ Bacillus licheniformis SK-1, Aeromonas hydrophila
H2330 [129], Aeromonas sp. GJ-18 [74]. Aspergillus niger, Carcica papaya L và
Acremonium cellulolyticus [128], Trichoderma viride [7], từ một số chủng nấm mốc như
Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum
CFR 8 [146],..
1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase

Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau trong
đất, phế thải giáp xác, khu vực bón phân, và dòng suối nóng [182]. Hầu hết chitinase được
tạo ra từ vi sinh vật - phân lập từ mẫu đất biển. Chitinase được tạo ra nhằm phân giải chitin
trong môi trường cung cấp nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
Nguồn vi sinh vật đáng kể có khả năng sinh tổng hợp chitinase là vi khuẩn. Chitinase
vi khuẩn tạo ra phần lớn từ họ Alteromonas [157], Bacillus (B. megaterium, B.
licheniformis, B. circulans,..) [99], Escherchia [166], Pseudomonas (P. aeruginosa , P.
maltophilia) [164], Serratia (S. marcescens, S. liquefaciens), Arthrobacter, Beneckea,
Enterobacter Chromobacterium, Klebriella, Clostridium (C. perfringens, C.
puraputrificum,..), Vibrio (V. fluvialis, V. harveyi, V. vulnificus).
Nguồn xạ khuẩn: Chitinase xạ khuẩn đại đa số được tạo ra từ họ Streptomycetes (S.
viridificans, S. aureofaciens, S. coelicolor, S. glaucescens, S. kanamycitis, S. lividans, S.
parvies và S. venezuelae) [44].
Nguồn nấm sợi: Chitinase từ nấm mốc phần lớn do họ Trichoderma và Aspergillus
(A. nidulans,…) sinh tổng hợp tạo ra, tiếp đó là Penicillium (P. citrinum [4], P.
janthinellum [36], P. aculeatum NRRL. 2129 [20], P. chrysogenum [107], Pencillium sp.
20


LYG 0704 [80], Aspergillus sp [132], Aeromonas sp. PTCC 1691 [57], A. hydrophila H2330 đều có khả năng sinh tổng hợp cả endochitinase và exochitinase [129], đặc biệt P.
oxalicum có khả năng sinh tổng hợp endochitinase [118] và NAHase [116]. Penicillium
monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 đều
sinh tổng hợp cả endochitinase và NAHase, tỷ lệ hoạt độ endochitinase so với NAHase là
thấp [146].
Penicillium aculeatum NRRL 2129 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao, nhưng
Trichoderma harzianum TUBF 927 lại sinh tổng hợp chitobiosidase hoạt tính cao [19].
Hiện nay, Penicillium có khả năng sinh tổng hợp hàng loạt các enzym ngoại bào [109].
1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase
Cacbon chiếm tỉ lệ trên 50% trọng lượng khô tế bào, nó tồn tại trong tế bào chất, ở
tất cả các phân tử của enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Ngoài nhiệm vụ

là nguồn cung cấp năng lượng, tạo thành những tiền chất, hợp chất cacbon còn tạo ra các
quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian
hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường
một vài sản phẩm sinh tổng hợp.
Nguồn cacbon là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi
sinh vật [48, 139].
Khi bổ sung glucose, tinh bột, lamanarin, β-glucan và glycerol vào môi trường lên
men thì sinh tổng hợp chitinase từ vi khuẩn bị ức chế. Nhưng đối với nấm mốc, sinh tổng
hợp chitinase lại tăng do thêm pectin, tinh bột, lamanarin, β-glucan. Sinh tổng hợp
chitinase ngoại bào từ Fusarium chlamydosporum với hoạt độ lớn nhất khi sử dụng
saccarose 10 mM [91]. Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase gấp 2 khi môi
trường chứa arabinose (trong số các loại đường pentose và hexose), nhưng chứa glucose lại
gây kìm chế sự tạo enzym này [44]. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Vibrio
alginolyticus ở 2 g/l glucose [104], từ Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase ở 2
g/l tinh bột [162].
Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan thì vi
sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng
chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít. Muốn thu được enzym thì cần phải có
chất cảm ứng. Chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitinase là chitin.
Dạng chất cảm ứng để sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật - phân lập ở đất biển có
thể là gel chitin, vỏ cua và vỏ tôm đã xử lý [34].
Nguồn cacbon trong môi trường lên men cạn kiệt thì P. oxalicum sinh tổng hợp cả
chitinase and β-N-acetylglucosaminidase. Môi trường lên men chứa cả glucose và 6 g/l gel

21


chitin thì β-N-acetylglucosaminidase có hoạt tính cao nhất. Chitinase được sinh tổng hợp
cao nhất khi môi trường lên men chứa glucose cùng NAG hoặc 2 g/l gel chitin [117].
Kim và Ji (2001) khẳng định bột chitin kích thước từ 180 - 250 µm giúp

Streptomyces griseus HUT 6037 sinh tổng hợp chitinase tốt hơn so với gel chitin [68].
Ngoài ra, Setthakaset và cs (2008) cho rằng trong số các dạng chitin cảm ứng như bột αchitin, β-chitin kích thước khoảng 50 μm – 100 μm, gel chitin thì dạng chất cảm ứng ảnh
hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ Aspergillus sp lớn nhất là dạng bột β-chitin, kém nhất
là bột α-chitin [132].
Gel chitin là dạng chất cảm ứng tốt nhất để Streptomyce cinereoruber lên men sinh
tổng hợp chitinase hoạt độ 20,7 U/ml. Ngoài ra, gel chitin cũng là chất cảm ứng tốt cho
Aspergillus niger sinh tổng hợp chitinase hoạt độ 16,4 U/ml [149]. Mahadevan và
Crawford cho rằng chủng Streptomyces sinh tổng hợp chitinase cao nhất khi nồng độ gel
chitin khoảng 0,8 - 1,4 g/l [89]. Saima và cs (2013) khẳng định Aeromonas hydrophila HS4
và A. punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao nhất lần lượt đạt 64,41 U/ml và
59,41 U/ml khi nồng độ gel chitin 0,3% [124].
Bacillius aminolquefaciens, B. megatrium và B. subtilis sinh tổng hợp chitinase ở
hoạt độ lần lượt 1,9 mU/l; 3,9 mU/l, 3,6 mU/l và 1,7 mU/l khi sử dụng chất cảm ứng 1%
chitin từ phế phẩm vỏ tôm; ngoài ra các chủng này sinh tổng hợp chitinase với hoạt độ cao lần
lượt là 2,7 mU/l; 3,4 mU/l; 2,2 mU/l và 4,3 mU/l ở chất cảm ứng 1% chitin thương mại [122].
Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Fusarium chlamydosporum ở nồng độ 0,5% gel
chitin [91], từ Aeromonas sp no. 16 ở nồng độ 1,5% gel chitin [55], từ Aeromonas sp. GJ18 ở 1% gel chitin [73], từ Streptomyces viridificans ở 1,5% gel chitin [44], từ Serratia
marcescens XJ-01 ở nồng độ 0,75% gel chitin [171], từ Streptomyces cinereoruber ở nồng
độ 5 g/l thành tế bào Aspergillus niger, từ A. carneus ở 10 g/l chitin, từ Cellulosimicrobium
cellulans 191 ở 15 g/l chitin [88], từ Vibrio alginolyticus ở 3 g/l chitin mai mực [104], từ
Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 3% phế thải vỏ tôm và cua và 0,1% carboxymethy
chitin [126].
Môi trường lên men chứa chất cảm ứng chitin 10% giúp nấm sợi P. oxalicum sinh
tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất [3].
1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase
Thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nitơ (Protein, axit nucleic, enzym,..).
Nitơ chiếm 10 - 15% trọng lượng khô. Nitơ tham gia cấu tạo protein như: axit amin,
glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan. Protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần
chất khô (phổ biến từ 60 - 85%). Protein giữ chức năng tham gia cấu trúc mọi bào quan của
tế bào, đặc biệt enzym giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở nấm sợi, trong

đó cả enzym deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [42].
22


Nguồn nitơ là cần thiết để đạt hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong lên men
sinh tổng hợp enzym. Các loại hợp chất nitơ mà nấm sợi có thể đồng hóa được thường là
cao nấm men (CNM), cao malt, cao ngô, và các nguồn nitơ vô cơ như NH4NO3,
(NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các
loài nấm tiếp hợp và ưa sử dụng nhất [138].
Nguồn nitơ là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh
vật [48, 139].
Trong sinh tổng hợp chitinase, nhu cầu nitơ về nồng độ và nguồn khác nhau đối với
từng chủng vi sinh vật. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Myrothecium verucaria trên
môi trường (g/l): cao nấm men, 0,5; pepton, 0,5. Đặc biệt bổ sung 0,03% urea thì tổng hợp
chitinase tăng gấp 4 [163]. Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi
môi trường chứa NaNO3 15 mM [91]. Aspergillus carneus sinh tổng hợp chitinase lớn nhất
ở môi trường chứa cao nấm men 3 g/l [134]. Aeromonas sp. GJ-18 sinh tổng hợp chitinase
ngoại bào cao nhất trong môi trường lên men chứa 1% tryptone [73].
Peptone 3% là nguồn nitơ tốt nhất để Pseudomonas stulzeri YPL-1 tạo chitinase
[53]. Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase cao nhất đối với Vibrio alginolyticus
chứa (g/l): pepton, 7,5 và cao nấm men, 2 [104]. 0,5% (NH4)2SO4 được xem là nguồn nitơ
tốt nhất cho Serratia marcescens XJ-01 sinh tổng hợp chitinase [171].
Môi trường lên men chứa hỗn hợp 4,0 g/l CNM và 2,0 g/l tryptone sinh tổng hợp
chitinase cao nhất đạt 6,9 U/ml từ Cellulosimicrobium cellulans 191 [88]. Alcaligenes
xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi môi trường lên men 4 g/l CNM [162].
Khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các loài Streptomyces tăng khi bổ sung
(NH4)2SO4 nhưng giảm khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [102]. Ngược lại
Bacillus licheniformis TH-1 sinh tổng hợp chitinase tăng khi bổ sung CNM vào môi trường
lên men [8] và B. pumilus [115, 154].
1.4.4. Ảnh hƣởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase

Ngoài nguồn cacbon, nitơ thì các nguyên tố khoáng cũng có tác dụng nhất định đối
với quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý tế
bào. Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lượng như Mn, Cu, Fe, Zn…được bổ
sung dạng muối vô cơ như KH2PO4, MgSO4… Mỗi nguyên tố khoáng có chức năng riêng
đối với vi sinh vật như photpho tham gia thành phần cấu tạo của axit nucleic, phophoprotein,
photpholipit và nhiều coenzym quan trọng như ATP, NADP, ADP…Các kim loại này đóng
vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase từ một số vi sinh vật [72, 102].
Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase lớn nhất từ Streptomyces cinereoruber,
từ Aspergillus niger đều cần lượng nhỏ các thành phần như: 0,2% K2HPO4, 0,1% MgSO4,
0,01% FeSO4. 7H2O [149]. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Cellulosimicrobium
23


cellulans 191 cần 4,0 g/l MgSO4.7H2O; 1,2 g/l KH2PO4; 2,8 g/l K2HPO4 [88], từ
Alcaligenes xylosoxydans cần K2HPO4 0,2%, MgSO4.7H2O 0,1% và FeSO4.7H2O 0,01%
[162], từ Vibrio alginolyticus cần K2HPO4, 2 g/l và nước biển, 75% (v/v) [104], từ
Aeromonas sp. GJ-18 cần 1% NaCl [73],...
Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và cấu hình của
enzym. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas
hydrophia HS4 và A. punctata HS6 đã được công bố bởi Saima và cs (2013). Khi bổ sung
một số ion kim loại vào môi trường thấy: Co2+ và Mn2+ giúp Aeromonas hydrophia HS4 và
A. punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase tăng; nhưng Ca2+ và Mg2+ gây ức chế Aeromonas
hydrophia HS4 sinh tổng hợp chitinase; Fe2+, Mg2+, và Hg2+ ức chế A. punctata HS6 sinh
tổng hợp chitinase [124].
Tương tự MnSO4 and FeSO4 đều đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase
từ Aspergillus terreus [41], cũng như từ B. pumilus [154].
Trong môi trường lên men, ở nổng độ Mg2+và PO43- thấp, Streptomyces sinh tổng
hợp chitinase tăng nhưng ở nổng độ Mg2+ và PO43- cao thì ngược lại [102]. PO43- đóng vai
trò quan trọng sinh tổng hợp chitinase từ Paenibacillus sp. D1 [139],..
1.4.5. Ảnh hƣởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase

pH môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
enzym của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH- tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất,
làm thay đổi sự vận chuyển chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi
trường. Nên những biến đổi dù nhỏ nhất nồng độ của chúng trong môi trường cũng gây
những biến đổi rõ rệt về khả năng sinh trưởng và phát triển sinh vật.
Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hưởng đến hệ enzym trong vi sinh vật, tham gia
hoạt động sống của vi sinh vật. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ vi sính vật
thường trong vùng axit yếu (từ 4,0 - 6,5), vùng trung tính (pH 7,0), một số ở vùng kiềm
yếu (từ 7,5 - 9,0). Tùy vào chủng vi sinh vật mà pH tối thích của nó khác nhau.
Môi trường bán rắn sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất từ nấm sợi ở khoảng
pH 4 - 6 như từ P. oxalicum ở pH 4,1 [3], từ P. chrysogenum ở pH 4 [107], từ Trichoderna
spp ở pH 5 [5], từ Aspergillus protuberus ở pH 5,5 [48].
Ở môi trường lỏng, lên men sinh tổng hợp chitinase hoạt tính lớn nhất đối với chủng
vi sinh vật ưa axit nhẹ pH từ 3,5 - 6 như từ Aspergillus sp ở pH 3,5 [132]; từ Trichoderma
harzianum ở pH 4,9 [35] hoặc ở pH 5,6 [63]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 [93], từ
Myrothecium verucaria [163], từ Nocardia orientalis đều ở pH 5 [161], từ Talaromyces
emersonii đều ở pH 5 [93], từ Alcaligenes xylosoxydans ở pH 6 [162], ...
Một số chủng sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trường trung tính như từ
Streptomyces cinereoruber, từ Aspergillus niger [149] và từ Pseudomonas stulzeri YPL-1
24


đều ở pH 6,8 [53]; từ Bacillus lichiniformis [152], từ Cellulosimicrobium cellulans 191, từ
Aeromonas punctata HS6 đều ở pH 7 [124],..
Ngoài ra chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường kiềm nhẹ
pH khoảng 7,5 - 9,0 như từ Vibrio alginolyticus ở pH 7,5 [104]; từ Serratia marcescens
[181], từ Aeromonas hydrophila HS4 đều ở pH 8,0 [124], từ Microbispora sp.V2 ở pH 8,5
[103], từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở pH 9,0 [126],....
1.4.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym

của vi sinh vật. Nhiệt độ từ 28 - 32ºC là tối ưu cho sự sinh trưởng của hầu hết vi sinh vật
[34], nhiệt độ tối đa là dưới 50ºC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh
trưởng, thậm chí làm vô hoạt sợi nấm nên quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế.
Sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 25ºC - 35ºC từ chủng vi sinh vật
như từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 25ºC, từ Streptomyces cinereoruber [149] cũng
như Myrothecium verucaria ở 28ºC [163], từ Fusarium chlamydosporum ở 28ºC [91], từ
Trichoderma harzianum ở 28ºC [63] và ở 30ºC [35], từ Streptomyces lividans [89] cũng
như S. viridificans [44] ở 30ºC, từ Aspergillus protuberus ở 30ºC [48], từ Aeromonas sp.
GJ-18 ở 30ºC [73], từ Paenibacillus sp. CHE-N1 ở 34,3ºC [62], từ Microbispora sp. V2
cũng như từ Alcaligenes xylosoxydans ở 35ºC [103],...
Khoảng nhiệt độ 37ºC - 40ºC là tối ưu cho sinh tổng hợp enzym đối với các chủng vi
sinh vật như Aspergillus sp ở 40ºC [134], Vibrio alginolyticus ở 37ºC [104]; đối với các
loài thuộc chi Aeromonas ở 37ºC [72]...
Saima và cs (2013) công bố nhiệt độ 37ºC là nhiệt độ tối ưu cho loài Aeromonas [72]
(như Aeromonas hydrophila HS4, A. punctata HS6,...) lên men sinh tổng hợp chitinase;
khả năng sinh tổng hợp chitinase từ A. punctata HS6 giảm ở nhiệt độ trên 40ºC và từ A.
hydrophila HS4 khi nhiệt độ trên 50ºC [124].
Ngoài ra một số chủng chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp chitinase ở nhiệt độ cao
như từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 45ºC [126], từ Pseudomonas aerogunisa K-187
ở nhiệt độ 45ºC [126], từ Bacillus lichiniformis ở 50ºC [152].
1.4.7. Ảnh hƣởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase
Khi thực hiện lên men, hầu hết vi khuẩn tổng hợp ra chitinase lớn nhất tại giờ thứ 72,
nhưng nấm mốc và xạ khuẩn tổng hợp chitinase lớn nhất ở khoảng giờ thứ 144 [34].
Lên men trong môi trường lỏng ở điều kiện tối ưu, các vi khuẩn như: Talaromyces
emersonii CBS81470 sinh tổng hợp lần lượt chitinase 1,5 mU/l trong bình tam giác nuôi
lắc 96 h và 2,3 mU/l ở bồn lên men 48 h [93]. Pseudomonas stulzeri YPL-1 sinh tổng hợp
chitinase lớn nhất đạt được sau 84 h lên men [53]. Serratia marcescens lên men theo mẻ
25