Đánh giá chất lƣợng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

`

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
----------------------------------

PHẠM THỊ OANH

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH
(Vigna radiata (L.) Wilczek)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
----------------------------------

PHẠM THỊ OANH

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH
(Vigna radiata (L.) Wilczek)

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 62.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH

THÁI NGUYÊN - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2010.
Tác giả luận văn

Phạm Thị Oanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Đại
học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều

kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Bích Nga - Phòng Miễn dịch học Viện Công nghệ Sinh học đã hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các kỹ thuật viên phòng
thí nghiệm Di truyền, Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Bộ môn Sinh học phân tử,
Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên.
Qua đây, tôi cũng xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác - Viện Nghiên
cứu Ngô đã cung cấp một số giống đậu xanh giúp tôi có thể thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình
ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tác giả luận văn

Phạm Thị Oanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
ABA

Abscisic Acid (Axit abxisic)

bp

Base pair (cặp base)

CTAB

Cetyltrimethyl-ammonium bromide

cs

Cộng sự

DNA

Deoxy ribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic)

EDTA

Ethylen Diamin Tetracetic Acid (Axit etylen diamin
tetraxetic)

HSP

Heat Shock Protein (Protein sốc nhiệt)

IPTG

Isopropylthio - β - D - galactosidase

Kb

Kilo base

LB

Luria and Bertani

LEA

Late embryogenesis abundant protein (Protein tích lũy với số
lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)

LTP

Lipid Transfer Protein (Protein vận chuyển lipit)

MGPT

Molecular chaperone (Môi giới phân tử)

NXB

Nhà xuất bản

PCR

Polymease Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PLC

Phospholipase C

RNA

Ribonucleic acid (Axit Ribonucleic)

TAE

Tris Acetate EDTA

X - gal

5 - brom - 4 - chlo - 3 - indolyl - β - D - galactosidase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Tên các bảng trong luận văn

Bảng
1.1
1.2

Trang

Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh
Diện tích, sản lượng, năng suất đậu xanh trên thế giới trong 5
năm gần đây

7
14

2.1

Các giống đậu xanh nghiên cứu

24

2.2

Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry

28

2.3

Trình tự cặp mồi nhân gen LTP

31

2.4

Thành phần phản ứng PCR

31

2.5

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

32

2.6

Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT

33

3.1

Một số đặc điểm hình thái của các giống đậu xanh nghiên cứu

36

3.2

Kích thước rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non

38

3.3

Hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu

40

3.4

3.5

3.6
3.7
3.8
3.9

Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh
nghiên cứu
Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm của giống
đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2
Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống
đậu xanh 044/ĐX06, HN 2
Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống
đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807
Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen
LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2
Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen
LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

43

46

52
54
55
56




DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN
Hình

Tên các hình trong luận văn

Trang

2.1

Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu

25

2.2

Đồ thị chuẩn định lượng protein theo Lowry

29

2.3

Sơ đồ vector pBT

33

3.1
3.2
3.3

Mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các
giống đậu xanh nghiên cứu
Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn

42
43

Mối tương quan giữa chỉ số chịu hạn và chiều dài rễ của các
giống đậu xanh nghiên cứu

44

3.4

Hình ảnh của 4 giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn

45

3.5

DNA tổng số của giống đậu xanh 044/ĐX06 và BG 3

46

3.6

Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP

47

3.7

Kết quả điện di DNA thu được từ kỹ thuật thôi gel

48

3.8

Hình ảnh khuẩn lạc

49

3.9

Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR

50

3.10
3.11
3.12

3.13

3.14

Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của
giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2
Trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 giống đậu xanh nghiên cứu
So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh
044/ĐX06 và HN 2 với trình tự đã công bố AY300807
So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở
giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2

So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở
giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

50
51
53

55

56




MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính
trong nhóm các cây đậu ăn hạt. Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọng
trong nền nông nghiệp của nhiều nƣớc, trong đó có Việt Nam [7], [11].
Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm,
đáp ứng nhu cầu về dinh dƣỡng của con ngƣời và vật nuôi mà còn có tác dụng
cải tạo và bồi dƣỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố
định đạm sống cộng sinh [4], [5].
Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có
khả năng chịu hạn kém và thƣờng bị nhiễm một số bệnh nhƣ: sâu keo, sâu xanh…
Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về đậu
xanh đã tiếp cận phân tích các đại phân tử protein và DNA nhƣ: nghiên cứu
tính đa hình protein của các giống đậu xanh địa phƣơng bằng kỹ thuật phân

tích thành phần điện di protein dự trữ trong hạt, nghiên cứu hiện tƣợng đa
dạng DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên [6], [10], [17]. Một số nghiên cứu về
khả năng chịu hạn đã đƣợc tiến hành trên một số loại cây trồng nhƣ đậu
tƣơng, ngô, lúa… [1], [2], [9]. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính
chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen
LTP (Lipid Transfer Protein).
LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì. Khi gặp stress hạn,
LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nƣớc nhờ
tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan
giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng
chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đánh giá chất lƣợng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector
chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá chất lƣợng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông qua
phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh.
- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một số
giống đậu xanh.
- Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn.
3. Nội dung nghiên cƣ́u

- Phân tích một số đặc điểm hình thái nhƣ: màu gốc thân mầm, màu vỏ
hạt, hình dạng hạt, khối lƣợng 1000 hạt, chiều dài thân và rễ của các
giống đậu xanh thu thập đƣợc ở giai đoạn cây non.
- Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lƣợng lipid, protein tan tổng số
của các giống đậu xanh thu thập đƣợc.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh thu thập đƣợc ở
giai đoạn cây non.
- Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh.
- Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
- Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất.
- Xác định trình tự gen LTP.
- Phân tích cấu trúc gen LTP.
4. Ý nghĩa khoa học
Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanh
mang gen LTP.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2




CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh
Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), có bộ NST 2n = 22,
là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn
Độ, đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các
nƣớc Đông và Nam Á. Dạng dại của V. radiata cũng đƣợc tìm thấy ở

Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dƣơng, Đông Phi [11].
Phân loại khoa học của cây đậu xanh:
- Giới (regnum): Plantae
- Ngành (division): Magnolyophita
- Lớp (class): Magnolyopsida
- Bộ (order): Fabales
- Họ (Familia): Fabaceae
- Chi (genus): Vigna
- Loài (species): V. radiata
Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng
150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron;
Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số
16 loài của phân chi Ceratotropis [5].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và
hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.
 Đặc điểm của rễ
Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ
chính thƣờng ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn
sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thƣờng gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....