Thực hành hóa sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CHẾ BIẾN
BỘ MÔN HÓA – VI SINH

THỰC HÀNH HÓA SINH HỌC
(Tài liệu lưu hành nội bộ)
Th.S: Phạm Thị Mai

Nha Trang 2011


BÀI 1. SACCARIT
Saccarit (hay còn gọi là glucid hay cacbohydrat) là một trong những thành
phần quan trọng của cơ thể sinh vật. Nó vừa cung cấp năng lượng vừa có vai trò
cấu trúc và bảo vệ cơ thể.
Dựa vào cấu trúc người ta phân saccarit thành các nhóm: monosaccarit;
disaccarit; polisaccarit. Dựa vào tính chất hóa học đặc trưng của từng loại
monosaccarit (andoz hoặc xetoz) mà có thể thực hiện các phản ứng hóa học để
định tính hoặc định lượng chúng. Trong đó phản ứng quan trọng được dùng
nhiều là phản ứng khử các ion kim loại. Polisaccarit là do các monosaccarit liên
kết với nhau tạo thành. Do đó tính chất hóa học của các đơn phân, sự liên kết
giữa các đơn phân quyết định tính chất hóa học của các loại polisaccarit.
Có nhiều phương pháp để định tính và định lượng saccarit, trong giáo
trình này sẽ giới thiệu một số phản ứng định tính và định lượng quan trọng của
saccarit.
I. MỤC TIÊU
Sau khi học xong bài sinh viên cần đạt được các mục tiêu sau:
- Biết cách pha hóa chất, thao tác thí nghiệm thành thạo
- Biết tự bố trí thí nghiệm, giải thích các hiện tượng thí nghiệm
- Áp dụng quy tắc của thí nghiệm vào các trường hợp thực tế cụ thể
II. CÔNG VIỆC SINH VIÊN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI LÊN LỚP

- Đọc kỹ lại phần lý thuyết có liên quan
- Đọc trước các thao tác và cách bố trí thí nghiệm.
III. MỘT SỐ THÍ NGHIỆM GIỚI THIỆU
1. Phản ứng của Glucose với thuốc thử Fehling
1.1. Nguyên lý
Trong thuốc thử fehling Cu2+ ở dạng kết hợp với muối kali natritactrat sẽ
bị monosaccarit hoặc disaccarit khử thành Cu+.


1.2. Dụng cụ, hóa chất và các bước tiến hành thí nghiệm
* Hóa chất:
- dung dịch Glucoz 1%
- Thuốc thử Fehling
* Cách pha hóa chất: Thuốc thử Fheling gồm 2 thành phần: Fehling A và
Fehling B. Cách pha như sau:- Dung dịch Fehling A: Hòa tan 40g CuSO4.5H2O trong nước cất, định mức đến
1 lít.
- Dung dịch Fehling B: Hòa tan 20g kalinatritactrat (C4H4O6NaK.4H2O và 150g
NaOH bằng nước cất, định mức đến 1 lít.
Pha thuốc thử A với thuốc thử B theo tỷ lệ 1:1, lắc đều thu được dung
dịch trong, màu xanh biếc. Đó là thuốc thử Fehling (chú ý chỉ pha thuốc thử
ngay trước khi dùng).
* Các bước tiến hành thí nghiệm
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống: 1ml glucoz 1% + 1ml thuốc thử
Fehling.
Đun ống 1 khoảng 10 phút trên nồi cách thủy đang sôi (hoặc đun đến vừa
sôi trên ngọn lửa đèn cồn). Ống 2 để ở nhiệt độ phòng.
Quan sát kết quả, so sánh hiện tượng và giải thích
2. KIỂM TRA TÍNH KHỬ CỦA MỘT SỐ DISACCARIT
2.1. Nguyên lý
Disaccarit gồm 2 monosaccarit cấu tạo nên. Tùy vào công thức cấu tạo

(cách kết hợp giữa hai monosaccarit) mà các disaccarit có tính chất hóa học khác


nhau, có tính khử hoặc không có tính khử. Một số disaccarit phổ biến là:
saccarose, lactose, mantose.
Saccarose là disaccarit gồm 2 monosaccarit cấu tạo nên là -D-Glucose
và -D-Fructose. Mantoz (đường mạch nha), được cấu tạo từ 2 phân tử -DGlucoz. Lactoz (đường sữa) là disaccarit được cấu tạo nên từ một phân tử -Dgalactoz và -D-Glucoz. Bằng cách tiến hành thí nghiệm hãy kết luận disaccarit
nào có tính khử.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành thí nghiệm
* Dụng cụ: chuẩn bị ống nghiệm sạch, pipet, nồi cách thủy
* Hóa chất: thuốc thử Fehling (pha như trên), dung dịch HCl đặc, dung dịch
saccarose 1%, mantose 1%, lactose 1%
* Cách tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm 1:
Lấy 3 ống nghiệm sạch, đánh số để nhận biết, cho vào mỗi ống 1ml dung
dịch disaccarit tương ứng + 1ml dung dịch Fehling. Đun 3 ống nghiệm trên nồi
cách thủy đang sôi khoảng 10 phút. Lấy ra quan sát, so sách hiện tượng, kết luận
đường nào có tính khử? giải thích?
Thí nghiệm 2
Sau khi tiến hành thí nghiệm 1. Tiến hành làm thí nghiệm 2 với những
đường không thể hiện tính khử trong thí nghiệm 1.
Thí nghiệm với mỗi loại đường cần 2 ống nghiệm sạch. Cho vào mỗi ống
1ml dung dịch đường cần làm thí nghiệm. Ống 1 cho thêm 3 giọt nước cất, ống
2 cho thêm 3 giọt HCl đặc. Đun hai ống nghiệm trên nồi cách thủy đang sôi
khoảng 10 phút. Lấy ra cho thêm vào mỗi ống 1-2ml dung dịch Fehling, tiếp tục
đun trên nồi cách thủy khoảng 5-10 phút. Lấy ra quan sát hiện tượng và giải
thích.
3. Kiểm tra tính khử của tinh bột
3.1. Nguyên lý
Tinh bột thuộc nhóm polisaccarit, đơn phân cấu tạo nên nó là Glucoz. Khi

có tác nhân xúc tác thích hợp tinh bột sẽ bị thủy phân tạo thành các đơn phân.


Tinh bột có thể bị thủy phân trong môi trường axit khi đun nóng hoặc bởi xúc
tác của các enzyme đặc hiệu.
3.2. Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành thí nghiệm
* Dụng cụ: chuẩn bị 3 ống nghiệm sạch, pipet, nồi cách thủy
* Hóa chất: thuốc thử Fehling (pha như trên), dung dịch HCl đặc, dung dịch tinh
bột 1%.: hòa tan 1g tinh bột trong một ít nước cất, thêm vào nước cất khoảng
800C, khuấy đều, tiếp tục đun sôi, để nguội, thêm nước cất đến 100ml.
* Cách tiến hành thí nghiệm
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dung dịch tinh bột 1%. Ống 1 cho
thêm 3 giọt nước cất, ống 2 cho thêm 3 giọt HCl đặc, ống 3 cho thêm 1ml dịch
enzyme (nước súc miệng). Đun ống 1, 2 trên nồi cách thủy đang sôi khoảng 30
phút; ống 3 để ở nhiệt độ phòng (hoặc ủ ở 370C) 30 phút. Lấy 2 ống nghiệm ra,
cho vào cả 3 ống, mỗi ống 1ml dung dịch Fehling. Đun 3 ống trên nồi cách thủy
10 phút. Quan sát hiện tượng, kết luận và giải thích hiện tượng.
4. PHẢN ỨNG CỦA TINH BỘT VỚI IOD
4.1. Nguyên lý
Tính chất hóa học đặc trưng của tinh bột là tạo phức màu xanh với iod.
Tính chất này do thành phần amiloz của tinh bột quyết định. Màu xanh này có
thể bị mất đi khi đun nóng và được hồi phục lại sau khi làm lạnh. Tuy nhiên nếu
đun nóng quá mạnh đến mức dung dịch trắng hoàn toàn thì màu xanh đó sẽ
không hồi phục được dù có làm lạnh dung dịch.
4.2. Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành thí nghiệm
* Dụng cụ, hóa chất
* Dụng cụ: 1 ống nghiệm sạch, đèn cồn
*Hóa chất: thuốc thử Liugon, dung dịch tinh bột 1%.
* Cách làm: cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc
thử Liugon, quan sát màu và giải thích.

Đun nóng hỗn hợp trên trên đèn cồn đến khi dung dịch vừa mất màu xanh
đen, lấy ra làm lạnh, quan sát và giải thích.
Tiếp tục đun trên ngọn lửa đèn cồn, lần này kỹ hơn (sau khi dung dịch
mất mầu đun tiếp khoảng 5 phút hoặc đun trên nồi cách thủy đang sôi khoảng 40


phút), lấy ra làm lạnh, quan sát màu và giải thích. Tiếp tục cho thêm 1- 2 giọt
Liugon vào ống nghiệm  quan sát màu và giải thích hiện tượng.
5. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND
a) Cơ sở lý thuyết của phương pháp
Tất cả các đường có nhóm andehit hay nhóm xeto tự do, trong những điều
kiện nhất định có khả năng tham gia vào phản ứng oxi hóa – khử với ion kim
loại được gọi là đường khử.
Phương pháp này dựa trên khả năng khử dung dịch Cu2+ trong môi trường
kiềm để định lượng các loại andoz hay xetoz hay các disaccarit có tính khử. Quá
trình định lượng đường khử được tiến hành lần lượt theo các bước sau:
- Đun dung dịch kiềm của Cu2+ (dung dịch Fehling) với dung dịch đường
để tạo thành Cu2O.
- Sau khi rửa sạch, kết tủa Cu2O được hòa tan bằng dung dịch sắt III sunfat.
Phản ứng xảy ra như sau:
Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
- Chuẩn độ Fe2+ bằng dung dịch KMnO4 0,1N:
10FeSO4 + 2KMnO4 +8H2SO4 = 5 Fe2(SO4)3 + K2SO4 + MnSO4 + 8H2O.
Chuẩn độ Fe2+ bằng dung dịch KMnO4 0,1N. Từ lượng KMnO4 chuẩn độ
tính được lượng đồng (Cu2O). Đối chiếu vơi bảng Bertrand sẽ tính được lượng
đường tương ứng. Bảng Bertrand đã được thành lập dựa vào thực nghiệm.
b) Tiến hành thí nghiệm
- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Fehling đã có công thức pha trong
dung dịch KMnO4 0,1N; dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4.
- Cách làm:

 Chuẩn bị dịch đường khử: Cân một lượng chất thử đã nghiền nhỏ (ghi lại
khối lượng cân được), cho nước tiếp tục nghiền. Sau đó dồn tất cả vào cốc thủy
tinh và đun cách thủy ở 800C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều trong khi đun,
đem ra kết tủa protein bằng chì axetat. Loại axetat bằng Na2HPO4 hoặc Na2SO4.
Sau đó lọc qua giấy lọc và đo thể tích dịch lọc thu được. Dịch này được sử dụng
để định lượng đường khử.


 Cho vào bình tam giác 10ml dịch lọc + 20ml hỗn hợp Fehling. Đậy bình
bằng một miếng kính và đặt trên bếp điện đun sôi nhanh và đều. Đun đúng 3
phút kể từ khi xuất hiện bọt đầu tiên.
 Làm lạnh, lọc qua giấy lọc Buchner với 2 lớp giấy lọc dày. Chú ý giữ kết
tủa lại trong bình và trên lớp oxit (ở trên giấy lọc cũng như trong bình) phải luôn
có lớp nước để Cu2O không bị oxi hóa bới oxi không khí
 Đặt phễu Buchner trên bình nón có chứa kết tủa. Đổ vào phễu 15ml dung
dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4 để cho chảy từ từ xuống bình, lắc, quan sát xem kết
tủa trong phễu và trong bình đã hòa tan hết chưa, nếu chưa tiếp tục thêm một ít
dung dịch Fe2(SO4)3. Sau khi phản ứng kết thúc, rửa phễu bằng nước nóng cho
đến khi nước rửa không còn phản ứng axit trên giấy quỳ.
 Chuẩn độ dung dịch trong bình (Fe2+) bằng dung dịch KMnO4 cho đến khi
xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây
- Tính kết quả: Từ lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ tìm ra lượng đồng. Từ
lượng đồng tra bảng tìm thấy lượng đường tương ứng. Từ kết quả đó tính %
đường theo dung dịch:
X(mg%) 

a.100
20

a- Số mg đường nhận được

IV. VIẾT BÁO CÁO
SV viết báo cáo trình bày quá trình làm thí nghiệm, kết quả thu được, tính
toán và giải thích hiện tượng.


BÀI 2: LIPIT (Glyceride)
Lipit là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không tan trong nước, tan
trong các dung môi hữu cơ không phân cực như: clorofom, ete, xăng, benzen…
Lipit được chia thành 2 nhóm chính là Lipit đơn giản và lipit phức tạp. Sau đây
là một số phương pháp định tính Lipit.
Mỡ trung tính là ete của glixerol và axit béo cao. Tùy theo thành phần
axit béo trong phân tử mà mỡ tồn tại ở trạng thái lỏng hay rắn ở nhiệt độ thường.
1. Tính tan và sự tạo thành nhũ tương của mỡ
- Dụng cụ: chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch
- Hóa chất: dầu thực vật, etanol, xăng, dung dịch xà phòng.
- Cách tiến hành thí nghiệm: đánh số thứ tự cho các ống nghiệm. Lần lượt cho
vào mỗi ống 2ml nước, 2ml etanol, 2ml xăng, 2ml dung dịch xà phòng. Thêm
vào mỗi ống vài giọt dầu thực vật, lắc đều, quan sát hiện tượng, so sánh tính tan
và sự tạo nhũ tương của dầu thực vật trong các loại dung môi và giải thích.
2. Phản ứng phân biệt các thành phần cấu tạo của mỡ
a) Phản ứng xà phòng hóa
Dưới tác dụng của kiềm, mỡ bị thủy phân tạo thành glixerin và axit béo. Các
axit béo sẽ phản ứng với xút để tạo thành xà phòng.
- Hóa chất: dầu ăn, dung dịch NaOH 40% trong cồn
- Cách tiến hành thí nghiệm: cho vào cốc mỏ 50ml: 2ml dầu ăn + 10ml
dung dịch NaOH 40% trong cồn. Vừa đun vừa khuấy khoảng 15 – 20
phút đến khi thấy váng màu vàng nhạt. Lấy đũa thủy tinh vớt một ít váng
cho vào ống nghiệm, thêm nước cất, lắc mạnh thấy bọt xà phòng.
b) Sự tạo thành axit béo tự do
Xà phòng là muối của axit béo. Dưới tác dụng của axit vô cơ đặc, axit béo

được giải phóng, không tan trong nước mà nổi trên mặt nước.
- Hóa chất: Dung dịch xà phòng 2%, H2SO4 đặc hoặc HCl đặc.
- Cách tiến hành thí nghiệm: cho vào bình tam giác 20ml dung dịch xà
phòng, thêm H2SO4 đặc hoặc HCl đặc cho tới khi môi trường có pH axit
(thử bằng giấy quỳ). Dung dịch trở nên đục do axit béo được giải phóng.


Đun dung dịch tới sôi axit béo sẽ nổi trên mặt nước (hoặc đun dung dịch
trong nồi cách thủy khoảng 30 phút)
3. Xác định một số chỉ số của lipit
a) Xác định chỉ số axit
- Chỉ số axit là tổng số mg KOH cần thiết để trung hòa các axit béo tự do có
trong 1g lipit. Chỉ số này đánh giá độ tươi của mỡ, dầu. Chỉ số này tăng theo
thời gian bảo quản dầu mỡ.
- Cách làm: Cân chính xác 1g dầu ăn vào ống thủy tinh, thêm 10ml cồn để hòa
tan axit béo tự do (có thể đun hỗn hợp trên trong nồi cách thủy để hòa tan hoàn
toàn axit béo tự do). Sau đó cho vài giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ axit béo tự
do bằng KOH 0,01N cho đến khi có màu hồng nhạt.
Chỉ số: XA = A.f.0,56
Trong đó:

0,56 : Số mg KOH tương ứng với 1ml KOH 0,01N
A

: Số ml dung dịch KOH đã dùng

f

: Hệ số hiệu chỉnh dung dịch KOH 0,01N

b) Xác định chỉ số xà phòng hóa
- Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH cần thiết để trung hòa axit béo tự do và
axit béo có trong liên kết este của gliceride.
- Hóa chất: Dầu ăn; dung dịch KOH 0,5N; phenolphtalein; HCl 0,5N
- Cách làm: Lấy một bình tam giác 50ml, cho vào đó 1g dầu ăn, thêm 10ml
KOH 0,5N trong cồn. Đậy bình bằng tấm kính, đun bình trên nồi cách thủy
khoảng 50 – 60 phút. Phản ứng được xem như kết thúc khi dung dịch trong bình
trở nên trong suốt. Sau khi xà phòng hóa xong, lấy bình ra làm nguội và cho
thêm vào bình vài giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,5N.
- Tính kết quả: 1ml dung dịch KOH 0,5N tương ứng với 28mg KOH. Lượng mg
KOH đã dung để trung hòa tất cả các axit béo trong 1g dầu đã thí nghiệm là:
X(mg) =
Trong đó:

15  B .28
a

15- Lượng KOH 0,5N ban đầu
B- Lượng HCl 0,5N đã dùng để chuẩn độ


a: Khối lượng dầu lấy làm thí nghiệm (tính bằng g) (trong
TN trên a=1)
4. Định lượng Liptit bằng phương pháp Soxlet
- Nguyên liệu và hóa chất: Mẫu cần định lượng Lipit; Ete ethylic đã loại
nước và Peroxyd.
- Dụng cụ: Cối xay sứ, giấy Whatman số 1, bộ Soxlet, cân, bình hút ẩm.
- Cách làm: Nguyên liệu được xấy khô đến trọng lượng không đổi ở 1001050C. Cân chính xác mg mẫu (VD m=5, có thể thêm 5-10g Na2SO4 hoặc
Na2HPO4 đã được sấy khô ở nhiệt độ 100-1050C trong 6-8h). Giã nhỏ và chuyển
vào bột mẫu vào trong túi giấy. Cho dung môi vào bình cầu (khoảng 1/3 thể tích

bình cầu), đặt gói nguyên liệu vào bộ phận chính trong Sexlet. Lắp ống sinh hàn,
sau đó đặt thiết bị vào nồi cách thủy (34-360C) cho đến khi chiết rút hết lipit ra
khỏi mẫu (6-8h). Sau khi chiết rút xong, lấy gói mẫu ra sấy ở 20 -300C để loại
dung môi, rồi sấy ở 100-1050C cho đến khi trọng lượng không đổi.
Chú ý: Thí nghiệm phải thực hiện trong tủ hút. Sau khi thí nghiệm xong, ete
dư sẽ được chưng cất thu hồi để sử dụng lần sau.
- Kết quả: Lượng chất béo có trong 100g nguyên liệu tính theo công thức:
X

 A  B .100
C

A- Trọng lượng gói nguyên liệu trước khi chiết rút lipit (g)
B- Trọng lượng gói nguyên liệu sau khi chiết rút lipit (g)
C- Lượng nguyên liệu lấy ra để xác định Lipit


Bài 3. VITAMIN
Vitamin hay còn gọi là sinh tố, bao gồm các chất hữu cơ với khối lượng
phân tử thấp, có bản chất hóa học rất khác nhau, có hoạt tính sinh lý, dù với một
lượng rất nhỏ nhưng nó đảm bảo hoạt động sống bình thường của cơ thể.
Dựa vào tính tan của Vitamin có thể chia thành các nhóm: Vitamin tan
trong nước, Vitamin tan trong chất béo….
Do có bản chất hóa học khác nhau nên mỗi Vitamin có phản ứng hóa học
đặc trưng, những phản ứng đó dùng để phân tích định tính và định lượng
Vitamin.
A. Vitamin hòa tan trong chất béo
1. Vitamin A (Retinol)
a) Phản ứng với H2SO4. Khi tác dụng với H2SO4 đặc, Vitamin A bị mất nước
tạo thành sản phẩm có màu xanh tím không bền, sau đó chuyển thành sản phẩm

có mầu nâu đỏ (mầu đặc trưng của lipocrom)
- Nguyên liệu và hóa chất: Dầu cá, H2SO4 đặc, clorofom hoặc benzen hoặc
xăng.
- Cách tiến hành thí nghiệm: cho vào ống nghiệm khô 2 giọt dầu cá, 2ml
benzen hoặc clorofom hoặc xăng, lắc tan, thêm một vài giọt H2SO4 đặc, lắc,
quan sát hiện tượng và giải thích.
b) Phản ứng của Vitamin A với FeSO4
Trong môi trường axit Vitamin A tác dụng với FeSO4 tạo thành hợp chất
màu xanh, chuyển sang màu hồng đỏ. Chất tiền Vitamin A (carotenoit) cũng cho
phản ứng này nhưng sản phẩm có màu xanh lục.
- Nguyên liệu và hóa chất: dầu cá, H2SO4 đặc, axit axetic đặc có chứa
FeSO4 bão hòa.
- Cách tiến hành thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm vài giọt dầu cá, thêm 5
-10 giọt axit axeitc đặc chứa FeSO4 bão hòa; 1-2 giọt H2SO4 đặc, quan sát
màu và giải thích
c) Phản ứng của Vitamin A với SbCl3


Vitamin A tác dụng với SbCl3 bão hòa trong clorofom bị mất nước tạo
thành sản phẩm ngưng tụ có mầu không ổn định.
- Nguyên liệu và hóa chất: dầu cá, SbCl3 bão hòa trong Clorofom không
ngậm nước.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm khô 2 giọt dầu cá, 1ml SbCl3 bão hòa
trong Clorofom. Quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm, giải thích
kết quả.
2. Vitamin D
a) Phản ứng của Vitamin D với anilin
Vitamin D trong môi trường axit sẽ tác dụng với anilin tạo thành hợp chất
có màu đỏ đặc trưng.
- Nguyên liệu và hóa chất: dầu cá, clorofooc, anilin. Chuẩn bị thuốc thử

anilin như sau: trộn anilin với HCl đặc theo tỷ lệ 15:1.
- Cách làm: cho 4 giọt dầu cá vào ống nghiệm sạch, khô, cho thêm 1ml
clorofom, vài giọt anilin, lắc đều, quan sát sự tạo thành các thể nhũ có
màu trong ống nghiệm. Đun sôi hỗn hợp phản ứng trong 30 giây, dung
dịch sẽ chuyển thành màu đặc trưng.
b) Phản ứng của Vitamin D với SbCl3
- Nguyên liệu và hóa chất: dầu cá 10% tan trong Clorofooc, dung dịch
SbCl3 21-23% trong clorofooc, anhidrit axetic (CH3CO)2O.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm sạch khô 3 – 5ml dung dịch dầu cá, thêm
vào 8-10 giọt anhidrit axetic, lắc đều và thêm vài giọt SbCl3. Lắc đều và
quan sát sự xuất hiện màu vàng hoặc vàng da cam.
3. Vitamin E (Tocophenol)
a) Phản ứng với HNO3
Vitamin E phản ứng với HNO3 tạo thành o-tocopheril-quinon màu đỏ hoặc màu
vàng đỏ.
- Hóa chất: Vitamin E 0,15% trong etanol tuyệt đối hay trong butanol,
HNO3 đặc.


- Cách làm: Cho vào ống nghiệm vài giọt Vitamin E, sau đó thêm từ từ 810 giọt HNO3 đặc và lắc nhẹ ống nghiệm. Sau 1-2 phút quan sát sự đổi
màu.
b) Phản ứng với FeCl3
Vitamin E có thể khử FeCl3 thành FeCl2 sau đó ion Fe2+ phản ứng với ophenantrolin để tạo thành ion Fe(C12H8N2)32+, do đó dung dịch chuyển thành
màu đỏ.
- Hóa chất: Vitamin E 0,15% trong etanol tuyệt đối, FeCl3 0,2% trong
etanol, o-phenantrolin 0,5% trong etanol.

- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch Vitamin E, thêm vào 1ml
dung dịch o-phenantrolin và 1-2 giọt FeCl3, lắc quan sát màu tạo thành,
giải thích kết quả.

4. Vitamin K
Về mặt cấu tạo Vitamin K đều có chứa 2-metyl-1,4-naphtoquinon
(metinon), vì vậy các phản ứng của Vitamin K đều dựa trên phản ứng của nhân
này.
a) Phản ứng với anilin
Metinon tác dụng với anilin tạo thành 2-metyl-3-phenylamino-1,4naphtoquinon có màu đỏ đặc trưng. Phản ứng xảy ra như sau:


- Hóa chất: Dung dịch Vitamin K 0,1% trong etanol tuyệt đối, thuốc thử
anilin
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml Vitamin K, thêm 6-8 giọt thuốc thử
anilin, lắc đều. Quan sát màu của hỗn hợp và giải thích.
b) Phản ứng với xistein
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Vitamin K 0,1%, xistein 0,03%,
NaOH 5%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml Vitamin K, thêm vài giọt xistein
0,03% và 5-6 giọt NaOH 5%, lắc đều. Quan sát màu của dung dịch và giải
thích.
B. CÁC VITAMIN HÒA TAN TRONG NƯỚC
1. Vitamin B1 (Tiamin)
a) Phản ứng tạo thành tiocrom
Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của ferixianua K3[Fe(N)6], tiamin
bị oxi hóa thành tiocrom. Hợp chất này sẽ phát huỳnh quang có màu đặc trưng
dưới ánh đèn tử ngoại. Phản ứng xảy ra như sau:


- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Vitamin B1 1%, NaOH 10%,
K3[Fe(N)6] 1%, cồn izobutylic.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch Vitamin B1, thêm 10
giọt dung dịch NaOH 10% và 5 giọt, K3[Fe(N)6] 1%, để yên, hỗn hợp

trong ống tạo thành hai lớp ngăn cách. Để ống nghiệm dưới ánh sáng mặt
trời hoặc dưới ánh đèn tử ngoại. Quan sát sự tạo thành huỳnh quang. Giải
thích kết quả nhận được.
b) Phản ứng với thuốc thử diazobenzensunfonic (thuốc thử diazo)
Vitamin B1 phản ứng với axit diazobenzensunfonic sẽ tạo thành hợp chất
có màu da cam hoặc màu đỏ.
- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Vitamin B1 1%, thuốc thử diazo,
NaOH 10%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml thuốc thử diazo, thêm vài giọt dung
dịch Vitamin B1 1% và 5-7 giọt NaOH10%, lắc đều. Quan sát màu và giải
thích.
2. Phản ứng của Vitamin B2 (riboflavin)
a) Phản ứng khử
Riboflavin tồn tại ở dạng oxi hóa và dạng khử. Ở dạng khử có tên là
lowcoflavin không mầu, dễ bị oxi hóa thành Riboflavin


- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Riboflavin 0,015% (giữ trong tối),
HCl đặc. Zn kim loại.
- Cách làm: cho vào ống nghiệm 1ml Dung dịch Riboflavin 0,015%, 10
giọt HCl đặc, 1 viên Zn, lắc nhẹ, quan sát hiện tượng. Giải thích hiện
tượng quan sát được
b) Phản ứng với AgNO3
Trong môi trường trung tính hay axit yếu (pH = 6,5 – 7,2), riboflavin phản
ứng với AgNO3 tạo thành hợp chất hồng hay đỏ.
- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Riboflavin 0,015% (giữ trong tối),
AgNO3 (bảo quản trong lọ nâu).
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml Dung dịch Riboflavin 0,015%, thêm
0,5 ml AgNO3, quan sát sự xuất hiện màu hồng hay đỏ (cường độ màu
phụ thuộc vào nồng độ riboflavin trong dung dịch).

3. Vitamin B5 (axit nicotinic, nicotinamit hay Vitamin PP)
a) Phản ứng với đồng axetat
Trong môi trường axit yếu axit nicotinic phản ứng với muối đồng
(CH3COO)2Cu tạo thành muối nicotinat, kết tủa màu xanh đặc trưng. Phản ứng
xảy ra như sau.

- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch axit nicotinic 1%, CH3COOH 15%,
(CH3COO)2Cu.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 20 giọt CH3COOH 15%, đun hỗn hợp
đến sôi, thêm 10 – 20 giọt (CH3COO)2Cu. Quan sát sự hình thành kết tủa
với màu đặc trưng.
b) Phản ứng với NaOH
Khi đun nóng nicotinamic với NaOH sẽ tạo thành natri nicotinat và giải
phóng NH3:


- Nguyên liệu và hóa chất: nicotinamic dạng bột NaOH 40%
- Cách làm: cho một ít bột nicotinamic vào ống nghiệm, thêm 2ml nước và
1ml NaOH 40%, đun sôi 5 phút trên nồi cách thủy, mùi đặc biệt xuất hiện.
Dùng một mảu quỳ đặt trên miệng ống nghiệm quan sát sự đổi màu của
giấy chỉ thị.

4. VitaminB6 (piridoxin)
Phản ứng với FeCl3
Dưới tác dụng của FeCl3 piridoxin sẽ tạo thành phức chất có màu đặc trưng.
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch piridoxin 1%, FeCl35%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch piridoxin 1%, thêm 5 giọt
FeCl3, lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu của phức chất. Giải thích.
5. Vitamin C (axit ascocbic)
Vitamin C là hợp chất không no, có khả năng phân ly cho ion H+, do vậy

nó có tính axit và có tên là axit ascocbic. Vitamin C tồn tại dưới hai dạng: dạng
oxi hóa và dạng khử theo phản ứng sau:

Vitamin C có nhiều trong rau, quả, nó tham gia tích cực vào quá trình oxi
hóa – khử. Có thể tiến hành định tính và định lượng Vitamin C theo tính chất
khử của nó.


Khi tham gia phản ứng oxi hóa – khử Vitamin C có thể khử một số chất
từ dạng có màu thành không màu hoặc từ dạng hóa trị cao xuống hóa trị thấp
như: kali ferixianua K3[Fe(CN)6], xanh metylen, dung dịch iod,…
a) Phản ứng khử K3[Fe(CN)6
Axit ascocbic khử K3[Fe(CN)6] thành K4[Fe(CN)6]. sau đó K4[Fe(CN)6]
tác dụng với Fe3+ tạo thành hợp chất Fe4[Fe(CN)6]3 có màu xanh biển đến màu
xanh lá cây. Phản ứng xảy ra như sau:

3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 = 2Fe4[Fe(CN)6]3 +12KCl
(xanh nước biển)
Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Vitamin C 0,1%, K3[Fe(CN)6]1%. KOH
5%, FeCl3 1%, xanh metylen 0,01%, HCl 10%, dung dịch iod 0,01N, NaOH 5%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch Vitamin C, 2 giọt dung
dịch KOH 5%, 1ml dung dịch K3[Fe(CN)6] 1%, lắc mạnh hỗn hợp trong
ống. Sau đó thêm vào ống nghiệm 5 – 8 giọt dung dịch HCl 10% và 0,5ml
dung dịch FeCl3, lắc nhẹ. Quan sát sự xuất hiện kết tủa, màu và giải thích.
b) Phản ứng với iod
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Vitamin C0,1%, dung dịch iod
0,01N, NaOH 5%.
- Cách làm: Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống I: 2ml dung dịch Vitamin C,
ống II: 2ml nước cất. Sau đó thêm vào mỗi ống 5 giọt dung dịch iod
0,01N, lắc đều. Quan sát, giải thích sự khác biệt giữa 2 ống.

c) Phản ứng với xanh metylen


- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Vitamin C 0,1%, dung dịch xanh
metylen 0,01%, NaOH 5%.
- Cách làm: Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống I: 1ml dung dịch Vitamin C,
ống II: 1ml nước cất. Sau đó thêm vào mỗi ống 1 – 2 giọt xanh metylen
và 2-3 giọt NaOH 5%. Lắc đều và quan sát màu trong hai ống. Nếu không
có sự thay đổi màu, đặt cả hai ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C.
Quan sát màu của dung dịch trong ống nghiệm sau vài phút, giải thích kết
quả.
6. Viết báo cáo
Bài 4. PROTEIN VÀ AMINO ACID
1. Phản ứng kết tủa thuận nghịch của protein
a) Kết tủa bằng muối trung tính
Muối trung tính vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác dụng tương hỗ
với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hidrat của phân tử keo. Các
protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể
dùng muối để tách riêng protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
- Nguyên liệu và hóa chất: Lòng trắng trứng không pha loãng, (NH4)2SO4
bão hòa, NaCl bão hòa, tinh thể (NH4)2SO4.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 5ml lòng trắng trứng không pha loãng,
(NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều xuất hiện kết tủa globulin. Để 5 phút, lọc
(thấm ướt giấy lọc bằng dịch (NH4)2SO4). Cho vào dịch lọc 3g tinh thể
(NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4ml), lắc, anbumin kết tủa, lọc, thu lấy kết tủa.
Cho riêng kết tủa của globulin và anbumin vào các ống nghiệm tương
ứng, thêm vào mỗi ống khoảng 2 – 3 ml nước cất, lắc, quan sát và so sánh
sự hòa tan kết tủa.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Nếu tiến hành kết tủa protein ở nhiệt độ thấp (0-40C) và lấy kết tủa nhanh ra

khỏi dung môi, protein không bị biến tính (có thể hòa tan lại). Nếu nhiệt độ cao
hơn (20-300C) và kết tủa bị giữ lâu trong dung môi hữu cơ protein bị biến tính.
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 1%, etanol 96%,
axeton, NaCl bão hòa.


- Cách làm: Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml dung dịch lòng trắng
trứng 1%, làm lạnh trong nước đá. Thêm vào ống I: 2ml etanol 96% lạnh,
ống II: 2ml axeton lạnh, quan sát; cho thêm vào cả hai ống vài giọt dung
dịch NaCl bão hòa, kết tủa lắng xuống đáy ống nhanh hơn. Sau khi kết tủa
đã lắng xuống đáy ống, gạn bỏ lớp dung môi, thêm nước vào, lắc đều, kết
tủa sẽ tan ra. Làm lại thí nghiệm trên ở nhiệt độ 20 -300C, quan sát và so
sánh với thí nghiệm trên.
2. Sự biến tính protein
Sự biến tính protein là thuật ngữ dùng để chỉ những sự biến đổi cấu trúc
của phân tử protein (từ cấu trúc bậc 2 trở lên) dẫn đến thay đổi một số tính chất
như tính tan, hoạt tính sinh học,… Khi bị biến tính protein thường đông tụ thành
dạng keo không hòa tan. Điều này được thấy rõ khi sự biến tính xảy ra ở pH
đẳng điện. Nếu sự biến tính xảy ra ở pH khác pHi (trong môi trương kiềm mạnh
hoặc axit mạnh), phân tử protein ở dạng tích điện nên không đông tụ lại mà vẫn
ở dạng hòa tan trong dung dịch. Tuy nhiên nếu dùng muối trung tính để trung
hòa điện, protein sẽ đông tụ thành kết tủa.
Các yếu tố có thể gây biến tính protein là nhiệt độ cao, axit vô cơ đặc, một
số axit hữu cơ với nồng độ cao….Một số chất khác như ure, guanidin,…có tác
dụng phá hủy liên kết hidro, do đó cũng phá hủy cấu trúc bậc 2, 3, 4 của phân tử
protein.
a) Kết tủa protein bằng muối của kim loại nặng
Những muối kim loại nặng như: Cu2+, Fe3+, Pb2+,…) tác dụng với protein tạo
thành kết tủa không tan. Nhưng nếu dư thừa muối, kim loại lại tan ra do những
phân tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở nên tích điện. Ion có hóa trị càng cao

càng dễ tan trở lại.
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, FeCl3 5%, chì
axetat (CH3COO)2Pb 5%, CuSO4 7%.
-

Cách làm:

Lô I: lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng
5%.
Thêm vào

ống I: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%


Ống II: 1 giọt chì axetat 5%
Ống III: 1 giọt CuSO4 7%
Quan sát kỹ. Sau đó cho thêm một lượng muối kim loại nặng tương ứng vào
từng ống. So sánh sự tan ra của các kết tủa.
Lô II: Làm tương tự như lô I nhưng không thêm vào mỗi ống một lượng
muối kim loại tương ứng, cho vào mỗi ống nghiệm 3-4 ml nước  lắc  quan
sát xem kết tủa có tan hay không?
b) Tác dụng của nhiệt độ cao
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5% (đã được lọc
qua giấy lọc nhiều lần), axit axetic 1% và 10%, NaCl bão hòa.
- Cách làm: cho vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng
trứng 5%.
Đun ống I và theo dõi sự kết tủa dần dần của protein.
Thêm vào ống II: 1 giọt axit axetic 1% và đun, kết tủa protein không hình
thành trong khi đun và ngay cả khi sôi.
Thêm vào ống IV: 0,5 ml axit axetic 10% và 3-4 giọt NaCl bão hòa. Đun,

protein kết tủa nhanh và nhiều
So sánh và giải thích sự khác biệt về mức độ kết tủa trong các ống.
c) Tủa protein bằng axit vô cơ đặc
Các axit vô cơ đặc như axit nitric hay axit sunfuric, … có tác dụng lấy nước
và thay đổi trạng thái tích điện của phân tử keo, do đó gây kết tủa protein. Nếu
kéo dài thời gian tác dụng, kết tuả bị hòa tan dần dần. Với axit nitric kết tủa bị
hòa tan chậm.
- Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 5%, H2SO4 đặc.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc, sau đó cầm nghiêng ống,
nhỏ cẩn thận theo thành ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%. Ở mặt
tiếp xúc của hai chất lỏng tạo thành kết tủa protein.
d) Kết tủa protein bằng axit hữu cơ
Khi cho axit tricloaxetic (TCA) hay axit sunfosalisilic vào dung dịch protein
thì protein kết tủa. Phản ứng này được dùng rộng rãi trong thực tế: người ta
thường dùng axit tricloaxetic để phát hiện hoặc để loại bỏ protein ra khỏi dung


dịch, dùng axit sunfosalisilic để phát hiện protein trong nước giải (phản ứng có
độ nhạy đến 0,0015%).
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch

lòng trắng trứng 5%, axit

sunfosalisilic, axit tricloaxetic (TCA) 10%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng 5%, thêm
5-10 giọt dung dịch axit sunfosalisilic hay TCA 10%. Quan sát sự xuất
hiện kết tủa protein và giải thích.
e) Kết tủa protein bằng các thuốc thử ankaloit
Protein cũng như các ankaloit đều có nhóm –NH2 nên phần lớn các thuốc thử
của ankaloit đều có tác dụng kết tủa protein (trong môi trường axit).

- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, axit picric 10%,
dung dịch tanin bão hòa, axit aceitc 1%, 10%; kali feroxianua
[K4fFe(CN)6] 5%.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch lòng trắng trứng
5%
Thêm vào ống I: 2 – 5 giọt axit picric 10% và 2- 3 giọt axit acetic 1%: xuất
hiện tủa và chuyển thành màu vàng.
Thêm vào ống II: 2-4 giọt dung dịch tanin bão hòa và 2 – 4 giọt axit axetic
1%: xuất hiện kết tủa màu xám (tanin được dùng để tủa protein trong công
nghiệp thuộc da).
Thêm vào ống III: 1 giọt axit axetic 10% và 3-5 giọt kali ferixianua 5%, xuất
hiện tủa màu vàng.
3. Các phản ứng màu của protein
a) Phản ứng biure
Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit. Trong môi trường kiềm các
hợp chất chứa từ 2 liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành
phức chất màu xanh tím, tím đỏ hoặc màu tùy thuộc vào số lượng liên kết peptit
nhiều hay ít. Hóa thức của phản ứng như sau:


Phản ứng biure còn được sử dụng để định lượng protein.
- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 1%, ure tinh thể,
NaOH 10%, CuSO4 1%.
- Cách làm:
* Phản ứng với biure: Cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể ure, đun trên
ngọn lửa yếu. Lúc đầu ure nóng chảy đến khi bắt đầu cứng thì ngừng đun. Quá
trình này tạo ra biure, axit xianuric và amoniac (có thể ngửi mùi hoặc thử bằng
giấy quỳ tím). Để ống nguội, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan, thêm vài
giọt CuSO4, quan sát màu. (chú ý không cho quá nhiều CuSO4 vì màu xanh của
Cu(OH)2 được tạo thành có thể lấn án màu của phản ứng).

* Phản ứng với protein: Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng
1%, 1ml NaOH 10%, 1-2 giọt CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát màu và giải thích.
b) Phản ứng với axit nitrơ
Dưới tác dụng của HNO2, axit amin bị dezamin hóa tạo thành nitơ ở dạng
khí. Phản ứng này cũng dùng để định lượng các α – axit amin (phương pháp Van
Slyke). Phản ứng xảy ra như sau:

- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch glixin 0,5%, NaNO2 10%, axit
axetic 2N.
- Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch NaNo2 10%, 2ml dung
dịch axit axetic 2N và 0,5 ml dung dịch glixin 0,5%. Quan sát sự xuất
hiện của bọt khí và giải thích.
c) Phản ứng Pauli để phát hiện histidin và tizozin
Khi tác dụng với axit diazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histidin tạo
thành phức chất có màu mận chín, còn tizozin tạo phức chất có màu da cam.


Hóa thức của phản ứng như sau:
+ Sự tạo thành axit diazobenzensunfonic:

+ Phản ứng của histidin:

+ Phản ứng của tirozin

- Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch histidin và tizozin chuẩn (0,1%),
Na2CO3 10%. Chuẩn bị thuốc thử Pauli: hòa tan 1g axit sunfanilic trong 100ml
HCl 1N, sau đó trộn với 10ml dung dịch nitrit natri 0,7% trong nước cất.
- Cách làm: Nhỏ dung dịch histidin hoặc tizozin trên giấy lọc, hơ nhẹ cho
khô sau đó phun thuốc thử Pauli lên, làm khô giấy., Cuối cùng phun lên giấy
dung dịch Na2CO3 10%. Quan sát, so sánh và giải thích kết quả thu được.

4. Xác định hàm lượng nitơ amin – amoniac (Theo tiêu chuẩn TCVN 370790)


a) Nguyên tắc: Cho foocmon tác dụng với nhóm amin (của axitamin, peptit,..)
và với muối amon có trong mẫu thử. Chuẩn độ nhóm COOH được giải phóng ra
trong phản ứng bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch đạt đến
pH=9,2. Dựa vào lượng kiềm đã tiêu tốn khi chuẩn độ để tính hàm lượng nitơ
amin – amoniac.
b) Dụng cụ và hóa chất:
- Dụng cụ: Bình định mức dung tích 100, 250, 1000ml; Bình nón, cốc thủy tinh
dung tích 100. 250ml; Pipet 1, 10, 25ml; buret 25ml; phễu thủy tinh; giấy lọc,
đũa thủy tinh; cân phân tích độ chính xác 0,001g
- Hóa chất:
+ dung dịch HCl 0,1N;
+ dung dịch NaOH 0,1N;
+ Bromothimol xanh, dung dịch 0,05% trong etanol 60%;
+ dung dịch phenolphtalein 0,05% trong etanol 60%;
+ dung dịch thimolphtalein 1% trong etanol 60%;
+ foocmon trung tính 30% (50 thể tích dung dịch foocmon 30% hòa tan với một
thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, thêm dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi
dung dịch vừa có màu xanh nhạt)
+ Chỉ thị hỗn hợp: trộn 5V Bromothimol xanh, dung dịch 0,05% trong etanol
60% với 4V dung dịch phenolphtalein 0,05% trong etanol 60%.
+ Nari hydrophotphat, dung dịch M/15 (A): Cân chính xác 2,59g
Na2HPO4.12H2O (hoặc 1,1876g Na2HPO4.2H2O) hòa tan, định mức tới 100ml
bình định mức.
+ Kali dihydrophotphat, dung dịch M/15 (B): cân chính xác 0,707g KH2PO4,
hòa tan bằng nước cất và định mức tới 100ml bằng bình định mức.