Khảo sát giá trị multiplex real time PCR trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

“KHẢO SÁT GIÁ TRỊ
Multiplex Real Time PCR
TRONG CHẨN ĐOÁN
NHIỄM KHUẨN HUYẾT”

BCV: BS. Nguyễn Thị Hằng
BỆNH VIỆN PHÁPLOGO
VIỆT
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
NKH là một bệnh nhiễm
khuẩn cấp tính, gây ra do
vi khuẩn lưu hành trong
máu.
Có tỷ lệ tử vong cao.
Việc chẩn đoán sớm và
chính xác tác nhân gây
bệnh sẽ giúp điều trị
nhanh chóng và thích
hợp, giúp giảm chi phí
điều trị và tỷ lệ tử vong.
2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thời gian
chờ đợi
kết quả

CẤY
MÁU
Thể tích
máu

Sử dụng
kháng
sinh trước
khi lấy
mẫu

Độ nhạy
thấp

 NKH cần thiết
chẩn đoán sớm
 “Tiêu chuẩn
vàng" của chẩn
đoán NKH vẫn
là cấy máu.
 Các hạn chế
của cấy máu
3


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đã có nhiều
nghiên cứu trên
thế giới cho thấy:
 Tỷ lệ phát hiện

vi khuẩn bằng
kỹ thuật PCR
cao hơn.
 Vai trò tích cực
của PCR trong
chẩn đoán và
điều trị NKH.

ĐỘ
NHẠY
CAO

HẠN CHẾ SỬ
DỤNG
KHÁNG SINH
PHỔ RỘNG

TRẢ KẾT
QUẢ
SỚM

HẠN CHẾ
NHẬP
VIỆN VÀO
ICU
GIẢM
CHI PHÍ
ĐIỀU TRỊ

PCR

ÂM
TÍNH
GIẢ
DO KIT

GIẢM TỈ
LỆ TỬ
VONG
4


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

 Xác định tỉ lệ dương tính vi sinh vật được
định danh bằng kỹ thuật MRT- PCR ở bệnh
nhân được chẩn đoán NKH.
 Đánh giá giá trị của xét nghiệm định danh vi
sinh vật bằng kỹ thuật MRT-PCR ở bệnh
nhân được chẩn đoán NKH bằng cách so
sánh với kỹ thuật cấy máu cổ điển.

5


ĐỐI TƯỢNG và PHƯƠNG PHÁP NC
 91 trường hợp bệnh
nhân người lớn tại
khoa cấp cứu và
khoa hồi sức tích
cực, bệnh viện FVTP Hồ Chí Minh từ

5/2015 đến 3/2016.
 Thiết kế nghiên cứu:
mô tả cắt ngang
 Tìm tác nhân gây
NKH song song
bằng phương pháp
CM và MRT-PRC.

CHẨN
ĐOÁN
NHK

CẤY MÁU
BD
(Becton
Dickinson)
10-32ml

CHAI
CẤY
MÁU
5ml

ỐNG
MÁU 1ml

BACTE
C 9050

ÂM

Ủ QUA
ĐÊM
(1224H)

DƯƠNG

ĐỊNH
DANH VI
SINH VẬT
(VITEK 2)

MRTPCR
(CFX)

6


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phổ các vi sinh vật của bộ kit MRT-PCR trong nghiên cứu bao

gồm các vi khuẩn như sau:
 Các vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae,

baumanii,

Pseudomonas

Salmonella

sp,

aeruginosa,

Haemophilus

Acinetobacter

influenzae,

Moracella Cataralis.
 Các vi khuẩn Gram dương: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae,
Enterococcus

faecalis,

Enterococcus

faecium,

Streptococcus Pyogenes, Streptococcus agalactiae.
7


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 Ly giải và chiết tách DNA bằng máy Kingfisher mL.

 Phản ứng MRT-PCR với máy CFX 96 Real-time System.

Thành phần của 1 phản ứng PCR: 10 µl Master Mix
Qiagen; 0,1 µl mồi R; 0,1 µl mồi F; 0,05 µl taqman probe;

nước khử ion 4,75 µl; 5 µl DNA 10-20 ng/µl chiết tách.
 Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 95oC/ 15 phút; {95oC/
30 giây, 60oC/ 60 giây} x 40 chu kỳ.

8


KẾT QUẢ: TỈ LỆ DƯƠNG TÍNH




Tỉ lệ dương tính của cấy máu cao hơn tỉ lệ dương tính của
PCR/ống máu (p=0,0002).
Tỉ lệ dương tính của cấy máu và tỉ lệ dương tính của
PCR/chai cấy không khác nhau có ý nghĩa (p=0.5519).
9


SO SÁNH TỈ LỆ DƯƠNG TÍNH
Tỉ lệ dương tính của cấy máu và MRT_PCR

80
70

% dương tính

60

Cấy máu

50
40

PCR/ống máu

30
20

PCR/ chai cấy

10
0

Mancini Ephraim Nora S Westh H Guido M Bloos F Leonella Lodes U Tomasz Chúng tôi
N [6]
L [2]
[7]
[9]
[3]
[1]
P [4]
[5]
G [8]




Tỉ lệ PCR/ống máu dương tính của chúng tôi ở mức trung gian
Các tác giả khác không thực hiện PCR/chai cấy
10


VI SINH VẬT GÂY NKH
Chai cấy
Vi khuẩn

PCR/ống máu

PCR/chai cấy

số lượng

%

số lượng

%

số lượng

%

Escherichia coli

21

47,7

12

45,5

20

48,8

Klebsiella pneumoniae

5

11,4

4

18,2

5

12,2

Salmonella sp

3

6,8

1

4,5

3

7,3

Acinetobacter baumanii

1

2,3

0

0,0

1

2,4

Burkhoderia pseudomallei

1

2,3

0

0,0

0

0,0

Staphylococcus aureus

3

6,8

3

13,6

5

12,2

Staphylococcus epidermidis

1

2,3

0

0,0

1

2,4

Staphylococcus caprae

1

2,3

0

0,0

0

0,0

Staphylococcus capitis

1

2,3

0

0,0

0

0,0

Streptococcus pneumoniae

2

4,5

1

4,5

2

4,9

Streptococcus anginosus

2

4,5

0

0,0

0

0,0

Streptococcus group A

1

2,3

0

0,0

1

2,4

Streptococcus group B

1

2,3

1

4,5

1

2,4

Enterococcus faecium

0

0,0

0

0,0

2

4,9

Candida albican

1

2,3

0

0,0

0

0,0

Tổng

44

100

22

100

41

100

11


VI SINH VẬT GÂY NKH






E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất (47.7%)
K. pneumoniae (11,4%)
S.aureus (6,8%) và Salm sp (6,8%)
Các vi khuẩn khác chiếm tỉ lệ thấp
12


TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR/ống máu
23 ca (25,6%) không tương
hợp (CM+/PCR-)

 6 ca các vi sinh vật gây
bệnh tìm thấy trong CM
chưa được thiết kế mồi
cho PCR (S. capitis, S.
caprae, Strep. anginosus,
B. pseudomallei, C.
albican)
 17 ca CM dương với
chủng vi khuẩn có trong
phổ kit PCR.
13


TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR/chai cấy
12/91 (13,2%) ca không tương hợp
giữa CM và PCR/chai cấy:
 8 ca CM+/PCR-, trong đó có 6
ca vi sinh vật tìm thấy trong CM
chưa có trong phổ của kit PCR.
2 ca còn lại có PCR/chai cấy âm,
PCR/ống máu cho kết quả
dương tính và vi sinh vật giống
kết quả CM.
 4 CM-/PCR+, trong đó có 1 ca
PCR+ với 2 loại vi khuẩn (K.
pneumoniae và S. aureus), 1 ca
S. aureus và 2 ca E. faecalis. Tất
cả 4 bệnh nhân này đều đã dùng
kháng sinh trước khi cấy máu.
14

TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR
100
90

14,4
3,0

5
10

7,0
6,7

0

4,4
8,8

25,6

80
70

47,2

Tỉ lệ %

60

50

71,7

71

77,7

Cấy+/PCR-

52,2

Cấy-/PCR-

40
30

39,6

20
10

Cấy-/PCR+

10,9

15

Cấy+/PCR+

22,2

8,6

0

Westh H [9]

Nora Schaub
[7]

Leonella
Pasqualini [4]

Chúng tôi
PCR/ống máu

Chúng tôi
PCR/chai cấy

Tỉ lệ % tương hợp giữa cấy máu và PCR




Chúng tôi có tỉ lệ cấy+/PCR+ cao
tỉ lệ cấy+/PCR- trong trường hợp làm PCR/ống máu, kết
quả của chúng tôi (25,6%) cao hơn các tác giả khác
(p=0.0036)

15


TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR
100
90

17,4

15

13,2

13,7
25,6

80

Không tương
hợp

Tỉ lệ %

70
60
50
40

82,6

85

86,8

86,3
74,4

Tương hợp

30
20
10
0
Westh H [9]

Nora Schaub [7]

Leonella
Pasqualini [4]

Chúng tôi
PCR/ống máu

Chúng tôi
PCR/chai cấy

Tương hợp giữa cấy máu và PCR



Tỉ lệ tương hợp chung giữa cấy máu và PCR của chúng tôi
không khác nhau có ý nghĩa so với các tác giả khác.
16


THỜI GIAN TRẢ KẾT QUẢ
Phương pháp định danh

Thời gian trả kết quả (giờ)

CM dương: trả kết quả nhuộm Gram

23

CM dương: trả kết quả định danh

45

CM âm: trả kết quả sau 5 ngày

120

PCR/ống máu

4

PCR/chai cấy ủ qua đêm (12-24 giờ)

22

17


KẾT LUẬN
1. Tỷ lệ dương tính của CM và tỷ lệ dương tính của PCR/chai cấy ủ
qua đêm (từ 12-24 giờ) không khác nhau có ý nghĩa (p=0,5519).
Kỹ thuật MRT-PCR/chai máu làm tăng tỷ lệ dương tính so với
MRT-PCR/ống máu có ý nghĩa thống kê (p= 0,0004). PCR/chai
cấy có tỷ lệ tương hợp với CM cao hơn tỷ lệ tương hợp của

PCR/ống máu với CM có nghĩa thống kê (p= 0,0351).
2. Thời gian trả kết quả của MRT-PCR ngắn hơn nhiều so với CM
(p=0,0024).

3. Lượng máu lấy để làm MRT-PCR rất nhỏ so với lượng máu lấy để
CM.

18


Xxi

19