Các bài thực hành về sinh lí thực vật

Thực hành Sinh lí thực vật
(Tài liệu phục vụ huấn luyện học sinh giỏi dự thi Olympic Sinh học)
Phần 1
Các phơng pháp tách chiết sắc tố từ thực vật
1. Các sắc tố quang hợp, tính chất và vai trò của chúng.
Bằng các phơng pháp sắc kí và quang phổ hiện đại, ngày nay đã phân
biệt 4 nhóm sắc tố tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình quang
hợp ở thực vật và vi khuẩn quang hợp. Đó là các nhóm sắc tố trong màng
tilacoit: nhóm clorophin, nhóm carotenoit, nhóm phycobilin và nhóm sắc tố
trong dịch tế bào: nhóm antoxianin.
1.1. Nhóm sắc tố xanh lục - Clorophin
Đây là nhóm sắc tố có vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp, vì
nó có khả năng hấp thụ trực tiếp ánh sáng và biến năng lợng hấp thụ đợc -
năng lợng vật lí thành năng lợng dự trữ trong các hợp chất hữu cơ - năng l-
ợng hoá học. Các nhóm sắc tố khác không làm đợc chức năng đầy đủ và
trực tiếp nh vậy.
Có nhiều loại clorophin và sự khác nhau giữa chúng chỉ ở một số chi tiết về
cấu tạo và sau đó là về điểm cực đại trong quang phổ hấp thụ ánh sáng.
Về cấu tạo chung của clorophin, ta chú ý đến các đặc điểm sau: phân tử
clorophin có 4 nhân pyron liên kết với nhau bằng các cầu nối metyl ( - CH
= ) để tạo nên vòng porphyrin có nguyên tử Mg ở giữa liên kết với 4
nguyên tử N của các nhân pyron, có hai nguyên tử H ở nhân pyron thứ t,
nhân này nối với gốc rợu phyton và có vòng cyclopentan ở nhân pyron thứ
ba với một nguyên tử oxi.
Sau đây là công thức tổng quát của clorophin a và clorophin b:
Clorophin a: C
55
H
72
O
5

N
4
Mg
Clorophin b: C
55
H
70
O
6
N
4
Mg
Nhìn vào công thức cấu tạo ( trong sách giáo khoa ), ta thấy trong phân tử
clorophin có nhiều nối đôi cách đều. Đó là kiểu nối đôi cộng đồng - kiểu
nối đôi thể hiện khả năng hấp thụ mạnh năng lợng ánh sáng và dễ dàng bị
kích thích bởi ánh sáng, cũng nh dễ dàng chuyển năng lợng ánh sáng hấp
thụ đợc cho các phản ứng quang hoá.
Về một số tính chất hoá học và vật lí của clorophin:
1
a. Clorophin không tan trong nớc, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ.
Vì vậy khi muốn tách clorophin ra khỏi lá, bắt buộc phải dùng một dung
môi hữu cơ nh: ête, cồn hay axeton,
b. Clorophin là este của axit dicacboxilic: C
32
H
30
ON
4
Mg(COOH)
2

với
hai loại rợu là phyton: C
20
H
39
OH và metanol: CH
3
OH, nên công thức của
clorophin có thể viết nh sau:
COOCH
3
C
32
H
30
ON
4
Mg
COOC
20
H
39
và khi tác dụng với bazơ sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá tạo thành muối
clorophinat vẫn có màu xanh.
Ngợc lại khi tác dụng với axit thì Mg bị H thay thế và hình thành
một hợp chất kết tủa có màu nâu pheophytin.
Nếu cho pheophytin tiếp tục tác dụng với một kim loại khác thì kim
loại này lại thay thế vị trí của Mg và tạo thành một hợp chất cơ-kim (hữu cơ
- kim loại) có màu xanh rất bền.
c. Sự mất màu của clorophin :

Clorophin trong tế bào không bao giờ bị mất màu, trừ trờng hợp bị
phân huỷ trong quá trình hoá già của cơ quan, cơ thể. Bởi vì clorophin nằm
trong phức hệ cáu trúc chặt chẽ với protein và lipoit. Nhng dung dịch
clorophin ngoài ánh sáng và trong môi trờng có O
2
thì sự mất màu xảy ra
do clorophin bị oxi hoá dới tác dụng của ánh sáng :
Clorophin + hv Clorophin* (trạng thái kích thích)
Clorophin* + O
2
ClorophinO
2
(trạng thái oxi hoá, mất màu).
d. Hiện tợng huỳnh quang và lân quang của clorophin
Khi chiếu ánh sáng vào dung dịch sắc tố rút từ lá xanh và bằng ph-
ơng pháp đo huỳnh quang, lân quang, ta thấy dung dịch này có hiện tợng
huỳnh quang và lân quang. Điều đó chứng tỏ có hiện tợng truyền năng lợng
giữa các phân tử clorophin và các loại sắc tố với nhau. Năng lợng của các
photon ánh sáng đợc clorophin hấp thụ đã kích thích các phân tử clorophin
và các dạng của các phân tử sắc tố đã truyền năng lợng cho nhau tạo nên
hiện tợng huỳnh quang và lân quang. (Huỳnh quang là hiện tợng phát sáng
khi chiếu sáng vào sắc tố và sự phát sáng này tắt ngay khi nguồn chiếu sáng
tắt. Lân quang là hiện tợng phát sáng khi chiếu sáng vào sắc tố và sự phát
sáng này không tắt ngay khi nguồn sáng đã tắt).
e. Quang phổ hấp thụ của clorophin
Trong bớc sóng ánh sáng nhìn thấy (400 nm - 700 nm), có hai vùng
hấp thụ của clorophin: vùng xanh tím (430 nm) và vùng đỏ (680nm). Màu
xanh đặc trng của clorophin và cũng là màu xanh của lá cây chính là kết
quả của sự hấp thụ hai vùng quang phổ xanh tím và đỏ này. Vì phổ ánh
sáng nhìn thấy (ánh sáng trắng) gồm các vùng ánh sáng: đỏ, da cam, vàng,

lục, lam, chàm, tím. Các sắc tố của lá cây hấp thụ các vùng ánh sáng ở đầu
và cuối của phổ ánh sáng nhìn thấy để lại ánh sáng vùng lục không hấp thụ
2
(phản xạ hoặc xuyên qua). ánh sáng màu lục đập vào mắt ta khi ta nhìn
vào lá cây và thấy lá cây có màu xanh lục (Hình 2).
f. Clorophin tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp
Năng lợng tích luỹ đợc bởi clorophin khi hấp thụ ánh sáng đợc
chuyển trực tiếp cho các phản ứng quang hoá để quang phân li H
2
O giải
phóng O
2
, H
+
và electron và sau đó hình thành 2 sản phẩm vô cùng quan
trọng của pha sáng là ATP và NADPH.
1.2. Nhóm sắc tố vàng - Carotenoit
Đây là nhóm sắc tố có các màu từ vàng đến tím đỏ. Chúng đợc cấu
tạo theo mạch nối đôi thẳng, gồm 40 nguyên tử C và 56 nguyên tử hidro
(C
40
H
56
).
Nhóm carotenoit đợc chia thành 2 nhóm nhỏ theo cấu trúc hoá học:
Caroten và Xanthophin
* Caroten - C
40
H
56

là một cacbuahidro cha bão hoà, không tan trong
nớc mà chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Công thức cấu tạo gồm một
mạch cacbon dài gồm 8 gốc izopren và hai đầu là một hoặc hai vòng ionon.
Trong thực vật thờng có 3 loại caroten: anpha, beta, gama caroten. Cắt đôi
phân tử beta caroten ta đợc hai phân tử vitamin A. Bớc sóng hấp thụ cực đại
của caroten ở 446 - 467 nm.
* Xanthophin - C
40
H
56
On (n : 1- 6) là dẫn xuất (dạng oxi hoá) của
caroten. Vì oxi từ 1 đến 6 nên có nhiều loại xanthophin: Cripthoxanthin
(C
40
H
56
O ), Lutein (C
40
H
56
O
2
), Violaxanthin (C
40
H
56
O
4
) ,Các nguyên tử
oxi liên kết trong các nhóm: hidroxy, cacboxy, axetoxy, metoxy, epoxy,

Bớc sóng hấp thụ của cực đại của xanthophin ở 451 - 481 nm.
Ngời ta còn phân chia nhóm carotenoit thành hai nhóm nhỏ theo tính chất
sinh học:
Nhóm carotenoit sơ cấp : làm nhiệm vụ quang hợp hoặc bảo vệ
Nhóm carotenoit thứ cấp :có trong các cơ quan nh: hoa, quả, các
cơ quan hoá già hoặc bị bệnh khi thiếu dinh dỡng khoáng. Chính nhóm này
là nguồn cung cấp vitamin A cho chúng ta, khi ăn các loại hoa, quả có màu
đỏ nh: ớt, cà chua, bí ngô, đu đủ, gấc,
Về vai trò của nhóm carotenoit, cho đến nay mới chỉ biết nh sau:
+ hấp thụ ánh sáng và bảo vệ clorophin khi ánh sáng quá cao.
+ xanthphin tham gia quá trình giải phóng oxi thông qua sự biến đổi
từ violaxanthin (C
40
H
56
O
4
) thành lutein (C
40
H
56
O
2
).
+ nhóm carotenoit sơ cấp tham gia vào quá trình quang hợp bằng
cách hấp thụ năng lợng ánh sáng và truyền năng lợng ánh sáng này cho
clorophin và nó có mặt trong hệ thống quang hoá II. Nh vậy nhóm
carotenoit tham gia gián tiếp vào chức năng quang hợp.
+ nhóm carotenoit thứ cấp là nguồn cung cấp vitamin cho cơ thể.
Về sự hình thành nhóm carotenoit, có giả thuyết cho rằng: có sự hình thành

nhóm carotenoit từ sản phẩm phân huỷ clorophin ở những cơ quan hoá già
3
hoặc thiếu dinh dỡng khoáng. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã phủ nhận giả
thuyết này.
1.3. Nhóm sắc tố của Tảo - nhóm phycobilin
Nhóm sắc tố này rất quan trọng đối với các nhóm thực vật thuỷ sinh
sống ở các vùng nớc sâu. Đó là nhóm sắc tố a nớc, trong tế bào chúng liên
kết với protein nên có tên gọi là biliprotein hay phycobiliprotein, gồm
phycoerythrin (C
34
H
47
N
4
O
8
) và phycoxyanin (C
34
H
42
N
4
O
9
).
Công thức cấu tạo của nhóm sắc tố này gồm 4 vòng pyron xếp thẳng
(không khép kín) nối với nhau bằng các cầu nối methyl (- CH=)
Quang phổ hấp thụ của nhóm sắc tố này ở vùng ánh sáng màu lục và vàng.
Phổ hấp thụ cực đại trong dung dịch cloroform của phycoerythrin là 505
nm và của phycoxyanin là 612 nm.

Về vai trò của nhóm sắc tố phycobilin : Đã xác nhận rằng: năng lợng
ánh sáng do phycobilin hấp thụ đợc chuyển đến nhóm clorophin để sử dụng
cho quá trình quang hợp với hiệu suất rất cao.
Chính vì vậy sự có mặt của nhóm sắc tố này trong Tảo là sự thích
nghi trong quá trình tiến hoá của nhóm thực vật ở nớc.
Quá trình sinh tổng hợp nhóm phycobilin hiện nay cha biết rõ về các
enzim và các sản phẩm trung gian.
1.4. Nhóm sắc tố dịch bào - Nhóm antoxianin
Ngoài các nhóm sắc tố làm nhiệm vụ trực tiếp và gián tiếp trong quá
trình quang hợp, trong cây xanh còn có các sắc tố dịch bào với các màu sắc
khác nhau: đỏ, xanh, tím, hợp thành nhóm sắc tố antoxianin.
Antoxianin là nhóm sắc tố thuộc loại glucozit trong đó gốc gluco hay
gốc gamno liên kết với nhóm màu agliucon. Antoxianin có cấu tạo giống
với flavon và catexin.
Về vai trò của nhóm antoxianin: Trong phần lớn trờng hợp, quang
phổ hấp thụ của antoxianin bổ sung cho quang phổ hấp thụ của clorophin.
Do đó nó tham gia gián tiếp vào quá trình quang hợp. Mặt khác khi hấp thụ
năng lợng ánh sáng, nó biến năng lợng photon thành dạng nhiệt năng, sởi
ấm cho cây. Điều này giải thích tại sao những hoa vùng lạnh lại có màu sắc
sặc sỡ và tại sao trong đợt gió mùa đông bắc bèo hoa dâu ở ta từ màu xanh
chuyển sang màu tím. Antoxianin còn liên quan đến hoạt động của khí
khổng. Tóm lại nhóm sắc tố antoxianin trớc hết có vai trò tạo nên màu sắc
của cánh hoa, đài hoa, lá đài, sau nữa là nhóm sắc tố thể hiện khả năng
chống chịu (chịu rét, chịu hạn, chịu thiếu dinh dỡng khoáng,) và sau cùng
là tham gia gián tiếp trong quá trình quang hợp.
4
2. Các phơng pháp tách chiết
Bài thực hành 1
Rút sắc tố từ lá và thực hiện một số phản ứng lí hoá học của clorophin
1. Nguyên tắc của phơng pháp

Do có nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nớc và kết hợp
với protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rợu phytol lại mang
tính kị nớc và hớng tới cấu trúc lipit của màng tilacoit, nên phân tử
clorophin chủ yếu hoà tan trong dung môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt
clorophin ra khỏi lá, ngời ta không dùng ête petrol hay benzen, mà dùng
cồn hay axeton pha với một ít nớc để tách đợc hết phân tử clorophin từ lá.
Các sắc tố của nhóm carotenoit cũng đợc tách chiết theo phơng pháp này.
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
- Lá tơi
- Đũa thuỷ tinh
- Cồn etilic hoặc axeton 80%
- Giá ống nghiệm và các ống nghiệm
- Benzen - KOH 20%
- KOH 20%
- HCL 10%
- Axetat đồng
- CaCO
3
- Bột thuỷ tinh
- Phễu lọc số 3
- Pipet
- Kéo
- ống nhỏ giọt
- Đèn cồn
- Giấy lọc
- Diêm
- Cối chày sứ
3. Các bớc tiến hành
Lá tơi đợc cắt nhỏ trong cối sứ (vứt bỏ phần gân lá), thêm một ít bột
thuỷ tinh cho dễ nghiền, một ít CaCO

3
để trung hoà độ axit của dịch tế bào.
Nghiền các mẩu lá cùng với một ít dung môi (cồn hoặc axeton 80% đã
chuẩn bị) đến khi thành một thể đồng nhất. Thêm dung môi, rửa chày sứ,
dùng đũa thuỷ tinh đổ dung dịch vào ống nghiệm qua phễu lọc.
Dung dịch sắc tố thu đợc sẽ đợc dùng để đo hàm lợng sắc tố và tiến
hành một số thí nghiệm nhằm chứng minh các tính chất lí, hoá học của
clorophin.
a. Xác định hàm lợng clorophin
5
Đem dịch chiết sắc tố đo trên máy quang phổ ở các bớc sóng 663nm,
645nm. Sau đó sử dụng các công thức để tính hàm lợng các sắc tố thành
phần nh sau:
Clorophin a (mg/ l): 12,7. OD 663 - 2,69. OD 645
Clorophin b (mg/ l): 22,9. OD 645 - 4,68. OD 663
Ghi chú: Công thức này sử dụng cho dung môi là axeton 80% ,OD là số đo
trên máy quang phổ ở các bớc sóng xác định.
Cũng trên dung môi này, nếu đo ở các bớc sóng khác, có thể dùng
các công thức khác nh:
Clorophin a (mg/ l): 11,63. OD 665 - 2,39. OD 649
Clorophin b (mg/ l): 20,11. OD 649 - 5,18. OD 665
Clorophin a (mg/ l): 11,78. OD 664 - 2,29. OD 647
Clorophin b (mg/ l): 20,05. OD 647 - 4,77. OD 664
Sau đây là một vài công thức khác khi sử dụng các dung môi khác
nhau:
- Dung môi axeton 100 %:
Clorophin a (mg/ l): 11,70. OD 662 - 2,09. OD 644
Clorophin b (mg/ l): 21,19. OD 644 - 4,56. OD 662
- Dung môi ête êtilic 100 %:
Clorophin a (mg/ l): 10,1. OD 662 - 1,01. OD 644

Clorophin b (mg/ l): 16,4. OD 644 - 2,57. OD 662
- Dung môi 96 % êtanol:
Clorophin a (mg/ l): 13,70. OD 665 - 5,76. OD 649
Clorophin b (mg/ l): 25,80. OD 649 - 7,60. OD 665
- Dung môi metanol 100 % :
Clorophin a (mg/ l): 16,5. OD 665 - 8,3. OD 650
Clorophin b (mg/ l): 33,8. OD 650 - 12,5. OD 665
b. Quan sát hiện tợng huỳnh quang
Đặt ống nghiệm chứa dịch sắc tố ra gần cửa sổ có ánh sáng trên một
nền đen hoặc gần bóng đèn điện. Quan sát màu của dịch sắc tố ở ánh sáng
phản xạ, ta thấy dịch sắc tố có màu đỏ thẫm - màu của rợu vang.
Đó chính là hiện tợng huỳnh quang của clorophin.
Hiện tợng huỳnh quang cũng có thể quan sát ở các cây sống. Đối t-
ợng tốt để quan sát là tảo, rêu thuỷ sinh. Các đối tợng này đặt trên lam kính
rồi quan sát dới kính hiển vi bằng ánh sáng xanh tím. Sẽ quan sát thấy
clorophin trong lục lạp có màu đỏ thẫm.
c. Phản ứng với bazơ
Đổ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch sắc tố và tiến hành các thí
nghiệm sau : - ống 1 làm đối chứng
- ống 2 : nhỏ 4 - 5 giọt KOH 20 %, lắc đều, cho thêm 4
giọt benzen, lắc mạnh rồi để yên.
Dung dịch sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá:
COOCH
3
C
32
H
30
ON
4

Mg + 2 KOH
COOC
20
H
39
6
COOK
C
32
H
30
ON
4
Mg + CH
3
OH + C
20
H
39
OH
COOK
Muối của clorophin cũng có màu xanh, xong khác với clorophin là
không tan trong benzen. Nh vậy màu của cồn và benzen khác nhau khi so
sánh với đối chứng.
d. Phản ứng với axit
Lấy 2 ống nghiệm còn lại, cho vào mỗi ống 2 - 3 giọt HCL 10%, ta
sẽ có chất pheophytin có màu nâu xám, vì Mg đã bị thay thế bằng 2 nguyên
tử hidro theo phản ứng sau:
COOCH
3

C
32
H
30
ON
4
Mg + HCL
COOC
20
H
39
COOCH
3
C
32
H
30
ON
4
+ MgCL
2
COOC
20
H
39
Sau khi quan sát màu của dịch sắc tố, ta lại tiếp tục cho vào một
trong hai ống nghiệm dung dịch axetat đồng, sau đó đun sôi dung dịch trên
nồi cách thuỷ. Màu nâu xám của dịch lại dần trở lại màu xanh lục đậm. Nh
vậy liên kết kim loại lại đợc tái lập, tức là Cu thay thế chỗ của Mg.
4. Kết luận: Clorophin là este của axit dicacboxilic.

7
Bài thực hành 2.
Tách các sắc tố bằng phơng pháp sắc kí trên giấy
1. Nguyên tắc của phơng pháp
Các sắc tố khác nhau có độ hoà tan khác nhau trong một dung môi
nhất định. Do đó khi cho hỗn hợp dung dịch sắc tố lên bề mặt hấp thụ ( ở
đây là giấy sắc kí, cũng có thể dùng cột sắc kí với một chất hấp thụ tốt ),
các sắc tố sẽ hoà tan trong dung môi và di chuyển cùng dung môi với vận
tốc phụ thuộc vào khối lợng phân tử của chúng.
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
- Lá tơi
- Bình sắc kí
- Đũa thuỷ tinh
- Bơm hút chân không
- Giấy lọc
- Chén thuỷ tinh
- Cát thuỷ tinh
- Giấy sắc kí
- Cối chày sứ
- ống đong và các ống nghiệm to
- Axeton
- Ete petrol
- CaCO
3
3. Các bớc tiến hành
Tách chiết sắc tố nh bài 1. Sau khi có hỗn hợp sắc tố, đổ một ít hỗn hợp này
vào chén thuỷ tinh, lấy giấy sắc kí đã chuẩn bị sẵn, nhúng vào dung dịch
sắc tố (chú ý cho đều mép giấy, tránh để lệch). Sau vài giây dung dịch sắc
tố sẽ thành vệt xuất phát cách mép giấy khoảng 1 - 1,5 cm Tiếp tục nhúng
giấy vào dung dịch sắc tố nhiều lần để lợng mẫu ở vạch xuất phát nhiều.

Sau đó nhúng mép giấy vào axeton để lôi các sắc tố tập trung về vạch xuất
phát. Chờ cho giấy khô và bay hết mùi axeton rồi chuẩn bị sắc kí.
Đổ ete petrol vào bình sắc kí (chiều cao của dung môi khoảng 1cm). Nhúng
giấy sắc kí vào dung môi. Giấy sắc kí đợc cuộn tròn và đợc giữ hoặc treo
sao cho vạch xuất phát của sắc tố không bị ngập trong dung môi mà phải ở
trên dung môi và giấy sắc kí không đợc chạm vào thành bình sắc kí. Để
tránh sự oxi hoá sắc tố ngoài ánh sáng, cần đặt bình ở chỗ tối hoặc nơi có
ánh sáng yếu. Sau 10 - 15 phút dung môi hoà tan sắc tố, thấm vào giấy,
dâng lên theo chiều từ dới lên trên. Các sắc tố thành phần đợc tách ra và
dừng lại ở các vị trí khác nhau. Nếu chúng ta tách chiết sắc tố của lá cây
bằng dung môi axeton, thì kết quả sắc kí sẽ có 4 vạch theo thứ tự từ dới lên:
clorophin b, clorophin a, xanthophin, caroten.
4. Kết luận : Học sinh đa ra nhận xét và giải thích kết quả.
8
Bài thực hành 3
Tách và định lợng nhóm sắc tố vàng (Carotenoit)
1. Nguyên tắc của phơng pháp
Khi rút sắc tố ra khỏi lá chúng ta thu đợc một hỗn hợp sắc tố , trong đó có
nhóm sắc tố vàng- nhóm carotenoit. Nhóm clorophin và nhóm carotenoit có
thể hoà tan tốt trong một số dung môi hữu cơ khác nhau. Dựa vào đặc điểm
hoá học này, ngời ta đã tách nhóm sắc tố carotenoit ra khỏi nhóm clorophin
bằng phơng pháp hoá học.
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
- Lá cây
- Cối chày sứ
- Bình nút nhám
- Phễu thuỷ tinh
- Giấy lọc
- Phễu chiết
- Bình tam giác

- Máy so màu quang điện
- Cồn hay axeton
- Ete etilic
- KOH 30 % trong cồn
3. Các bớc tiến hành
Lấy 1 gam lá, cắt nhỏ, cho vào cối nghiền và tách chiêt sắc tố nh
trong bài thực hành 1. Toàn bộ dịch chiết cho vào bình định mức, thêm
axeton đến vạch 50 ml. Lấy 10 ml dịch chiết cho vào phễu chiết, thêm 10
ml ete etilic. Đổ từ từ nớc cất vào phễu chiết cho đến khi sắc tố chuyển hết
lên lớp ete phía trên. Để dung dịch đứng yên, gạn bỏ lớp axeton và nớc ở
phía dới.
Sau khi đã loại hết nớc và axeton, cho dịch sắc tố vào bình nút nhám,
thêm vào dịch sắc tố 3 ml KOH 30 %, lắc mạnh trong 30 phút, thêm 20 ml
nớc cất, rồi lại cho vào phễu chiết. Để yên một lúc, ta thấy trong phễu chiết
sắc tố đã tách thành 2 lớp: lớp sắc tố carotenoit có màu vàng ở phía trên,
lớp nớc phía dới chứa muối của clorophin a và b (clorophinat). Tách lớp
muối này bằng cách cho thêm nớc và rửa nhiều lần. Rót dịch carotenoit vào
bình định mức, đem so màu trên máy so màu quang điện. Chất đối chứng là
dung môi ete etilic và kính lọc màu xanh tím.
Tính hàm lợng sắc tố vàng theo công thức :
n. V. L . V2
X ( mg/ g ) : -------------------------
1000. P. V1
V1 : thể tích sắc tố dùng để xác định hàm lợng
V2 : thể tích toàn bộ dịch sắc tố
P : khối lợng lá ( g )
V : thể tích toàn bộ dịch sắc tố vàng
L : thể tích dịch lấy đo ở máy
9
n : Chỉ số OD của máy khi đo dịch sắc tố.

4. Kết luận : Tính toán kết quả và nhận xét.
Bài thực hành 4.
Xác định tính chất cảm quang của clorophin
1. Nguyên tắc của phơng pháp
Clorophin tách rời khỏi phức hệ sắc tố vẫn có khả năng hoạt động quang
hoá, tức là vẫn có khả năng bị kích thích bởi ánh sáng và khi đó có thể làm
đợc vai trò chuyển H+ và e trung gian. Hiện tợng này gọi là tính chất cảm
quang của clorophin. Trong bài thực hành này, dịch sắc tố rút từ lá đợc
dùng làm chất truyền điện tử trung gian trong phản ứng oxi hoá khử. Dới
tác dụng của ánh sáng các phân tử clorophin sẽ chuyển proton và điện tử từ
chất khử mạnh (axit ascorbic) đến chất oxi hoá mạnh (đỏ methyl) làm đỏ
methyl mất màu (đỏ methyl ở trạng thái oxi hoá có màu đỏ, khi ở trạng thái
bị khử thì mất màu).
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
- Dịch rút sắc tố (làm theo bài thực hành 1.)
- Các ống nghiệm
- Axit ascorbic dạng tinh thể
- Dung dịch đỏ methyl 0,04 % trong cồn
3. Các bớc tiến hành
Cho vào ống nghiệm 1 và 2 một lợng dịch sắc tố nh nhau (2 ml).
Thêm vào mỗi ống nghiệm một ít tinh thể axit ascorbic cho tới bão hoà (khi
thấy còn một ít tinh thể không tan đợc nữa, lấng xuống đáy ống nghiệm).
Tiếp tục thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch đỏ methyl. Lắc mạnh
hỗn hợp và đặt một ống nghiệm ra ánh sáng, một ống nghiệm trong tối.
Còn ống nghiệm thứ 3,4 (ống đối chứng) ta cho 2 ml cồn thay cho dịch sắc
tố, sau đó cũng cho axit ascorbic và đỏ methyl nh 2 ống nghiệm 1 và 2, đặt
ống nghiệm 3 ngoài sáng, ống nghiệm 4 trong tối.
Sau một thời gian khoảng 30 phút, quan sát sự thay đổi màu ở 4 ống
nghiệm, ghi lại kết quả theo thứ tự sau:
ống nghiệm thành phần hỗn hợp điều kiện màu sắc

1 clorophin + axit ascorbic + đỏ methyl sáng
2 -------------- tối
3 cồn + axit ascorbic + đỏ methyl sáng
4 -------------------------- tối
4. Kết luận : Nhận xét và giải thích kết quả
10
Bài thực hành 5
Xác định hoạt tính quang hoá của lục lạp tách rời
1. Nguyên tắc của phơng pháp
Lục lạp tách rời khỏi lá bằng các dung dịch dinh dỡng thích hợp, khi đợc
chiếu sáng có thể thực hiện đợc một phần các phản ứng quang hợp, cụ thể
là có thể thực hiện đợc các phản ứng quang phân li nớc giải phong oxi và có
thể khử các chất, nếu có các chất nhận điện tử nhân tạo, nhờ H+ và e của n-
ớc.
Ngời ta gọi phản ứng của lục lạp tách rời này là phản ứng Hill.
Phản ứng diễn ra nh sau :
ánh sáng
A + H
2
O AH
2
+ 1/2 O
2
lục lạp
(A - chất nhận điện tử , Ví dụ : DCPIP - dichlorophenol Indophenolat
natri).
DCPIP ở trạng thái oxi hoá có màu xanh da trời, ở trạng thái khử mất
màu. Lợng oxi thải ra và tốc độ thay đổi màu là chỉ số đánh giá hoạt tính
quang hoá của lục lạp tách rời.
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm

- lá tơi
- ống đong
- cân kĩ thuật
- cối chày sứ
- cốc
- vải lọc
- ống li tâm
- máy so màu
- đệm photphat 0,06 M pH = 7,1
- DCPIP 1.10 -4 M
- NaCl
3. Các bớc tiến hành
Thí nghiệm 1:
Cân khoảng 2 gam lá, dùng kéo cắt nhỏ, nghiền trong cối sứ với 10
ml môi trờng tách (0,87g NaCl hoà tan trong 50 ml đệm photphat 0,06 M
pH 7,1). Thêm vào dịch nghiền một ít môi trờng, rồi lọc dịch nghiền vào
cốc qua 2 lớp vải lọc. Sau đó cho dịch lọc vào ống li tâm và li tâm với tốc
độ 500 - 1000 vòng/ phút trong 3 phút. Sau khi bỏ cặn, li tâm lớp dịch phía
trên 10 phút với tốc độ 2000 vòng/ phút. Bỏ lớp dịch lỏng ở phía trên, ta thu
đợc cặn màu xanh lục. Đó chính là lục lạp. Khuấy đều lục lạp trong ống li
tâm bằng một ít môi trờng, sau đó cho dịch lục lạp vào ống đong, cho thêm
môi trờng cho đến 20 ml.
Đo mật độ quang học của khối dịch chứa lục lạp trên máy so màu
quang điện với kính lọc đỏ và pha loãng dịch tới giá trị của OD là 0,260.
11
Giá trị này tơng ứng với nồng độ của clorophin trong khối dịch là 10 micro
gam/ ml. Để dịch chứa lục lạp trong tối.

Thí nghiệm 2:
Xác định hoạt tính của phản ứng Hill với 2,6 - DCPIP

Để xác định hoạt tính của phản ứng Hill, lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi
ống 5 ml dịch lục lạp và 2 ml DCPIP nồng độ 1.10- 4 M (phân tử lợng của
DCPIP là 290) Một ống nghiệm đặt trong tối làm ống kiểm tra, ống thứ 2
đặt trong phòng và chiếu sáng bằng bóng đèn điện 200 W trong 5 phút (để
ống nghiệm cách đèn 20 cm). Sau 5 phút chiếu sáng, nhanh chóng xác định
mật độ quang học của dịch lục lạp trong cả hai ống nghiệm trên máy so
màu quang điện. Mẫu đối chứng là nớc cất. Dùng cuvet có độ dày 5 mm và
đo với kính lọc màu đỏ.
Tính sự biến đổi mật độ quang học của ống thí nghiệm trong thời
gian thí nghiệm có tính đến sự khử của chất màu trong tối.
Hoạt tính của phản ứng đợc biểu thị bằng sự biến đổi mật độ quang
học trong 1 giờ trên 1 mg clorophin.
Ghi số liệu thí nghiệm và tính toán kết quả.
4. Kết luận:
4.1. Quan sát và giải thích sự thay đổi màu của dung dịch thí nghiệm
4.2. Tính hoạt tính của phản ứng Hill.

12
Phần 2
Các phơng pháp phát hiện và nhận biết các biểu hiện
của cây khi môi trờng bị thiếu một số chất khoáng
1. Vài nét về vai trò của các nguyên tố khoáng
Có thể nói, trong cây có mặt hầu hết các nguyên tố đã tìm thấy trên vỏ trái
đất. Bằng phơng pháp phân tích hoá học, ngời ta đã tìm thấy trong cây có
74 nguyên tố hoá học. Tính trung bình trong chất khô của cây : C, O, H, N
chiếm đến 95 %, trong đó : C 45 %, O 42 %, H 6,5 % và N 1,5 %. Bốn
nguyên tố này là thành phần chủ yếu của các chất hữu cơ trong cây. Chúng
đợc hấp thụ vào cây dới dạng H2O, khí CO2, O2, ion NH4+, NO3- và thoát
ra ở thể khí khi đốt cháy. Những nguyên tố còn lại chứa trong tro thực vật
là các nguyên tố khoáng. Căn cứ vào hàm lợng nhiều ít trong cây, ngời ta

chia ra 3 nhóm nguyên tố khoáng nh sau:
- Nguyên tố đa lợng : P, K, S, Mg, Ca, Na,
- Nguyên tố vi lợng : Mn, Cu, Zn, B, Br, Ba, Fe, Mo, Co,
- Nguyên tố siêu vi lợng : As, I, Hg, Pb, Au, Ag, Ra,.Pt,
Các nguyên tố khi đợc hấp thụ vào cơ thể thực vật, sẽ có những vai trò khác
nhau. Chúng là thành phần cấu tạo nên các chất hữu cơ của tất cả các phần
trong tế bào, tham gia vào cấu trúc và hoạt hoá enzim, cân bằng nớc, cân
bằng ion trong tế bào, duy trì trạng thái bền vững của hệ thống keo trong
chất nguyên sinh, tham gi trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình trao đổi
chất của cơ thể.
Chính vì các nguyên tố khoáng có vai trò quan trọng nh vậy, nên
thiếu bất cứ một nguyên tố khoáng nào trong đời sống cây trồng cũng sẽ
ảnh hởng rõ rệt đến cấu trúc và chức năng của các tế bào, mô, cơ quan và
cơ thể, dẫn đến vi phạm quá trình trao đổi chất, đến quá trình sinh trởng,
phát triển và cuối cùng là đến năng suất thu hoạch.
Cũng chính vì lẽ đó, vấn đề chẩn đoán nhu cầu dinh dỡng của cây
trồng trở thành một vấn đề rất quan trọng trong nghề trồng trọt.
2. Vấn đề chẩn đoán nhu cầu dinh dỡng và các phơng
pháp cụ thể.
Việc chẩn đoán nhu cầu dinh dỡng của cây trồng chủ yếu nhằm mục
đích xác định thời kì và số lợng các chất dinh dỡng cần cung cấp cho cây.
Có 3 phơng pháp chủ yếu để chẩn đoán nhu cầu dinh dỡng sau đây:
a. Phơng pháp phân tích lá
Phơng pháp này tiến hành phân tích định kì các nguyên tố dinh dỡng
trong lá, nhằm xác định xem chúng đang thiếu nguyên tố nào.
b. Phơng pháp phân tích mô
Dựa vào các phản ứng hoá học giữa một số hoá chất đặc trng với
dịch của mô và căn cứ vào màu sắc khi phản ứng xảy ra, biết hàm lợng các
13
chất dinh dỡng hiện có trong cây nhiều hay ít. Trên cơ sở đó quyết định

thời gian và số lợng các chất dinh dỡng cần cung cấp cho cây.

Bài thực hành 6
Xác định mức độ cung cấp nitrat và photphat cho cây theo hàm lợng
của chúng trong dịch tế bào
1. Nguyên tắc của phơng pháp
Các nguyên tố N và P đợc cây hấp thụ dới dạng ion NO3- , NH4+,
PO4--- và ta có thể tìm thấy chúng trong dịch tế bào, khi lấy dịch tế bào
của mô cây và cho tác dụng với một số hoá chất đặc trng. Các hoá chất này
đợc xem nh một thuốc thử đặc trng ( một chất chỉ thị ) cho một chất khoáng
nhất định. Phản ứng sẽ tạo ra màu đặc trng và căn cứ vào màu này, ta biết
đợc trong mô đang có nhiều hay ít chất khoáng đó.
2. Đối tợng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
- Lá cây có cả cuống lá
- Đũa thuỷ tinh
- Lam kính
- Đũa thiếc
- Diphenilamin trong axit sunfuric: Hoà tan 100mg
diphenilamin vào 10 ml H
2
SO
4
đặc.
- Thuốc thử Kiec- xa-nop: Hoà tan 1g NH
4
MoO
4
trong 20 ml n-
ớc nóng. Sau khi để nguội thêm vào 20 ml HCl và 160 ml nớc.
3. Các bớc tiến hành

Dùng đũa thuỷ tinh ép cuống lá trên lam kính để lấy dịch tế bào, sau
đó nhỏ vào dịch tế bào 2-3 giọt thuốc thử với ion tơng ứng. Trộn đều dịch
ép và thuốc thử. Đối với dịch ép dùng để xác định photphat, sau khi cho
thuốc thử, dùng đũa thiếc nghiền kĩ dịch và thuốc thử để dịch no clorua
thiếc. Màu của các phản ứng sẽ dần xuất hiện nh sau:
Thuốc thử Ion cần tìm Màu
Diphenilamin NO
3
-
từ xanh sáng đến xanh đen
Thuốc thử Kiec-xa-nop PO
4
---
từ lục đến lục thẫm
4. Kết luận:
Tuỳ theo màu sắc, đánh giá hàm lợng chất dinh dỡng theo cách : không có
ít trung bình nhiều.
c. Phơng pháp chẩn đoán bằng các đặc điểm bên ngoài
Sự thiếu các chất khoáng đến mức đã ảnh hởng đến các quá trình sinh lí, đ-
ợc biểu hiện ở kích thớc, hình dạng, màu sắc của lá và các bộ phận khác
của cây là sự thiếu trầm trọng và đợc biểu lộ bằng những dấu hiệu rất rõ
nét. Căn cứ vào những dấu hiệu này để chẩn đoán sự thiếu dinh dỡng
14
khoáng là chính xác nhất và đã đợc nghiên cứu rất kĩ, thậm chí đã xác định
các dấu hiệu cho từng cây và cho từng nguyên tố khoáng.
Sau đây là các bài thực hành về nhận biết dấu hiệu ở một số cây khi thiếu
các nguyên tố dinh dỡng khoáng
Bài thực hành 7
1. Nhận biết và mô tả các dấu hiệu thiếu các nguyên tố khoáng ở các
cây cam, chanh

- XXV thiếu nitơ
15
- XXVI thiÕu kali
16
- XXVII thiÕu Fe
17
- XXVIII thiÕu Mg
18
- XXIX thiÕu kali thÓ hiÖn ë qu¶
19
- XXX thiÕu Mn
20
- XXXI thiÕu Zn thÓ hiÖn ë cµnh
21
- XXXII thiÕu Zn
2. NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶
22
Bài thực hành 8
1. Nhận biết và mô tả các dấu hiệu thiếu các nguyên tố khoáng ở
cây dứa
- XXXIII Cây dứa bình thờng, đủ dinh dỡng khoáng
23
- XXXIV thiÕu nit¬
24
- XXXV thiÕu photpho
25